趙嬋娟，何先林，, 鄢行安，肖國生，曹立亭, 韓 凱

(1. 重慶三峽職業(yè)學院動物科技學院，重慶 萬州 404155 ； 2. 西南大學動物醫(yī)學院，重慶 榮昌 400700 ；3. 重慶三峽學院生物與食品工程學院，重慶 萬州 404155 ； 4. 湖北遠昊生物科技有限公司，湖北 鐘祥 431900)

腹瀉是造成全球死亡數(shù)量最高的十大疾患之一，以腹瀉為主癥的急慢性腸炎、腸易激綜合征、胃腸功能紊亂等多種消化道疾病皆屬于中醫(yī)學的“泄瀉”范疇[1]，并認為脾虛及濕盛是其基本病機。《內(nèi)經(jīng)》有云：“脾病者，……虛則腹脹腸鳴，飧泄食不化”。一些研究表明，脾虛泄瀉主要引起胃腸黏膜組織結構的損傷[2]，并發(fā)現(xiàn)益氣健脾藥，如四君子湯、補中益氣湯、參苓白術散能促進胃腸黏膜結構損傷的修復，以及能提高脾虛泄瀉證大鼠Claudin-1、Occludin、ZO-1 mRNA表達[3]。本試驗為研究“苓術止瀉口服液”對脾氣虛泄瀉大鼠腸組織結構屏障的影響，以期為進一步闡明“苓術止瀉口服液”胃腸道藥理作用機制提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60只健康SD大鼠，體質量(200±20) g，雌雄各半，9周齡，購自湖南斯萊克景達公司，動物合格證書SCXK(湘)2019—0004。購回的動物飼養(yǎng)于重慶三峽職業(yè)學院藥學專業(yè)動物中心，環(huán)境溫度(22±2)℃，通風良好，室內(nèi)明暗各保持12 h，適應性喂養(yǎng)7 d，試驗前12 h保持禁食不禁水。

1.2 試驗藥物 番瀉葉、茯苓、白術等生藥飲片，購自重慶萬州東方大藥房，經(jīng)重慶三峽職業(yè)學院具有中藥鑒定師資格的教師鑒定合格。苓術止瀉口服液由重慶三峽職業(yè)學院藥學專業(yè)教研室制備，濃度為1 g/mL。

造模藥液：按厚樸90 g、枳實90 g、大黃60 g稱取藥材，純凈水浸泡30 min，厚樸和枳實先煎煮10 min，大黃后下，再煎煮10 min，過濾除渣，重復煎煮2次，60 ℃常規(guī)濃縮為1 g/mL藥液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

陽性對照藥物參苓白術散水煎劑：人參100 g、麩炒白術100 g、炒白扁豆75 g、山藥100 g、茯苓100 g、蓮子50 g、桔梗50 g、砂仁50 g、炒薏苡仁50 g、甘草100 g稱取各中藥飲片，浸泡25 min后常規(guī)煎煮，連續(xù)2次，過濾去渣，60 ℃常規(guī)濃縮為1 g/mL藥液，4 ℃ 保存?zhèn)溆肹4]。

1.3 主要試劑與儀器 H.E.染色試劑盒(Solarloio，20190815)；TriQuick Reagent總RNA提取試劑(Solarbio，20190913)；2×EsTaqMaster Mix(康為世紀公司，50428)；HiFiScript gDNA Removal RT Master Mix(康為世紀公司，30412)；Eva Green 20×in water(Biotium，17E0.1-1075001)；大鼠二胺氧化酶(DAO) ELISA試劑盒(江蘇酶免實業(yè)有限公司，19082069R)；大鼠D-乳酸(D-Lactate，D-LA)ELISA試劑盒(江蘇酶免實業(yè)有限公司，19082039R)。TProfessional PCR儀(Biometra)；MJ MiniTMPersonal Thermal Cycler(美國BID-RAD)；切片機[徠卡顯微系統(tǒng)(上海)有限公司])；凝膠成像系統(tǒng)(上海勤翔儀器公司)；超低溫冷凍離心機(賽默飛世爾生物化學制品有限公司)等。

