岳 磊 黃麗杰 崔燕貞 李曉靜

1.鄭州市食品藥品檢驗所，河南 鄭州 450000；2.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000

一清顆粒，作為一種臨床常用的中成藥，在《中國藥典( 2015 版) 》中規(guī)定，其處方為黃連、大黃和黃芩這三味藥材，功能與主治為清熱、瀉火、解毒、化瘀、涼血、止血[1]?，F(xiàn)行的藥典規(guī)定中，在含量測定項下使用高效液相色譜(HPLC)法，僅以黃芩苷作為目標(biāo)物進(jìn)行測定，不能有效地針對黃連及大黃進(jìn)行有效的質(zhì)量控制。近期關(guān)于一清顆粒質(zhì)量控制的研究集中在制備工藝[2]、指紋圖譜[3]、使用HPLC法檢測更多的目標(biāo)化合物[4]及針對其中大黃蒽醌類化合物的測定進(jìn)而對其進(jìn)行有效的質(zhì)量控制[5-7]。本文以超高效液相聯(lián)合三重四級桿質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS法)來針對一清顆粒中的5種標(biāo)識成分進(jìn)行含量測定，質(zhì)譜檢測法可以在測定多種成分的時，對被測成分在液相條件下的分離度沒有強(qiáng)制要求，能具有更高的專屬性和靈敏度。通過對一清顆粒中黃芩苷、鹽酸小檗堿、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚的液相條件和質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，形成較為成熟的UPLC-MS/MS含量測定方法，可以在日常工作中幫助檢驗檢測人員有效地提高檢驗工作時的工作效率和準(zhǔn)確程度，為更全面地針對不同廠家，不同批次的一清顆粒的質(zhì)量評價和控制提供技術(shù)支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 超高效液相色譜儀，型號：ACQUITY UPLC (美國Waters)； 線型離子阱質(zhì)譜分析儀，型號：4000 QTrap(美國Sciex)；電子分析天平，型號：XS205DU(瑞士Mettler Toledo)；超聲波清洗機(jī)，型號：SB-800DTD(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 試藥 對照品均為中國食品藥品檢定研究院生產(chǎn)，分別為：黃芩苷(110715-201619，93.5%)、鹽酸小檗堿(110713-201814，86.7%)、大黃素(110756-201512，98.7%)、大黃酚(110796- 201922，99.4% )、大黃素甲醚(110758-201817，99.2%)；一清顆粒均為河南省及鄭州市2018～2020年度安全監(jiān)督抽檢樣品；乙腈、甲醇(德國Merck)；甲酸(美國Fisher)；純凈水(杭州娃哈哈公司)。

2 試驗方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEN C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相：乙腈(A)-水(含0.1%甲酸)(B)，梯度洗脫程序(0～3 min，20%→90%A；3～4 min，90%A；4～4.5 min，90%→20%A)；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。

質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)；正、負(fù)離子實時切換模式；多重反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)；源噴射電壓：5500V/-4500V(隨離子模式實時切換)；源內(nèi)溫度(TEM)：500 ℃；氣簾氣壓力(CAD)：20 psi；渦旋氣壓力(GAS1、GAS2)：50 psi；碰撞室氣體：氮氣。黃芩苷等5個成分具體質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 線性關(guān)系、檢測限和定量限

表1 黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、腺苷和大黃素的質(zhì)譜參數(shù)

2.2 混合對照品溶液制備 精密稱取5種對照品(黃芩苷、鹽酸小檗堿、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚)適量，分別置于適合的容量瓶中，分別取適量體積置100 mL量瓶中，加甲醇制成混合對照品溶液，對應(yīng)各濃度分別為197.5362μg/mL、52.0497 μg/mL、0.5116 μg/mL、0.5053 μg/mL、0.5071 μg/mL。

2.3 供試品溶液制備 取本品10袋，倒出混合后精密稱定，研細(xì)，精密稱取約0.l g，置100 mL錐形瓶中，加入70%甲醇50 mL，精密稱定。置超聲機(jī)中滿功率超聲30 min，取出放至室溫，稱重后如有重量損失，使用70%甲醇補(bǔ)足其減失的重量，搖勻后使用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 陰性對照溶液制備 取空白輔料，按藥典一清顆粒制法項下的比例混合，制得陰性對照樣品，按2.3項下的方法制得陰性對照溶液。

2.5 專屬性試驗 分別精密吸取稀釋后的混合對照品溶液(精密量取混合對照品溶液5 mL，置 50 mL 量瓶中，加適量甲醇稀釋，并定容至刻度，即得)、供試品溶液及陰性對照溶液各 1 μL，按“2.1”項下的色譜條件與質(zhì)譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示：供試品及對照品溶液在各成分的提取離子流圖(XIC)中出峰時間一致，而陰性對照溶液在對應(yīng)的XIC圖中均沒有干擾，其專屬性強(qiáng)。

