李國秋 張嘉雪 陳子錚 陳林耿 吳曉怡 張 韌

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006

胃癌(Gastric cancer, GC)是中國常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)2018年2月國家癌癥中心發(fā)布的最新一期全國癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，GC的發(fā)病率和死亡率分列所有腫瘤類型的第2位與第3位[1]。近年來，GC的發(fā)病率呈下降趨勢，新型生物制劑的研發(fā)和綜合治療策略的不斷發(fā)展，降低了GC的致死率，但GC的預(yù)后仍然不甚樂觀。中醫(yī)在控制癌癥病灶發(fā)展，延長患者生存期和改善生存質(zhì)量等方面表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢，尤其是中藥可提高人體免疫，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的各組分，在腫瘤防治方面具有重要作用[2]。

白術(shù)，味苦、甘、微辛，性溫，其用在中，主嘔逆泄利、去濕強(qiáng)脾、開胃進(jìn)食、和中益氣?！侗静萃ㄐ吩唬骸鞍仔g(shù)，補(bǔ)脾胃之藥，得中宮沖和之氣，更無出其右者。土旺則能健運(yùn)，故不能食者，食停滯者，有痞積者，皆用之也。”現(xiàn)代藥理研究[3]發(fā)現(xiàn)，白術(shù)揮發(fā)油具有抗腫瘤、促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)、調(diào)節(jié)胃腸功能、促進(jìn)營養(yǎng)質(zhì)吸收的功能。茯苓，味甘，性平，主利水實(shí)脾，《神農(nóng)本草經(jīng)疏》記載：“中焦者，脾土之所治也。中焦不治故見膈中瘀水，腹脹大也，利水實(shí)脾，則其證自退矣?！爆F(xiàn)代藥理研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，茯苓中的多糖和三萜類成分可保護(hù)機(jī)體的免疫器官，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制胃癌細(xì)胞生長，抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，清除氧自由基。據(jù)目前相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[6]，“白術(shù)-茯苓”藥對抗GC的臨床療效顯著，但其具體作用機(jī)制尚未見系統(tǒng)闡明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，采用復(fù)雜的生物網(wǎng)絡(luò)模型，從藥物、化學(xué)成分、靶點(diǎn)、疾病間相互作用的整體性與系統(tǒng)性出發(fā)，預(yù)測藥物治療疾病的藥理學(xué)機(jī)制的一種方法，其與中醫(yī)治病的“整體觀”理論及中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑、多作用的特點(diǎn)具有一致性[7- 8]。故本研究將運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討“白術(shù)-茯苓”藥對抗GC的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 “茯苓-白術(shù)”藥對藥物成分獲取 中醫(yī)藥百科全書(The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine，ETCM)是由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所、中藥資源中心、北京大學(xué)中藥學(xué)院等大型單位打造的中醫(yī)藥數(shù)據(jù)平臺(tái)，該平臺(tái)收錄了403味中藥，7274個(gè)中藥成分等數(shù)據(jù)信息，為中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究提供了強(qiáng)有力的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和分析平臺(tái)[9]。

運(yùn)用ETCM(ETCM, http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/)檢索“白術(shù)”和“茯苓”兩者的藥物成分，同時(shí)記錄各成分對應(yīng)的“Pubchem ID”和“Canonical SMILES”。

1.2 “茯苓-白術(shù)”藥對藥物成分對應(yīng)靶點(diǎn)獲取 通過Swiss Target Prediction平臺(tái)(http: //www.swisstargetprediction.ch /) 輸入1.1獲得化合物成分的的“Canonical SMILES”格式，預(yù)測“茯苓-白術(shù)”藥對藥物成分對應(yīng)的作用靶點(diǎn)。

1.3 “茯苓-白術(shù)”藥對抗GC的相關(guān)靶點(diǎn)收集 在Genecard數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)、Pharmgkb數(shù)據(jù)庫(https://www.pharmgkb.org/)、TTD數(shù)據(jù)庫(http://db.idrblab.net/ttd/)、Drug bank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca/)輸入“gastric carcinoma”檢索GC相關(guān)的靶點(diǎn)，刪除其中重復(fù)的基因。將獲得的疾病靶點(diǎn)與1.2獲得的成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行比對，最后獲得“茯苓-白術(shù)”藥對抗GC的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 “茯苓-白術(shù)”藥對抗GC的潛在作用靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)(Protein Protein interaction，PPI)構(gòu)建 在string數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，輸入“茯苓-白術(shù)”藥對抗GC的潛在作用靶點(diǎn)，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為“medium confidence”，其余參數(shù)保持默認(rèn)，獲取靶蛋白相互作用數(shù)據(jù)，通過Cytoscape 3.2.1軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選degree值排名前10的靶點(diǎn)。

