劉 林，林夢(mèng)舟，唐 寅，朱 飛，張家勇，徐建生，程 旭

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 江蘇省動(dòng)物重要疾病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009 ；2.江蘇省漣水縣畜牧獸醫(yī)站，江蘇 淮安 223400 ； 3.江蘇省泰興市分界獸醫(yī)站，江蘇 泰州 225400 ； 4.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，江蘇 揚(yáng)州 225125)

禽白血病病毒(Avian leukemia virus,ALV)共10個(gè)亞群，其中A、B、C、D、E、J亞群存在雞群中。A、B、J亞群為感染雞的主要外源性病毒，E亞群為內(nèi)源性病毒，致病力較弱或無(wú)致病性[1]。主要侵害肉種雞的為J亞群ALV(ALV-J)，經(jīng)常導(dǎo)致生產(chǎn)能力下降和死亡，給肉種雞場(chǎng)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。禽戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus,HEV)最早于1980年在澳大利亞發(fā)現(xiàn)，可引起雞的肝脾炎癥[2]。在我國(guó)也稱大肝大脾病，所有年齡段的雞都對(duì)該病毒敏感，通常在雞的成熟期發(fā)病。HEV常導(dǎo)致肉種雞雞群死亡率上升，極大威脅了肉種雞業(yè)的發(fā)展。本試驗(yàn)首次在肉種雞群中發(fā)現(xiàn)了ALV-J和HEV存在混合感染現(xiàn)象，對(duì)今后該類疾病診療有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源 江蘇某肉種雞場(chǎng)10只發(fā)病雞。5只 雞肝、脾樣品分別編號(hào)為1-1、1-2、2-1、2-2、3-1、3-2、4-1、4-2、5-1、5-2；其他5只雞肝臟混裝后分為3份， 編號(hào)為6-1、6-2、6-3；其脾臟混合后分為3份，編號(hào)為7-1、7-2、7-3。

1.2 主要試劑 Multisource Total RNA Miniprep Kit 50-prep試劑盒，購(gòu)自美國(guó)AXYGEN公司;PrimeScriptTMⅡ1 st Strand cDNA Synthesis Kit，購(gòu)自TaKaRa公司；GreenTaqTMMix，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 剖檢 對(duì)病死雞的病變器官和組織進(jìn)行觀察，記錄其特征性病理變化。

1.4 病料采集 病死雞出現(xiàn)病變的肝臟和脾臟組織，制備組織切片并進(jìn)行H.E.染色。

1.5 總RNA提取及cDNA的合成 RNA用Multisource Total RNA Miniprep Kit 50-prep試劑盒提取，cDNA采用PrimeScriptTMⅡ1 st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成。

1.6 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)文獻(xiàn)[3-5]分別設(shè)計(jì)ALV和HEV擴(kuò)增的特異性引物(表1)。

表1 禽ALV和HEV的PCR引物Table 1 PCR primers of avian leukosis virus and avian hepatitis E virus

1.7 ALV-J的RT-PCR與HEV套式RT-PCR反應(yīng)體系的建立 用以上特異性引物，以1.5中提取的cDNA為模板分別建立ALV-J和HEV的RT-PCR反應(yīng)體系。HEV第2輪擴(kuò)增取第1輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行20倍稀釋，取稀釋后的1 μL作為第2輪PCR反應(yīng)模板。

2 結(jié)果

2.1 剖檢病變觀察 病死雞肝臟明顯腫大，是正常雞只的2～3倍，肝臟表面出現(xiàn)大小不一的腫瘤結(jié)節(jié)和灰白色壞死灶；脾臟腫大淤血，腎臟表面出現(xiàn)灰白色腫瘤結(jié)節(jié)(圖1)。

圖1 解剖病理圖Fig.1 Anatomical and pathological imagesA：肝臟； B：腎臟A：Liver; B：Kidney

2.2 病理組織學(xué)觀察 組織染色切片可見(jiàn)雞肝臟出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞出現(xiàn)壞死、淤血和脂肪變性；脾臟出現(xiàn)淋巴細(xì)胞壞死，結(jié)締組織增生(圖2)。

