趙媛媛，譚雄暢，陳 宇，黃遠(yuǎn)港，楊林幅，阮 萍

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011）

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，在中國15～44歲女性惡性腫瘤死亡率中，宮頸癌位居第三，僅次于乳腺癌及肺癌，中國每年約有61 700例宮頸癌新發(fā)病例，約29 600例宮頸癌患者死亡［1］。目前人乳頭瘤病毒（HPV）疫苗在我國已正式上市，但我國人群對(duì)于HPV 及其疫苗的認(rèn)知度低，疫苗的普及率低，接種率也不理想［2］。因此，我們不僅要關(guān)注已經(jīng)接種疫苗的人群中宮頸癌的發(fā)生是否降低，也應(yīng)同時(shí)關(guān)注已被診斷為宮頸癌前病變的人群?；谛螒B(tài)學(xué)分級(jí)的局限性，并不能有效預(yù)測(cè)宮頸病變是否進(jìn)展，特異性分子生物標(biāo)記物輔助宮頸篩查成為目前研究的熱點(diǎn)之一。近年的研究顯示鱗柱交界（Squamo?columnar junction，SCJ）細(xì)胞是宮頸轉(zhuǎn)化區(qū)內(nèi)一種獨(dú)特的上皮細(xì)胞群，被認(rèn)為是HPV 感染宮頸細(xì)胞的起始部位［3］。細(xì)胞角蛋白7（Cytokeratin 7，CK7）作為SCJ 的免疫標(biāo)記物，與HPV 介導(dǎo)的宮頸癌前病變和宮頸癌有關(guān)［4］。目前對(duì)于CK7、細(xì)胞角蛋白19（Cyto?keratin 19，CK19）與SCJ細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌組織這三者之間的聯(lián)系研究較少。本研究擬探討檢測(cè)CK7、CK19在不同級(jí)別子宮上皮內(nèi)病變和宮頸癌中的表達(dá)，評(píng)價(jià)其在宮頸癌前病變和宮頸癌中的診斷效能及作為預(yù)測(cè)子宮上皮內(nèi)病變進(jìn)展和腫瘤預(yù)后評(píng)估手段的可能性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料收集2016年6月至2019年11月廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院收治的行宮頸電切環(huán)形切除術(shù)、宮頸錐切術(shù)或全子宮切除術(shù)患者72例，其中經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（Lowgrade squamous intraepithelial lesion，LSIL）16例（LSIL組）、高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（High-grade squa?mous intraepithelial lesion，HSIL）42例（HSIL 組）；同期收治的行全子宮切除術(shù)或廣泛子宮切除術(shù)+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)患者14例，經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為宮頸鱗癌（SCC 組）。所有研究對(duì)象均未合并其他內(nèi)外科疾病，術(shù)前未進(jìn)行免疫性治療；排除宮頸病變術(shù)后復(fù)發(fā)的患者。

1.2 免疫組化EnVision 檢測(cè)所用鼠抗人CK7 單克隆抗體、鼠抗人CK19單克隆抗體及EnVision 兩步法試劑盒均為北京中杉金橋公司生產(chǎn)。常規(guī)脫蠟、水化組織切片；按說明書進(jìn)行檸檬酸鹽高溫高壓修復(fù)；0.3% 或3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS 或TBS沖洗；滴加CK7、CK19一抗4℃過夜；按試劑盒說明書滴加二抗；滴加DAB 溶液顯色；蒸餾水沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。采用該公司提供的陽性切片為陽性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn)采用組織學(xué)評(píng)分，所得免疫組化切片表達(dá)結(jié)果由廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院病理科專家閱片審核。CK7 及CK19 均在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，CK7及CK19陰性定義為完全陰性或局灶、模糊的單個(gè)細(xì)胞染色。CK19 陽性定義為5～6 個(gè)連續(xù)的細(xì)胞顯示胞漿和/或胞膜染色。CK7 陽性定義為≥1% 細(xì)胞胞漿的彌漫染色。根據(jù)病變處上皮細(xì)胞內(nèi)的染色情況，CK7可分為三種染色模式：陰性、斑片狀陽性、彌漫陽性。根據(jù)染色細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分：陰性（0分），少于1%的細(xì)胞染色；斑片狀陽性（1 分），介于1%到40%的細(xì)胞染色；彌散陽性（2 分），超過40%的細(xì)胞染色［4］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher’s 檢驗(yàn)；CK7 和CK19 的表達(dá)相關(guān)性采用Spearman 秩相關(guān)性分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CK7 在不同級(jí)別子宮上皮內(nèi)病變及宮頸癌中的表達(dá)CK7 在正常的宮頸上皮往往是陰性；在高、低級(jí)別宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變及鱗狀細(xì)胞癌中，CK7 的表達(dá)表現(xiàn)為表層斑片狀陽性，或全層彌漫陽性，但表層斑片狀染色加深，呈現(xiàn)“由上至下”的染色模式（見圖1）。各組中CK7 表達(dá)率由高到低依次為HSIL 組（76.19%）、SCC 組（64.29%）、LSIL 組（25.00%）。CK7 在LSIL 組、HSIL 組、SCC 組中的表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=17.531，P＜0.05）。其中LSIL 組CK7 表達(dá)率與HSIL 組、SCC 組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.352、4.693，均P＜0.05）；HSIL 組CK7表達(dá)率與SCC 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.759，P＞0.05）。見表1。

