江阿力·帕孜力別克，米熱阿依克孜·馬木提，趙莉，魯皓

1.新疆醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊（830001）；2.石河子大學口腔醫(yī)學系，新疆維吾爾自治區(qū) 石河子（832000）；3.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院口腔科，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊（830000）

牙周-牙髓聯(lián)合病變（combined periodontal-endodontic lesions）是發(fā)生在牙周病或根尖周病晚期，導致廣泛牙周組織破壞及牙髓病變的綜合征，是牙齒缺失的重要原因之一［1］。1999年國際牙科會議分類為：牙髓源性牙周牙髓聯(lián)合病變、牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變和并存型牙周牙髓聯(lián)合病變［2］。這一分類為病因型分類，缺乏直觀指標，臨床上原發(fā)病變較長時間得不到治療時，分型鑒別診斷有一定難度。從臨床治療效果看，牙髓源性的牙周牙髓聯(lián)合病變，僅通過根管治療即可表現(xiàn)為組織愈合，與牙周源性的病變預后大不相同。牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變患者往往會因診斷不及時或治療不規(guī)范而病情惡化，最終導致患牙拔除。

牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變是臨床上較常見的一個分型，由于深牙周袋內(nèi)的細菌、毒素通過根尖孔或近根尖處的側(cè)支根管進入牙髓，導致牙髓組織發(fā)生病變［3］。目前很多研究已證明牙周牙髓聯(lián)合病變中，牙周和牙髓感染病損中細菌菌群具有相似性。然而對牙周和牙髓組織感染部位細菌數(shù)量及其相關(guān)性方面的研究極少，本實驗應用實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRTPCR）技術(shù)，對牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變和重度牙周炎患者分別進行了常見病原菌的檢測，并分析牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變致病菌分布狀況及其相關(guān)性，為臨床治療提供參考依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選擇2018年1月至2020年6月于新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院就診的牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變者43例，共43顆牙作為實驗組，其中男26例，女17例；年齡17～75歲，平均（37.65±11.48）歲。另選重度牙周炎者41例，共41顆牙作為對照組，其中男20例，女21例；年齡15～72歲，平均（36.32±10.76）歲。記錄所有研究對象的基本資料、口腔衛(wèi)生狀況、牙齦狀況、牙周探診及牙松動度，拍攝曲面斷層片。兩組患者的性別、年齡、口腔衛(wèi)生情況等比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本實驗通過新疆自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會審批（審批號：KY20180118157），所有患者已簽署的知情同意書。

1.2 納入和排除標準

實驗組納入標準參考《牙周病學》相關(guān)診斷標準［4］：①有長期的牙周炎病史，近期出現(xiàn)牙髓炎癥狀，牙冠、牙根完整，無引發(fā)牙髓炎的深齲、牙隱裂等牙體硬組織疾病；②深達根尖區(qū)的牙周袋或嚴重的牙齦退縮；③松動度達Ⅱ度以上；④溫度檢測可激發(fā)劇痛或無反應等異常反應；⑤X線片示病變位點牙槽骨吸收≥根長2/3；⑥臨床診斷為逆行性牙髓炎者。排除標準：①患牙有外傷史；②有糖尿病、心血管疾病、高血壓等全身系統(tǒng)性疾??；③治療前6個月進行過牙周治療；④長期服藥史或近1個月內(nèi)服用過抗生素；⑤口腔專科檢查和影像學表現(xiàn)確診為牙根縱裂的患者；⑥正畸治療史；⑦牙髓治療史。

對照組納入標準［5］：①探診深度＞6 mm；②附著喪失≥5 mm；③牙槽骨吸收超過根長的1/2；④牙齒松動；⑤炎癥較明顯，可伴有牙周膿腫；⑥后牙有Ⅱ度或Ⅲ度根分叉病變。診斷為重度牙周炎的患者需要2顆及以上患牙具有上述前3項特征；如僅有2顆患牙，這2顆患牙須不是相鄰患牙，且至少位于不同的象限。排除標準：①高血壓、糖尿病、類風濕關(guān)節(jié)炎等全身系統(tǒng)性疾病者；②孕婦和哺乳期患者；③半年內(nèi)有牙周治療史或3個月之內(nèi)有服用抗生素、激素類藥物的患者；④吸煙者。