1.5 KEGG通路富集分析 利用Metascape數(shù)據(jù)庫(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1) 對“茯苓-白術(shù)”藥對抗GC相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)合P值，從小到大排序，篩選出前10條通路，導(dǎo)出csv文件，對數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 “茯苓-白術(shù)”藥對藥物成分收集 通過ETCM數(shù)據(jù)庫，一共獲得38個(gè)化學(xué)成分，其中白術(shù)14個(gè)、茯苓24個(gè)，見表1。

表1 “茯苓-白術(shù)”藥對藥物成分信息

2.2 “茯苓-白術(shù)”藥對抗GC相關(guān)靶點(diǎn) 通過Swiss Target Prediction平臺(tái)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)后得到69個(gè)“茯苓-白術(shù)”藥對藥物成分的作用靶點(diǎn)，接著將這 69個(gè)靶點(diǎn)與Genecard、OMIM、Pharmgkb、TTD，和Drug Bank 5個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫收集到的GC相關(guān)基因靶點(diǎn)進(jìn)行比對，最終得到62個(gè)“茯苓-白術(shù)”藥對抗GC的相關(guān)靶蛋白，見表2。

表2 茯苓-白術(shù)”藥對抗GC的62個(gè)靶蛋白

2.3 “茯苓-白術(shù)”藥對抗GC的潛在作用靶點(diǎn)PPI分析 基于Sring數(shù)據(jù)庫的62個(gè)靶蛋白的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)，采用Cytoscape 3.2.1軟件繪制靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖，如圖1所示。此網(wǎng)絡(luò)共包括57個(gè)節(jié)點(diǎn)，143條邊(若兩個(gè)靶蛋白之間存在相互作用關(guān)系，則用邊連接兩個(gè)靶蛋白)，靶蛋白degree值越大則節(jié)點(diǎn)越大。

圖1 “茯苓-白術(shù)”藥對抗GC靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)

同時(shí)利用Cytoscape 3.2.1軟件的篩選工具，篩選出該網(wǎng)絡(luò)中degree值排名前10 的靶蛋白，分別為TNF、CYP19A1、AR、PPARG、AKR1C3、NR3C1、CYP17A1、HSD17B3、PTGS1、SRD5A1。

2.4 KEGG通路富集分析 采用Metascape平臺(tái)對“茯苓-白術(shù)”藥對抗GC的62 個(gè)作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，篩選前10條目(P值從小到大進(jìn)行排序)，并且通過Excel對結(jié)果進(jìn)行可視化處理。結(jié)果如圖2所示。主要通路有Steroid hormone biosynthesis、PPAR signaling pathway、Neuroactive ligand-receptor interaction、Arachidonic acid metabolism、Nitrogen metabolism、Chemical carcinogenesis、Pathways in cancer insulin resistance、Regulation of lipolysis in adipocytes、Leishmaniasis。

圖2 “茯苓-白術(shù)”藥對抗GC的KEGG通路富集分析

3 討論

3.1 “白術(shù)-茯苓”藥對抗GC相關(guān)的重要藥物成分 本研究最終預(yù)測得到“白術(shù)-茯苓”藥對抗GC的38個(gè)活性化合物、62個(gè)潛在作用靶點(diǎn)及10條通路，其化合物多樣性、作用靶點(diǎn)多樣性及通路多樣性，從藥理層面及分子層面論證了中藥“同病異治，異病同治”原則。

現(xiàn)代藥理研究[10]證實(shí)，白術(shù)化學(xué)成分主要為揮發(fā)油、白術(shù)多糖、氨基酸等成分，這些化學(xué)成分有抗炎、抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力、抗衰老、調(diào)節(jié)胃腸等藥理作用，茯苓中具有生物活性的化合物主要為三萜類和多糖類化合物，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)記憶力、調(diào)節(jié)泌尿系統(tǒng)、降血糖等[11]。本研究中，白術(shù)-茯苓藥對篩選出的化合物含多種抗癌成分，如白術(shù)內(nèi)脂I、白術(shù)內(nèi)脂III、茯苓酸等，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ能夠抑制MGC-803細(xì)胞的生長及繁殖，下調(diào)GC細(xì)胞表面標(biāo)志物Hey1、CD44的表達(dá)，同時(shí)也包括抑制Notch信號(hào)通路，及降低Notch1、Hes1、Hey1和Jagged1蛋白的活性，從而有效地抑制GCMGC-803細(xì)胞的增殖[12]。茯苓酸能抑制GC細(xì)胞的生長和克隆形成能力，顯著誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M期停滯及細(xì)胞凋亡，同時(shí)調(diào)節(jié)一些凋亡相關(guān)蛋白如caspase-3,PARP, Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)，還能擾亂體外GC線粒體能力和抑制體內(nèi)GC移植瘤生長。

