王瑛瑩，朱向蕾，周立晨

(上海動(dòng)物園, 上海 長(zhǎng)寧 200335)

白臀長(zhǎng)尾猴(Cercopithecusneglectus)屬靈長(zhǎng)目(Primates)、猴科(Cercopithecidae)、長(zhǎng)尾猴屬(Cercopithecus)，是20多種舊大陸猴中的一種，屬野生珍稀物種。國(guó)內(nèi)外資料文獻(xiàn)關(guān)于白臀長(zhǎng)尾猴的研究主要集中于飼養(yǎng)、繁殖和行為學(xué)等方面[1-2]，相關(guān)的血液學(xué)方面的研究較少，尚無(wú)血常規(guī)檢測(cè)指標(biāo)的相關(guān)資料。為進(jìn)一步了解人工圈養(yǎng)條件下這一野生珍稀物種的生理學(xué)特點(diǎn)及生物學(xué)特性，本試驗(yàn)以圈養(yǎng)的9只成年白臀長(zhǎng)尾猴為研究對(duì)象，用兩種方法測(cè)定其血常規(guī)指標(biāo)并進(jìn)行對(duì)比分析 ； 同時(shí)，以人工顯微鏡檢法測(cè)得數(shù)據(jù)為參照標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)全自動(dòng)血液分析儀和人工顯微鏡檢法檢測(cè)白臀長(zhǎng)尾猴血細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，探討兩者之間的差異性，為拓展白臀長(zhǎng)尾猴血液生理指標(biāo)的測(cè)定方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 血液樣本 采自上海動(dòng)物園圈養(yǎng)白臀長(zhǎng)尾猴的血液樣本共9份，全部為成年健康個(gè)體，其中雌猴3只，雄猴6只。收集到血樣置于 EDTA-K2真空抗凝管中輕輕顛倒混勻，室溫條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 檢驗(yàn)方法

1.2.1 儀器與人工計(jì)數(shù)穩(wěn)定性 本實(shí)驗(yàn)室的儀器檢測(cè)和人工計(jì)數(shù)檢測(cè)兩種方法穩(wěn)定可靠，筆者之前采用較為成熟的金絲猴(Rhinopithecus)血液樣本為對(duì)象對(duì)兩種方法做過(guò)驗(yàn)證，經(jīng)驗(yàn)證，儀器法和手工計(jì)數(shù)穩(wěn)定可靠[3]。

1.2.2 人工鏡檢計(jì)數(shù) 取血液樣品20 μL，加入2%冰醋酸380 μL，稀釋樣品并破壞紅細(xì)胞，混勻，持續(xù)振蕩5 min，取適量混勻液滴入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，顯微鏡下計(jì)數(shù)4個(gè)大方格內(nèi)白細(xì)胞總數(shù)n，則白細(xì)胞數(shù)量為(n/20)× 109個(gè)/L；取血液樣品20 μL，加入0.9%NaCl溶液3 980 μL，稀釋血細(xì)胞，充分混勻后取適量滴入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，顯微鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)中方格內(nèi)紅細(xì)胞總數(shù)m，則紅細(xì)胞數(shù)量為(m/100)×1012個(gè)/L。取3 μL血液制成6 cm×2.5 cm血涂片，用瑞氏-吉姆薩染液染色后用低倍鏡觀察血涂片的細(xì)胞分布情況，選擇血涂片體尾交界染色良好處，用油鏡計(jì)數(shù)100個(gè)白細(xì)胞進(jìn)行白細(xì)胞分類[4]。檢測(cè)環(huán)境溫度為25 ℃左右。

1.2.3 儀器檢驗(yàn) 采用邁瑞B(yǎng)C-5000Vet 獸用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)進(jìn)行白臀長(zhǎng)尾猴血常規(guī)儀器檢測(cè)。嚴(yán)格按照血細(xì)胞分析儀的要求定期對(duì)血液分析儀進(jìn)行校準(zhǔn)，操作步驟嚴(yán)格按照儀器的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行，并記錄好分析結(jié)果是否異常。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，對(duì)測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)(樣本量不足50，采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn))。對(duì)應(yīng)的人工計(jì)數(shù)和儀器計(jì)數(shù)兩組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)應(yīng)用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)比較差異性，兩組中只要有一組不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)應(yīng)用非參數(shù)檢驗(yàn)(兩個(gè)相關(guān)樣本：Wilcoxon帶符號(hào)秩檢驗(yàn))比較差異性。采用Spass和Excel做相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人工法和儀器法檢測(cè)白臀長(zhǎng)尾猴血常規(guī) 白臀長(zhǎng)尾猴的血液樣本分別用人工鏡檢和全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀進(jìn)行檢測(cè)，每次檢測(cè)前都要輕輕顛倒搖勻血液樣本。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