1.3 齦下菌斑與根管內(nèi)組織的采集與處理

實驗組與對照組采樣前清除局部齦上菌斑，無菌棉卷隔濕，探診患牙牙周袋至最深部位，將無菌刮治器置于牙周袋底部，刮取牙周袋內(nèi)齦下菌斑放入滅菌的EP管中，-80℃保存。實驗組根管內(nèi)組織的采集：局部麻醉后橡皮障隔離取樣牙，開髓，用無菌低速手機在無水狀態(tài)下揭去髓室頂，用15號K銼探查牙周袋較深側(cè)根管，疏通根管，根管長度測量儀測定基本工作長度。將無菌紙尖放入根管內(nèi)，止點為距離根尖孔0.5～2 mm處，重復3次放入同一EP管中。所有樣本均置于冰面上，并及時轉(zhuǎn)送至-80℃低溫冰箱保存。本實驗病例標本均由同一名經(jīng)過臨床培訓的牙體牙髓?？漆t(yī)師采集。

1.4 DNA的提取

樣本處理：將存于-80℃的樣本冰上解凍30 min，加1 mL PBS緩沖液，震蕩5 min，12 000 rpm離心3 min，留沉淀。應用細菌基因組DNA提取試劑盒（南京諾唯贊，中國）對根管內(nèi)組織和齦下菌斑標本DNA進行提取。提取方法嚴格參照試劑盒操作手冊。分光光度計檢測DNA濃度范圍0.02～20 ng/μL，提取的DNA樣品-20℃保存。

1.5 實時熒光定量PCR技術(shù)檢出微生物

1.5.1 引物設(shè)計 對病原微生物消化性鏈球菌（Digestive streptococcus，Ds）ATCC27337、糞腸球菌（Enterococcus faecalis，Ef）ATCC29200、牙髓卟啉單胞 菌（Porphyromanus endodontics，Pe）ATCC35406、中間普氏菌（Prevotella intermedia，Pi）ATCC25611、牙 齦 卟 啉 單 胞 菌（Porphyromonas gingivalis，Pg）ATCC33277、福賽斯坦納菌（Tannerella forsythia，Tf）ATCC43037、齒垢密螺旋體（Treponema denticola，Td）ATCC35405及具核梭桿菌（Fusobacterium nucleatum，F(xiàn)n）ATTC25586的特異性引物序列使用PrimerQuest進行設(shè)計，引物擴增序列參考人類口腔微生物數(shù)據(jù)庫（expanded Human Oral Microbiome Database，eHOMD）。細菌16SrRNA的引物序列信息由生物公司合成，見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences of the quantitative real-time PCR

1.5.2 標準品制備 以Ds、Ef、Pe、Pi、Pg、Tf、Td和Fn的基因組DNA做模板，分別用各自的特異性引物擴增得到目的序列后，構(gòu)建含有8種細菌靶基因的重組質(zhì)粒，然后使用質(zhì)粒小提試劑盒（離心柱型）（TIANGEN，中國）提取質(zhì)粒DNA并送上海生工測序，與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進行同源性分析。擴增產(chǎn)物與GenBank中的目的細菌有100%同源性，且無其他非特異性產(chǎn)物擴增，說明該樣本含有目的細菌。

1.5.3 標準曲線繪制 將標準品細菌基因組DNA濃度調(diào)整到1 ng/μL。以10的倍比（10-1～10-6）連續(xù)稀釋各細菌的基因組DNA，設(shè)置6個梯度，以此為模版，進行QRT-PCR反應。其反應體系均為20μL：2×master mix（10.0μL），Primer（10 pm）mix（1.2μL），Template（1.0μL），ddH2O（7.8μL）。擴增條件：95℃預變性5 min；95℃變性10 s；60℃退火30 s；72℃延伸20 s，循環(huán)55次；72℃復性10 min；最后降溫至4℃。擴增的物質(zhì)儲存在-20℃。

1.5.4 標本處理 將根管內(nèi)組織和齦下菌斑標本DNA進行Realtime PCR，每份樣本重復3次，取其平均值。Realtime PCR時，選取構(gòu)建的質(zhì)粒作為標準品（Standard），同時設(shè)置一個無template的空白陰性對照（NTC），進行絕對定量的分析。

1.6 統(tǒng)計學分析

應用SPSS25.0統(tǒng)計軟件，定量資料正態(tài)分布以（）表示，偏態(tài)分布以M（IQR）表示。定量資料組內(nèi)比較符合正態(tài)分布時采用配對樣本t檢驗，不符合時采用配對樣本非參數(shù)Wilcoxon檢驗。組間比較，符合正態(tài)分布時采用兩獨立樣本t檢驗，不符合時采用兩獨立樣本非參數(shù)U檢驗（Mann-Whitney U test）。根管內(nèi)組織和齦下菌斑細菌數(shù)量關(guān)系用斯皮爾曼秩相關(guān)分析。以α＝0.05為檢驗水準。

2結(jié)果

2.1 實驗組根管內(nèi)組織和齦下菌斑病原菌分布比例

根管內(nèi)和齦下菌斑中均能檢出8種病原菌，根管內(nèi)分布最多的病原菌為Ds、Pe、Fn；齦下菌斑分布最多的為Pg、Fn、Tf、Td、Pe及Pi，見圖1。