表1 CK7在不同級(jí)別子宮上皮內(nèi)病變及宮頸癌中的表達(dá)情況 （例）

2.2 CK19 在不同級(jí)別子宮上皮內(nèi)病變及宮頸癌中的表達(dá)在正常的宮頸鱗狀上皮中，CK19 多數(shù)在基底層表達(dá)。在高、低級(jí)別宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變及鱗狀細(xì)胞癌中，CK19表達(dá)多為全層表達(dá)或表達(dá)于癌巢周邊（見圖1）。各組中CK19 表達(dá)率由高到低依次為SCC 組（78.57%）、HSIL 組（76.19%）、LSIL 組（31.25%）。CK19 在LSIL 組、HSIL 組、SCC 組中的表達(dá)率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.638，P＜0.05）。LSIL 組CK19 表達(dá)率與HSIL 組、SCC 組表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.131、6.718，均P＜0.05）；HSIL組CK19表達(dá)率與SCC 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.033，P＞0.05）。見表2。

圖1 各級(jí)別宮頸上皮病變HE染色、CK7及CK19表達(dá)情況

表2 CK19在不同級(jí)別子宮上皮內(nèi)病變及宮頸癌中的表達(dá)情況 （例）

2.3 CK7、CK19的表達(dá)相關(guān)性經(jīng)Spearman秩相關(guān)性分析，CK7與CK19在不同級(jí)別子宮上皮內(nèi)病變和宮頸癌中的表達(dá)呈正相關(guān)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.365，P＜0.05），見表3。

表3 CK7及CK19在不同級(jí)別子宮上皮內(nèi)病變及宮頸癌中的表達(dá)相關(guān)性 （例）

3 討 論

宮頸癌的發(fā)生歷經(jīng)低級(jí)別子宮上皮內(nèi)病變（LSIL）、高級(jí)別子宮上皮內(nèi)病變（HSIL）、宮頸鱗癌（SCC），是一個(gè)緩慢、漸進(jìn)的過程。細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶抑制劑P16 和細(xì)胞核增殖相關(guān)抗原Ki-67是目前臨床上常用來輔助診斷子宮上皮內(nèi)病變和宮頸癌的標(biāo)記物。P16、Ki-67 二者聯(lián)合檢測(cè)可反映腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)［5］。但這兩個(gè)指標(biāo)并不能作為預(yù)測(cè)子宮上皮內(nèi)病變進(jìn)展及分級(jí)的特異性標(biāo)記物。

SCJ 細(xì)胞是宮頸轉(zhuǎn)化區(qū)內(nèi)一種獨(dú)特的上皮細(xì)胞群，被認(rèn)為是HPV 感染宮頸細(xì)胞的起始部位。目前認(rèn)為SCJ 細(xì)胞作為殘留的胚胎細(xì)胞，容易發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)化［6］，CK7、AGR2、CD63 等可作為SCJ 細(xì)胞的標(biāo)記物［7］。

細(xì)胞角蛋白（CK）作為一種中間絲，是細(xì)胞骨架的一部分，起維持上皮細(xì)胞機(jī)械穩(wěn)定性和完整性的作用。CK 的表達(dá)參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)調(diào)整、生長(zhǎng)、增殖、凋亡整個(gè)過程［8］。它的表達(dá)水平受到細(xì)胞增殖和分化狀態(tài)的影響，在正常細(xì)胞發(fā)生惡變后，CK 的表達(dá)水平發(fā)生改變：出現(xiàn)異常表達(dá)或表達(dá)減少乃至缺失［9］。

CK7 是一種堿性的Ⅱ型細(xì)胞角蛋白，在許多腺上皮和移行上皮表達(dá)，同時(shí)作為一種中間絲，在細(xì)胞質(zhì)與其他輔助蛋白結(jié)合形成致密斑，維持上皮細(xì)胞的完整性［10］。CK7 多數(shù)表達(dá)在上皮腫瘤中，除了在宮頸鱗癌表達(dá)呈陽性，其他部位的鱗狀細(xì)胞癌CK7表達(dá)多呈陰性［11］。