1.4 分組及造模 60只健康SD大鼠適應性喂養(yǎng)7 d后，隨機分為空白對照組、脾虛泄瀉證病理模型組(簡稱：模型組)、苓術止瀉口服液高、中、低劑量組[40、20 g/(kg·bw)和10 g/(kg·bw)]與陽性藥物對照組。參照文獻[5]方法進行大鼠的脾虛泄瀉證模型復制，即均采用“破氣+苦下+饑飽失?！狈ǎ凑? mL/(200 g·bw)灌服造模藥液，2次/d，持續(xù)42 d。

1.5 干預方法 造模完成后次日進行干預治療?？瞻讓φ战M與模型組：按照4 mL/(200 g·bw)灌服生理鹽水。苓術止瀉口服液高、中、低劑量組：按照4 mL/(200 g·bw)對應灌服不同濃度的苓術止瀉口服液。陽性藥物對照組：按照4 mL/(200 g·bw)灌服陽性對照藥液水煎劑。1次/d，持續(xù)14 d。

1.6 標本采集與檢測

1.6.1 大鼠結腸組織病理學觀察 無菌分離結腸，置于4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋切片4 μm。H.E.染色后，光學顯微鏡下觀察組織病理學變化。

1.6.2 大鼠血清DAO和D-LA含量測定 各組大鼠末次給藥后禁食禁水24 h，麻醉后腹主動脈采血。血樣于4 ℃冰箱靜置2 h，3 000 r/min 離心15 min取上清液，采用酶聯(lián)免疫法檢測血清中DAO和D-LA的水平。

1.6.3 大鼠結腸緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1表達量的檢測 使用TriQuick Reagent試劑提取法抽提結腸組織中的總RNA，HiFiScriPt gDNA Removal RT Master Mix試劑盒進行RNA的純化與反轉錄合成cDNA，取1 μL gDNA Remover Mix，一定量RNA Template 和適量RNase-free Water建立10 μL cDNA第1鏈的合成體系。再取cDNA第1鏈的合成體系10 μL，5×HiFiScriPt RT Master 4 μL，RNase-Free Water 6 μL，建立逆轉錄反應體系。cDNA合成反應條件：37 ℃孵育15 min，85 ℃孵育5 s。反應結束后，短暫離心后放置于冰上，再進行后續(xù)反應或放于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將反轉錄得到的cDNA 進行熒光定量PCR，以GAPDH基因作為內(nèi)參基因，建立20 μL 熒光定量PCR反應體系：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性30 s，50～65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。定量采用2-△△Ct法計算。目的基因和引物見表1，PCR反應體系見表2。

表1 Real-time PCR引物Table 1 Primers for real-time PCR

表2 Real-time PCR 反應體系Table 2 Reaction system for real-time PCR

2 結果

2.1 中藥苓術止瀉口服液對脾虛泄瀉大鼠結腸黏膜形態(tài)的影響 大鼠結腸切片顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空白對照組大鼠結腸黏膜上皮完整，黏膜層單層柱狀上皮細胞排列整齊，刷狀緣清晰可見，有大量杯狀細胞，未見或少見炎性細胞浸潤(圖1A)；模型組大鼠黏膜上皮細胞壞死、脫落，其形態(tài)結構完整性被破壞，細胞排列紊亂，結腸黏膜層可見炎性細胞浸潤，杯狀細胞減少(圖1B)；苓術止瀉口服液高、中、低劑量組，以及陽性藥物對照組大鼠結腸黏膜出現(xiàn)上皮再生，其形態(tài)結構完整性得到恢復，細胞排列連續(xù)性好、規(guī)則有序，炎性細胞浸潤明顯減少(圖1C～1F)。結果表明，苓術止瀉口服液能有效修復脾虛泄瀉大鼠結腸黏膜結構。