Figure 1 Proportion of pathogen distribution in root canal tissue and subgingival plaque in in patients with combined periodontal-endodontic lesions of periodontal origin圖1 牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變患者根管內(nèi)組織和齦下菌斑病原菌分布比例

2.2 實驗組根管內(nèi)組織與其齦下菌斑病原菌數(shù)量及實驗組與對照組齦下菌班病原菌數(shù)量比較

采用配對樣本非參數(shù)Wilcoxon檢驗比較實驗組根管內(nèi)組織與齦下菌斑病原菌數(shù)量，結(jié)果顯示，Ds、Pe數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.263、P＝0.277），其余6種病原菌數(shù)量差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。對實驗組與對照組齦下菌斑標本病原菌數(shù)量進行兩獨立樣本非參數(shù)U檢驗（Mann-Whitney U test）發(fā)現(xiàn)Ds數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.241），其余7種病原菌數(shù)量差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表2 牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變患牙根管內(nèi)組織和齦下菌斑病原菌數(shù)量比較Table 2 Number of pathogens in root canal tissues and subgingival plaque in teeth with combined periodontal-endodontic lesions of periodontal origin M（IQR）

表3 牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變患牙和重度牙周炎患牙齦下菌斑病原菌數(shù)量比較Table 3 Comparison of the number of subgingival plaque pathogens between teeth with combined periodontal-endodontic lesions of periodontal origin and teeth with severe periodontitis M（IQR）

2.3 斯皮爾曼秩相關(guān)分析實驗組根管內(nèi)組織與其齦下菌斑細菌數(shù)量的關(guān)系

結(jié)果顯示實驗組根管內(nèi)組織與齦下菌斑中Ef（r＝0.347，P＜0.05）、Pe（r＝0.363，P＜0.05）、Pg（r＝0.437，P＜0.01）、Td（r＝0.471，P＜0.01）、Tf（r＝0.679，P＜0.01）數(shù)量呈正相關(guān)，見表4。

表4 牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變患牙根管內(nèi)組織與其齦下菌斑細菌數(shù)量的相關(guān)性分析Table 4 Relationship between the number of bacteria in root canal tissues and subgingival plaque in teeth with combined periodontal-endodontic lesions of periodontal origin

3討論

牙髓組織與牙周組織解剖結(jié)構(gòu)互通，兩者的病變常發(fā)生交叉感染，因而導致聯(lián)合病變的發(fā)生。近年研究發(fā)現(xiàn)，導致單純牙髓炎和牙周病的微生物屬于不同的菌種，而且不同的感染微生物對組織的破壞機制的不同會導致疾病的臨床表現(xiàn)也不盡相同［6］。此外，不同深度牙周袋中的微生物也會受到局部環(huán)境影響，而深牙周袋是常見的導致牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變的牙周病損［7］。

牙周可疑致病菌主要有Pg，Td，Tf，F(xiàn)n，Pi等［8］。本實驗應用qRT-PCR技術(shù)對以上8種病原菌進行檢測，結(jié)果顯示實驗組根管內(nèi)及兩組齦下菌斑中均能檢測到這些細菌。實驗組根管內(nèi)分布最多的病原菌為Ds、Pe、Fn；齦下菌斑分布最多的為Pg、Fn、Tf、Td、Pe及Pi。說明牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變患牙牙周組織和牙髓組織中的菌群結(jié)構(gòu)和組成具有相似性但數(shù)量上存在差異性。楊萬娟等［9］檢測牙周炎患者齦下菌斑菌群發(fā)現(xiàn)，廣泛型侵襲性牙周炎（generalized aggressive periodontitis，GAgP）和重度慢性牙周炎（severe chronic periodontitis，SCP）患者的優(yōu)勢菌群相似，均包括擬桿菌門、卟啉單胞菌屬和Pe等。本實驗兩組齦下菌斑檢出的病原菌組成與其結(jié)果相似，Ef占的比重最小。Ef首先從持續(xù)性根尖周炎中被分離出，隨后在很多其他的牙髓感染中被依次檢出，在難治性根尖周炎根管中的發(fā)現(xiàn)率較高。

Pereira等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在牙周牙髓聯(lián)合病變患者的牙髓組織中可檢出主要存在于牙周的Pi，Pg等。國內(nèi)外學者通過PCR-DGGE凝膠電泳分析后認為根管內(nèi)的微生物與牙周袋內(nèi)的非常相似［11-12］。本實驗在這些研究的基礎(chǔ)上檢測了牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變者根管及牙周袋內(nèi)病原微生物數(shù)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)根管內(nèi)除了Ds和Pe外，其余6種常見病原菌與齦下菌斑病原菌數(shù)量均有顯著差異，推測牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變根管內(nèi)樣本因髓腔處于相對封閉狀態(tài)，病原微生物僅通過根尖孔和牙本質(zhì)小管進入根管系統(tǒng)，因此細菌檢出量較少，而牙周袋較封閉的根管系統(tǒng)更加開放，從而有更多的病原微生物進入牙周袋內(nèi)。