1.黃芩苷；2.鹽酸小檗堿；3.大黃素；4.大黃酚；5.大黃素甲醚；A.對照品溶液； B.供試品溶液； C .陰性對照溶液圖1 5種成分的提取離子流圖

2.6 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2”項下的混合對照品溶液1.00、5.00、10.00、50.00 mL，分別置100 mL量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻即得。以各化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，分別以信噪比S/N=3、S/N=10時的濃度作為檢測限和定量限，回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表1，各成分在對應(yīng)范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。

2.7 精密度試驗 取“2.5”項下的稀釋后的混合對照品溶液，取連續(xù)進(jìn)樣6次的數(shù)據(jù)分析。結(jié)果顯示，黃芩苷、鹽酸小檗堿、大黃素及大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.37%、2.21%、4.33%、4.49%、4.25%，顯示本方法的精密度符合要求。

2.8 重復(fù)性試驗 取編號為01的一清顆粒細(xì)粉各6分，平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測定。測得各成分的平均含量分別為1.377、0.373、0.762、16.361 、4.357 mg/片，其RSD分別為3.89%、4.18%、4.76%、2.32%、2.18%，顯示本方法重復(fù)性符合要求。

2.9 穩(wěn)定性試驗 取同一份編號為01的供試品溶液，在室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h后測定。結(jié)果各成分的RSD分別為2.12%、2.38%、4.17%、4.42%、3.97%，表明該供試品溶液在12 h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

2.10 加樣回收率試驗 隨機(jī)取同一批一清顆粒(編號為01)，精密稱取其顆粒細(xì)粉0.05 g，精密加入混合對照品溶液適量，制備6份加標(biāo)供試品溶液的平行樣，計算加樣回收率，結(jié)果顯示，各成分的平均加樣回收率分別為96.37%、95.15%、89.57%、90.64%、87.13%，其RSD分別為2.74%、2.19%、2.44%、2.56%、3.03% 。

2.11 供試品含量測定 全部樣品共9批一清顆粒，按照“2.3”項下方法，分別制備供試品溶液進(jìn)行分析，通過回歸方程計算其5種成分的含量，結(jié)果見表2。

表2 供試品含量測定結(jié)果 (mg/包,n=2)

3 討論

3.1 目標(biāo)化合物的選擇 通過藥典的記載得知，一清顆粒的處方為黃連、黃芩與大黃三味藥材，通過分別煎煮后濃縮成浸膏粉，混合加輔料制成顆粒[1]。其中大黃的用量最大，不使用含量測定的方法對其進(jìn)行質(zhì)量控制顯然不夠嚴(yán)謹(jǐn)。沿用藥典選擇的黃芩苷作為黃芩的標(biāo)志物的思路，實驗中增加了鹽酸小檗堿作為黃連的標(biāo)志物，選用大黃素、大黃酚以及大黃素甲醚作為大黃的標(biāo)志物進(jìn)行含量測定，使用液質(zhì)聯(lián)用方法，一次性針對其中的目標(biāo)成分進(jìn)行檢測，進(jìn)而能夠保證對其進(jìn)行更為全面的質(zhì)量控制。

3.2 提取方法的優(yōu)化 針對供試品前處理中的提取方式、選用溶劑與提取時間進(jìn)行了優(yōu)化研究。其中提取方式選擇了直接超聲和回流提取，結(jié)果顯示二者提取率差異較小，而超聲提取操作較為便捷。選擇的溶劑包括甲醇、50%甲醇、70%甲醇與90%甲醇，最終選用提取率較高的70%甲醇。超聲提取時間在 15 min、30 min與45 min之間進(jìn)行對比，結(jié)果表明選用超聲30 min的樣品，其提取率明顯高于15 min，與45 min的樣品相比差別不明顯。經(jīng)綜合考量，最終確定選用提取溶劑為70%甲醇，超聲提取時間選擇30 min。

3.3 色譜條件的優(yōu)化 流動相的優(yōu)化先采用相同比例的甲醇-水、甲醇-水(含0.1%甲酸)、乙腈-水、乙腈-水(含0.1%甲酸)進(jìn)行考察。結(jié)果顯示使用乙腈作為有機(jī)相時，其圖譜的峰型比甲醇的更好，目標(biāo)化合物的分離程度也更好；而對比加入0.1%的甲酸的水相與純水相，可明顯看到加入0.1%的甲酸可以有效增強(qiáng)這5種化合物的信號強(qiáng)度，也能改善峰形的對稱性。最后考察了不同梯度的洗脫方式，進(jìn)一步提升了分離效率。最終選擇乙腈-水(含0.1%甲酸)作為流動相，采用梯度洗脫方式進(jìn)行試驗。

3.4 結(jié)果分析 綜上所述，本試驗建立了使用UPLC-MS/MS法同時測定一清顆粒中5個成分的含量，9批樣品測定結(jié)果中可以看出，黃芩苷作為藥典方法的控制因素，其含量測定結(jié)果顯示，各批次間差異較小，且均符合藥典規(guī)定(每袋不得少于21 mg)。鹽酸小檗堿的含量測定結(jié)果，各個批次差異也相對較小；而以大黃素、大黃酚、大黃素甲醚作為大黃藥材的特征成分來看，各批次間呈現(xiàn)出較大差異。