圖1 苓術止瀉口服液對脾虛泄瀉證大鼠結腸黏膜組織形態(tài)的影響(H.E.染色，100×)Fig.1 Effects of Lingzhu Zhixie oral liquid on the morphology of colonic mucosa in rats with splenasthenic diarrhea (H.E. staining,100×)A:空白對照組; B:模型組; C:陽性藥物對照組; D:苓術止瀉口服液高劑量組; E:苓術止瀉口服液中劑量組; F:苓術止瀉口服液低劑量組A:Blank control group; B:Model group; C:Positive drug control group; D:Lingzhu Zhixie oral liquid high-dose group; E:Lingzhu Zhixie oral liquid medium-dose group; F:Lingzhu zhixie oral liquid low-dose group

2.2 苓術止瀉口服液對脾虛泄瀉大鼠血清中DAO和D-LA含量的影響 與空白對照組比較，模型組大鼠血清中DOA和D-LA含量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，苓術止瀉口服液高、中、低劑量組和陽性藥物對照組大鼠血清中DOA和D-LA含量明顯降低(P<0.05)；與陽性藥物對照組比較，苓術止瀉口服液高、中劑量組的大鼠血清中DOA和D-LA含量差異不顯著(P>0.05)，苓術止瀉口服液低劑量組差異顯著(P<0.05)，見圖2。

圖2 苓術止瀉口服液對脾虛泄瀉大鼠血清中DAO和D-LA含量的影響Fig.2 Effects of Lingzhu Zhixie oral liquid on the levels of DAO and D-LA in sera of rats with splenasthenic diarrhea圖中所標字母不同表示差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05);下圖同Different letters in the figure indicate significant difference (P<0.05),and the same letter indicates no significant difference (P<0.05). The same as below

2.3 苓術止瀉口服液對脾虛泄瀉大鼠結腸Occludin蛋白基因的mRNA相對表達量的影響 與空白對照組比較，模型組結腸黏膜緊密連接蛋白Occludin的 mRNA表達量顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，苓術止瀉口服液高、中、低劑量組和陽性藥物對照組的大鼠結腸Occludin蛋白基因的mRNA表達量顯著升高(P<0.05)；與陽性藥物對照組比較，苓術止瀉口服液高、中、低劑量組的大鼠結腸Occludin 蛋白基因的mRNA表達量差異不顯著(P>0.05)，見圖3。

圖3 苓術止瀉口服液對脾虛泄瀉大鼠結腸Occludin蛋白mRNA相對表達量的影響Fig.3 Effects of Lingzhu Zhixie oral liquid on the mRNA relative expression of Occludin protein in rat colons with splenasthenic diarrhea

2.4 苓術止瀉口服液對脾虛泄瀉證大鼠結腸Claudin-1蛋白基因的mRNA相對表達量的影響 與空白對照組比較，模型組結腸黏膜緊密連接蛋白Claudin-1的mRNA相對表達量顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，苓術止瀉口服液組高、中、低劑量組和陽性藥物對照組大鼠結腸Claudin-1蛋白基因的mRNA表達量顯著升高(P<0.05)；與陽性藥物對照組比較，苓術止瀉口服液中劑量組大鼠結腸Claudin-1蛋白基因的mRNA表達量顯著升高(P<0.05)，而高、低劑量組則差異不顯著(P>0.05)，見圖4。

圖4 苓術止瀉口服液對脾虛泄瀉大鼠結腸Claudin-1蛋白mRNA相對表達量的影響Fig.4 Effects of Lingzhu Zhixie oral liquid on the mRNA relative expression of Claudin-1 protein in rat colons with splenasthenic diarrhea