牙周病變中致病微生物所產(chǎn)生的毒性產(chǎn)物可通過側(cè)支根管和副根管進入牙髓組織內(nèi)，導致牙髓組織發(fā)生病變。齦下刮治或根面平整術(shù)后牙齒根面牙骨質(zhì)缺損也會導致牙本質(zhì)小管暴露，即使不存在側(cè)支根管和副根管，細菌也可通過牙本質(zhì)小管進入牙髓組織［13］。另有研究報道中度到重度慢性牙周炎可影響牙髓組織發(fā)生病變，牙本質(zhì)小管可作為細菌在牙髓組織和牙周組織間傳播感染的通道［14］。本實驗通過對牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病患牙和重度牙周炎患牙齦下菌斑檢出的細菌數(shù)量進行分析發(fā)現(xiàn)，除Ds外，其余7種病原菌數(shù)量均有顯著差異，牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變牙周袋內(nèi)細菌檢測數(shù)量顯著高于重度牙周炎患牙，與Holt等［15］研究結(jié)果一致。牙周原發(fā)病變較長時間得不到治療時，牙周袋內(nèi)致病菌數(shù)量會持續(xù)增加，可通過深牙周袋經(jīng)根尖區(qū)或側(cè)支根管進入牙髓組織內(nèi)，使發(fā)生繼發(fā)性牙髓炎的風險增大。盡管牙周牙髓聯(lián)合病變患牙和牙周炎患牙都有致病菌定植，但炎癥部位致病菌的量和分布有所不同，只有當致病菌數(shù)量達到某一臨界值時才會引起牙髓組織炎癥。

Nonnenmacher等［16］研究認為在牙周炎發(fā)展過程中牙周炎癥部位細菌數(shù)量可能是關(guān)鍵，牙周健康與牙周炎的主要區(qū)別并不是致病菌檢出率不同，而是陽性樣本中致病菌數(shù)量的差異。只有細菌存在不一定導致牙周炎發(fā)生，牙周炎的發(fā)生發(fā)展與宿主防御機制、細菌之間相互作用、細菌在牙周定居的數(shù)量水平等諸多因素有關(guān)。本實驗通過分析牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變者根管和齦下菌斑細菌數(shù)量的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，Ef、Pe、Pg、Td、Tf細菌在根管內(nèi)與牙菌斑中的數(shù)量具有高度相關(guān)性，表明這些病原菌可能在逆行性牙髓炎的發(fā)生發(fā)展過程中扮演了較重要的角色。其中Pe、Pg是感染根管內(nèi)最常見的優(yōu)勢菌，Ef在原發(fā)和繼發(fā)的感染根管內(nèi)均能被檢出。Wara-aswapati等［17］的研究結(jié)果表明，在牙周炎患者齦下菌斑中Pg、Tf、Td細菌之間存在強烈的共聚積作用，細菌間的黏附具有特異性和較強的致病關(guān)聯(lián)性，提示這3種致病菌可能是逆行性牙髓炎牙髓組織感染的主要致病菌。此外，許多研究結(jié)果證實齦下菌斑中細菌數(shù)量水平與牙周袋深度之間存在相關(guān)性，隨著牙周袋加深，牙周袋內(nèi)致病菌數(shù)量相應增加，細菌之間的致病菌協(xié)同致病作用更顯著［18］。隨著牙周炎的進一步發(fā)展，牙槽骨的破壞常達根尖1/3，而此處常常是側(cè)枝根管、根尖分歧最常分布的區(qū)域，為牙周袋內(nèi)的微生物進入牙髓組織提供了更多的解剖通道，侵入牙髓組織的細菌數(shù)量也增多，逐漸引發(fā)牙髓的退行性變，進而導致牙髓病變［19］。而整個根管系統(tǒng)內(nèi)也是無氧環(huán)境，利于這些厭氧菌生長繁殖，在牙周和牙髓兩種組織中相互擴散和影響使病變加重［20］。

牙周源性牙周牙髓聯(lián)合病變常見病原菌在根管內(nèi)數(shù)量低于齦下菌斑且根管內(nèi)病原菌數(shù)量與齦下菌斑密切相關(guān)，建議牙周感染患者應及時進行合理的治療，以降低其發(fā)展成為牙周牙髓聯(lián)合病變的風險。