3.2 “白術(shù)-茯苓”藥對抗GC相關(guān)的重要作用靶點(diǎn) 在“白術(shù)-茯苓”藥對抗GC的PPI網(wǎng)絡(luò)中，TNF、CYP19A1、AR、PPARG、AKR1C3、NR3C1、CYP17A1、HSD17B3、PTGS1、SRD5A1在網(wǎng)絡(luò)中處于degree值前10名，是“白術(shù)-茯苓”藥對抗GC的重要潛在靶點(diǎn)。腫瘤壞死因子(TNF)分為兩種，分別為TNF-α和TNF-β，國外研究報(bào)道，GC患者血清中TNF-α水平明顯高于正常人群，手術(shù)切除GC組織后患者體內(nèi)血清中TNF-α水平明顯下降，但轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)者血清TNF-α水平再度顯著升高，該現(xiàn)象提示TNF-α與GC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)且起到促進(jìn)作用[13]。毛躍鋒等[14]的研究表明參芪扶正湯能明顯降低Ⅲ～Ⅳ期GC患者血清中TNF-α、IL-6以及SIL-2R水平，與此同時(shí)亦能明顯提高患者的免疫功能，提高其生活質(zhì)量。有研究表明，雄激素受體(AR)在GC組織中高表達(dá)，且AR與年齡、性別、腫瘤大小、組織類型等均無明顯相關(guān)性。調(diào)節(jié)細(xì)胞周期諸多因素的關(guān)鍵角色是cyclinD1，而性激素可通過與其受體結(jié)合，介導(dǎo)某些直接或間接機(jī)制促進(jìn)cyclinD1過度表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，此外性激素經(jīng)過胃腸道分解和肝內(nèi)代謝可轉(zhuǎn)變成低濃度的致癌物，與受體結(jié)合時(shí)可增強(qiáng)其與細(xì)胞核內(nèi)DNA的親和力，解除對DNA合成的抑制，恢復(fù)DNA聚合酶活性，促進(jìn)細(xì)胞增殖，導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖的發(fā)生。

3.3 “白術(shù)-茯苓”藥對抗GC相關(guān)的重要生物通路 根據(jù)KEGG分析結(jié)果可知，“白術(shù)-茯苓”藥對抗GC的信號(hào)通路與“癌癥途徑(pathway in cancer)”最為相關(guān)，此外還涉及通路有“類固醇激素合成(Steroid hormone biosynthesis)”“過氧化物酶體增殖物激活受體信號(hào)通路(PPAR signaling pathway)”“神經(jīng)活性配體-受體相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)”“花生四烯酸代謝(Arachidonic acid metabolism)”“氮代謝(Nitrogen metabolism)”“化學(xué)致癌作用(Chemical carcinogenesis)”“胰島素抵抗(Insulin resistance)”“脂肪細(xì)胞中脂肪分解的調(diào)節(jié)(Regulation of lipolysis in adipocytes)”。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，在激活狀態(tài)下參與調(diào)節(jié)許多與消化道腫瘤形成有關(guān)的基因，具有抑制增殖、促進(jìn)凋亡、抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程等抗腫瘤作用，被認(rèn)為是開發(fā)預(yù)防治療GC的重要靶點(diǎn)[15]。張順榮等[16]研究發(fā)現(xiàn)，胃復(fù)方含藥血漿可通過上調(diào)PPARγ基因表達(dá)的途徑來抑制 SGC-7901 細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。有研究[17]發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗與GC的患病相關(guān)，而GC患者普遍存在糖耐量異常和胰島素抵抗，這有可能是由于GC本身癌組織通過自分泌和旁分泌途徑產(chǎn)生一些生長因子，從而產(chǎn)生和加重一胰島素抵抗。另有研究[18]認(rèn)為，高胰島素血癥可加強(qiáng)胰島素樣生長因子(IGF-1)的合成，而IGF-1能夠促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化，此外還可促進(jìn)血管內(nèi)皮生長，因此增加了細(xì)胞惡性增殖的概率，減少腫瘤細(xì)胞的凋亡。

4 結(jié)論與展望

60%的GC患者手術(shù)或化療后會(huì)在2～3年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，原因在于脫落和逃逸的腫瘤細(xì)胞會(huì)再次增殖并轉(zhuǎn)移，而化療藥物藥物對大多數(shù)腺癌缺乏敏感性，常因多藥耐藥導(dǎo)致治療失敗，或患者因無法耐受化療藥物的毒副反應(yīng)而中斷治療[19-20]。研究[21]證實(shí)，中藥治療GC具有多成分、多靶點(diǎn)、毒副作用小、防止術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等優(yōu)點(diǎn)。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選出“白術(shù)-茯苓”藥對潛在活性化合物，獲取其治療GC的潛在作用靶點(diǎn)， 從“成分-靶點(diǎn)-通路”研究藥物與疾病之間的相互作用規(guī)律，推測“白術(shù)-茯苓”藥對的藥效機(jī)理，初步闡釋了其治療GC的作用機(jī)制。但由于數(shù)據(jù)庫信息的不全面、化合物的濃度及化合物間的相互作用不明確等因素，使得預(yù)測結(jié)果有一定的局限性和片面性，需要更多的臨床試驗(yàn)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步去驗(yàn)證。