2.5 苓術止瀉口服液對脾虛泄瀉大鼠結腸ZO-1蛋白基因的mRNA相對表達量的影響 與空白對照組相比，模型組大鼠結腸黏膜緊密連接蛋白ZO-1的mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，苓術止瀉口服液高、中、低劑量組和陽性藥物對照組大鼠結腸ZO-1蛋白基因的 mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)；與陽性藥物對照組比較，苓術止瀉口服液中劑量組大鼠結腸ZO-1蛋白基因的mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)，而高、低劑量組差異不顯著(P>0.05)，見圖5。

圖5 “苓術止瀉口服液”對脾虛泄瀉大鼠結腸ZO-1蛋白mRNA相對表達量的影響Fig.5 Effects of Lingzhu Zhixie oral liquid on the mRNA relative expression of ZO-1 protein in rat colons with splenasthenic diarrhea

3 討論

腸道上皮組織結構所形成的機械(物理)屏障是腸黏膜屏障的首道防線，對維持機體健康有著重要作用。如腸上皮組織結構的損傷則是引起腸道疾病的前提與基礎。研究發(fā)現(xiàn)，急慢性腸炎、腸易激綜合征等諸多臨床疾病均存在不同程度的腸黏膜屏障損傷[6]。研究顯示，一些中藥方劑，如參苓白術散作為中醫(yī)臨床上針對脾虛泄瀉、慢性腹瀉、功能性腹瀉等諸多臨床疾病的常用方，它具有保護腸黏膜、提高機體免疫力，以及調(diào)節(jié)腸道分泌功能與吸收功能平衡等諸多作用[7]，其分子機理則可能是參苓白術散能提高脾虛泄瀉大鼠腸黏膜免疫中的3個關鍵作用蛋白Claudin-1、Occludin、ZO-1表達，從而達到修復腸黏膜屏障損傷[8]。本試驗選用參苓白術散作為陽性對照藥物，以評價苓術止瀉口服液的治療效果和作用機制。

研究證明，當發(fā)生腸黏膜屏障被破壞、腸黏膜損傷時，腸黏膜細胞標志酶DAO和D-LA 在血液中的含量水平會升高，可間接反映出腸黏膜通透性變化及腸機械屏障損害程度[9-10]。因此，DAO和D-LA為評估腸黏膜通透性與完整性的重要指標[11-12]。同時，閉合蛋白Occludin、閉鎖蛋白Claudin-1以及連接復合物蛋白ZO-1是腸黏膜免疫中的3個關鍵蛋白。Occludin蛋白作為緊密連接的主要骨架蛋白，通過對緊密連接結構的穩(wěn)定來完成對腸黏膜通透性的調(diào)節(jié)作用[13]；作為橋梁蛋白的連接復合物蛋白ZO-1則是通過連接Occludin蛋白的末端與細胞骨架蛋白相連，以達到穩(wěn)定緊密連接結構的作用[14]；閉鎖蛋白Claudin-1通過Notch信號調(diào)節(jié)腸上皮內(nèi)穩(wěn)態(tài),其表達量可反映上皮細胞、內(nèi)皮細胞與間皮細胞的結構破壞和功能受損程度[15-16]?？梢姡琌ccludin、Claudin-1和 ZO-1蛋白及其基因表達常被用于腸機械屏障功能的關鍵性檢測標識[17]。

已有一些研究發(fā)現(xiàn)，中藥復方、中藥提取物或中藥單體皆能通過調(diào)控3個蛋白基因的表達來修復受損的腸道黏膜屏障，如郁金散、腸炎清口服液，菊非藥用部位多糖以及單體大黃素[18-19]。本試驗發(fā)現(xiàn)，苓術止瀉口服液治療后脾虛泄瀉大鼠血清中DAO、D-LA含量明顯降低，且上調(diào)了結腸中Claudin-1、Occludin和ZO-1緊密連接蛋白的基因表達，表明苓術止瀉口服液的療效與大鼠結腸上皮細胞緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1的基因表達上調(diào)有關，通過修復腸黏膜屏障的損傷，降低腸黏膜通透性，從而發(fā)揮其治療作用。