圖2 肝脾組織病變(H.E.染色，40×)Fig.2 Pathological changes in liver and spleen (H.E.staining, 40×)A：脾臟； B：肝臟； C: 肝臟； D:脾臟A：Spleen; B：Liver; C: Liver; D: Spleen

2.3 ALV-J的RT-PCR檢測(cè) 對(duì)病死雞的肝、脾組織中提取合成的cDNA進(jìn)行ALV-J的RT-PCR檢測(cè)并設(shè)置陰性對(duì)照。除1-1肝和3-2脾，其余均能擴(kuò)增出大小為500 bp左右的目的條帶，表明為ALV-J陽(yáng)性(圖3)。

圖3 ALV-J的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.3 RT-PCR results of ALV-JM：1kb marker； 1：陽(yáng)性對(duì)照； 2～16：檢測(cè)樣品； 17：陰性對(duì)照M: 1kb marker； 1: Positive control； 2-16: Test sample； 17: Negative control

2.4 HEV的RT-PCR檢測(cè) 隨機(jī)選取4份cDNA模板，利用HEV的套式PCR進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均能擴(kuò)增出250 bp左右的目的條帶，表明為HEV陽(yáng)性(圖4)。

圖4 HEV的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.4 RT-PCR results of HEVM:DNA marker V； 1～4:檢測(cè)樣品M: DNA marker V；1-4: Test sample

3 討論

由于我國(guó)家禽產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，肉雞養(yǎng)殖業(yè)逐步實(shí)現(xiàn)規(guī)?；?、標(biāo)準(zhǔn)化。這一改變雖然提高了企業(yè)效益，但因?yàn)殡u群密度的提高，加速了雞群疾病的傳播和發(fā)展，我國(guó)肉雞疫病也向多樣化、復(fù)雜化發(fā)展，復(fù)合感染是其中最嚴(yán)重的問(wèn)題。

ALV會(huì)引起肉種雞的多種腫瘤性疾病，臨診上多表現(xiàn)為產(chǎn)蛋下降和雞群死亡率上升，其中主要侵害肉種雞的為ALV-J。對(duì)于ALV主要采取凈化淘汰，雖然我國(guó)白羽肉雞ALV凈化成效顯著，但還是偶有發(fā)生。HEV常引起雞的肝脾炎癥，又稱之為大肝大脾病。趙翼楠對(duì)我國(guó)12個(gè)省市自治區(qū)38個(gè)種雞場(chǎng)的5 755份血清HEV抗體調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其陽(yáng)性率達(dá)到43.39%[6]，提示該病毒在中國(guó)存在廣泛流行。李海琴等在發(fā)病蛋雞上發(fā)現(xiàn)了江西首例HEV感染病例[7]。目前HEV還沒(méi)有疫苗可供使用，也沒(méi)有有效的治療方法。臨床常見(jiàn)ALV與馬立克病病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒、雞傳染性貧血病毒的混合感染[8-9]，ALV與HEV共感染的報(bào)道很少，Sun等首次報(bào)道了在我國(guó)蛋雞上出現(xiàn)的ALV-J和HEV混合感染[10]，本試驗(yàn)首次在自然感染發(fā)病的肉種雞中檢測(cè)到ALV-J和HEV的混合感染。

由于ALV-J和HEV在感染肉種雞時(shí)的臨診表現(xiàn)上相似，因此在臨床上應(yīng)注意兩者的混合感染。本試驗(yàn)通過(guò)剖檢病變、病理組織學(xué)以及RT-PCR檢測(cè)對(duì)病死雞進(jìn)行診斷，成功檢測(cè)出該雞群存在HEV和ALV-J感染，為該種雞場(chǎng)治療方案提供了依據(jù)，也為診斷禽白血病病毒和戊型肝炎病毒的混合感染提供了試驗(yàn)方案。