表1 白臀長(zhǎng)尾猴血常規(guī)人工檢測(cè)結(jié)果Table 1 Complete blood count of Cercopithecus neglectus by manual method

表2 白臀長(zhǎng)尾猴血常規(guī)儀器檢測(cè)結(jié)果Table 2 Complete blood count of Cercopithecus neglectus detected by instrument method

2.2 儀器法與人工鏡檢法檢測(cè)白臀長(zhǎng)尾猴血細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 兩種方法檢測(cè)白細(xì)胞、紅細(xì)胞密度差異均不顯著(配對(duì)t檢驗(yàn)，P>0.05)(表3)。表明儀器法與人工鏡檢法應(yīng)用于白臀長(zhǎng)尾猴白細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量分析結(jié)果基本一致。白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)中中性粒細(xì)胞比率差異不顯著(配對(duì)t檢驗(yàn)，P>0.05)，淋巴細(xì)胞比率(配對(duì)t檢驗(yàn))、嗜堿性粒細(xì)胞比率(配對(duì)t檢驗(yàn))、單核細(xì)胞比率(Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn))、嗜酸性粒細(xì)胞比率(Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn))組間結(jié)果具有顯著性差異。表明應(yīng)用儀器快速檢測(cè)白臀長(zhǎng)尾猴外周血白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果不理想。

表3 人工鏡檢和儀器檢測(cè)血常規(guī)指標(biāo)統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 3 Statistical results of complete blood count detected by manual and instrument detection

2.3 儀器法與人工鏡檢法檢測(cè)白臀長(zhǎng)尾猴血細(xì)胞結(jié)果相關(guān)性分析 為了驗(yàn)證儀器法是否可以代替人工計(jì)數(shù)法用于白臀長(zhǎng)尾猴血細(xì)胞快速準(zhǔn)確分析，對(duì)兩種計(jì)數(shù)方法進(jìn)行相關(guān)性分析。兩種檢測(cè)方法的主要線性回歸參數(shù)見(jiàn)圖1。白細(xì)胞、紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞比率、中性粒細(xì)胞比率人工鏡檢法和自動(dòng)分析儀檢測(cè)法兩種方法具有極強(qiáng)相關(guān)性。兩種方法檢測(cè)血紅蛋白結(jié)果呈現(xiàn)強(qiáng)相關(guān)性。單核細(xì)胞比率兩種檢測(cè)方法結(jié)果呈中等程度相關(guān)。

圖1 儀器法與人工鏡檢法檢測(cè)結(jié)果線性相關(guān)分析Fig.1 Linear correlation analysis between the results of instrument and manual detectionA:白細(xì)胞計(jì)數(shù)； B: 紅細(xì)胞計(jì)數(shù)； C: 血紅蛋白含量； D: 紅細(xì)胞壓積； E: 淋巴細(xì)胞比率； F: 單核細(xì)胞比率； G: 中性粒細(xì)胞比率A: Leukocyte count; B: Red blood cell count; C: Hemoglobin content; D: Hematocrit; E: Lymphocyte ratio; F: Monocyte ratio; G: Neutrophil ratio

3 討論

血液生理常值是反映機(jī)體狀況的主要指標(biāo),也是疾病診斷和監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)之一[5]。目前，尚未有針對(duì)白臀長(zhǎng)尾猴血液生理特性方面的研究，展開(kāi)其血液生理指標(biāo)方面的基礎(chǔ)研究和探索，將對(duì)其飼養(yǎng)繁殖、健康狀況監(jiān)控、血液學(xué)特性研究、生長(zhǎng)代謝等方面具有重要的意義。同時(shí)為動(dòng)物園野生動(dòng)物血液生理生化參考值數(shù)據(jù)庫(kù)的建立提供補(bǔ)充，進(jìn)而全面提升動(dòng)物園在珍稀瀕危物種保護(hù)工作中的作用。

本試驗(yàn)利用儀器法和人工鏡檢法兩種方法測(cè)定的雄性白臀長(zhǎng)尾猴的白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白等血液生理指標(biāo)均略高于雌性，這與同為舊大陸猴的食蟹猴[6]、獼猴[7]血液生理三項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果一致。代解杰等、周建華等測(cè)定的獼猴三項(xiàng)指標(biāo)則雌性略高于雄性[8-9]，出現(xiàn)這些差異的原因,可能在于動(dòng)物血液生理生化指標(biāo)雖反映了機(jī)體狀況,但指標(biāo)的測(cè)定不僅受到動(dòng)物年齡、性別、生理狀態(tài)、生活環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)水平的影響,還受到測(cè)定方法以及動(dòng)物的采食、捕捉時(shí)劇烈運(yùn)動(dòng)、應(yīng)激等多種因素的影響[10]。本試驗(yàn)中兩種方法測(cè)定白臀長(zhǎng)尾猴雌雄生理指標(biāo)紅細(xì)胞分布寬度-CV有顯著差異，其他值均無(wú)顯著差異。本試驗(yàn)對(duì)圈養(yǎng)白臀長(zhǎng)尾猴的血液生理指標(biāo)進(jìn)行了初步探索,但鑒于動(dòng)物個(gè)體數(shù)量有限，關(guān)于白臀長(zhǎng)尾猴的血液生理指標(biāo)參考值尚需進(jìn)一步完善，盡管如此，本試驗(yàn)提供的相關(guān)血液生理指標(biāo)為進(jìn)一步制定和完善白臀長(zhǎng)尾猴的血液生理指標(biāo)提供重要參考。

血細(xì)胞分析儀在野生動(dòng)物疾病的診斷中有重要的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)提高診斷效率以及準(zhǔn)確率，為病患爭(zhēng)取治療時(shí)間有積極意義，同時(shí)，儀器法較人工鏡檢具有更好的穩(wěn)定性和重復(fù)性[11]，因此，探索全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)白臀長(zhǎng)尾猴血常規(guī)的可行性具有十分重要的意義。邁瑞B(yǎng)C-5000Vet全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀目前有犬、貓、猴、羊、牛等檢測(cè)通道，猴的檢測(cè)通道是以獼猴為模型設(shè)置儀器參數(shù)及參考值，依據(jù)白臀長(zhǎng)尾猴的種屬，本試驗(yàn)白臀長(zhǎng)尾猴血液檢測(cè)通道選擇猴(Primates)。把人工計(jì)數(shù)作為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，分析兩種方法計(jì)數(shù)結(jié)果的差異和相關(guān)性，來(lái)判定全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀檢測(cè)白臀長(zhǎng)尾猴血常規(guī)的可行性。兩種檢測(cè)方法測(cè)定的白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白含量結(jié)果無(wú)顯著差異，且表現(xiàn)出較強(qiáng)的相關(guān)性，表明儀器法與人工法應(yīng)用于白臀長(zhǎng)尾猴白細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量分析結(jié)果基本一致。進(jìn)一步對(duì)白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)只有中性粒細(xì)胞比率兩者差異不顯著且具有極強(qiáng)相關(guān)性，而淋巴細(xì)胞比率、單核細(xì)胞比率、嗜酸性粒細(xì)胞比率、嗜堿性粒細(xì)胞比率兩種方法表現(xiàn)出顯著差異(P<0.05)，表明以當(dāng)前實(shí)驗(yàn)條件和參數(shù)設(shè)置條件下，全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀不能很好反應(yīng)白細(xì)胞中淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的占比。

臨床上，血細(xì)胞分析儀在進(jìn)行全血細(xì)胞分析以及白細(xì)胞分類時(shí)，會(huì)存在一定的假陽(yáng)性，容易導(dǎo)致臨床誤診，在準(zhǔn)確、詳細(xì)識(shí)別白細(xì)胞的形態(tài)，特別是的重要組成部分。我院編寫(xiě)了《馬場(chǎng)實(shí)習(xí)手冊(cè)》，用以規(guī)范教學(xué)目標(biāo)、培養(yǎng)計(jì)劃和考核方式。專門(mén)指定有核紅細(xì)胞、單核細(xì)胞、異形淋巴細(xì)胞、原始細(xì)胞以及幼稚細(xì)胞的形態(tài)方面仍存在缺陷[12]。此外，很多幼齡動(dòng)物造血功能相當(dāng)?shù)幕钴S，造成外周血中常見(jiàn)多種幼稚細(xì)胞，如有核紅細(xì)胞、中、晚幼粒細(xì)胞等，這些幼稚細(xì)胞往往儀器分析結(jié)果造成較大干擾，以使儀器不能對(duì)它們進(jìn)行正確的分類。如果過(guò)度依賴儀器檢測(cè)的結(jié)果從此忽略了白細(xì)胞人工顯微鏡檢查，可能會(huì)造成疾病的誤診和漏診，導(dǎo)致不合理的治療[13]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀在白臀長(zhǎng)尾猴的紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血紅蛋白檢測(cè)中效果較為理想，針對(duì)白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)需聯(lián)合血涂片進(jìn)行鏡檢，以保證檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性。