HUANG 等［12］研究指出LSIL 中CK7 陽性與進(jìn)展為HSIL 的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。CAO 等［13］研究分析CK7在LSIL 中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CK7 在LSIL 組、HSIL 組的表達(dá)率分別為48.6%、78.6%，病變等級(jí)與CK7 表達(dá)呈正相關(guān)（P=0.007），且CK7陽性和CK7陰性患者隨訪后的病變進(jìn)展率顯著不同（分別為50% 和80.8%，P=0.022）,支持CK7 是LSIL 臨床預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)。其他國內(nèi)學(xué)者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有著相似的結(jié)論：王維俊等［14］研究結(jié)果顯示，CK7 表達(dá)在LSIL 組中以弱陽性為主，在HSIL 組中CK7 表達(dá)范圍與強(qiáng)度明顯增加（P＜0.05）；潘嬙微等［15］研究結(jié)果顯示CK7在LSIL組、HSIL 組、SCC 組中的表達(dá)率分別是20%、58%、80%，隨著宮頸病變級(jí)別越高，CK7表達(dá)率越高，但宮頸病變不表達(dá)CK7，可能意味著消退或持續(xù)存在但不進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)，CK7在LSIL 及HSIL 組表達(dá)的規(guī)律與前述研究一致。在表達(dá)模式方面，CK7 在LSIL 組中呈斑片狀陽性（50%）、彌漫陽性（50%）；在HSIL組、SCC 組中的表達(dá)主要呈彌漫陽性。CK7 的表達(dá)主要分布于上皮細(xì)胞的表皮層，隨著病變級(jí)別的增高，CK7 染色沿上皮細(xì)胞的表皮層向下延伸至基底層，呈現(xiàn)一種自上而下的染色模式。該結(jié)果支持通過檢測(cè)CK7在不同級(jí)別子宮上皮內(nèi)病變中的表達(dá)水平和表達(dá)模式，可以作為預(yù)測(cè)宮頸病變是否發(fā)生進(jìn)展的評(píng)估手段。然而，目前對(duì)于CK7 陽性的SCJ 細(xì)胞和表皮層細(xì)胞參與宮頸癌形成的這一相關(guān)機(jī)制尚不清楚。有研究提示，CK7 表達(dá)與HPV 感染有關(guān)，HR HPV 感染的SCJ細(xì)胞誘導(dǎo)CK7陽性細(xì)胞增殖，是形成宮頸癌組織的前體細(xì)胞［6］。在HPV感染宮頸細(xì)胞之后，殘留的胚胎SCJ 細(xì)胞可能在炎癥或損傷過程中遷移到鄰近的鱗狀細(xì)胞中，此時(shí)CK7 陽性細(xì)胞化生或異常增生向下增殖擴(kuò)張，類似Barrett 食管的病變模式［16］。

目前關(guān)于CK19 在子宮上皮內(nèi)病變和宮頸癌的研究少有報(bào)道。CK19 是一種酸性的Ⅰ型細(xì)胞角蛋白，但是與所有其他中間絲蛋白的不同之處在于其不顯示羧基末端的非α 螺旋尾結(jié)構(gòu)域，編碼CK19 的基因也是特例，導(dǎo)致CK19 僅包含5 個(gè)內(nèi)含子，它們出現(xiàn)在與其他中間絲蛋白基因中內(nèi)含子位置相對(duì)應(yīng)的位置，盡管CK19可以和其他Ⅰ型細(xì)胞角蛋白一樣起到維持上皮細(xì)胞的機(jī)械穩(wěn)定性和完整性的作用，但在沒有Ⅱ型細(xì)胞角蛋白伴侶的情況下，它不會(huì)形成典型的中間絲［17］。在正常的細(xì)胞逐漸惡變?yōu)榘┘?xì)胞的過程中，CK19 的結(jié)構(gòu)不會(huì)發(fā)生改變，保留原先的表達(dá)模式，因而CK19成為常用的腫瘤標(biāo)記物之一。越來越多研究發(fā)現(xiàn)CK19 對(duì)于預(yù)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移潛能的重要性，包括甲狀腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌等，是腫瘤診斷、治療和預(yù)后的有用研究工具［18］。LEE 等［4］研究CK7、CK19 在HSIL、SCC 中的表達(dá)及其與宮頸癌發(fā)生的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，CK7 是CK19 的伴侶蛋白，兩者在宮頸癌中呈特異表達(dá)，CK7、CK19 和宮頸癌這三者之間存在某種關(guān)聯(lián)，但對(duì)于CK7、CK19 參與HPV 感染SCJ 而致宮頸癌這一系列變化的發(fā)生機(jī)制目前仍不太清楚，他們的研究結(jié)果提示CK7和CK19的表達(dá)有助于HPV 感染的宮頸細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。此外，他們還發(fā)現(xiàn)CK19 在HSIL 組、SCC 組的表達(dá)率均為100%，但在SCC 組中CK19 陽性的病例中約有1/3 CK7 表達(dá)陰性。本研究結(jié)果顯示，與LSIL 組相比，CK19在HSIL組、SCC組中的表達(dá)增高，提示CK19與宮頸鱗狀上皮的高級(jí)別病變乃至癌變相關(guān)。通過Spearman 秩相關(guān)性分析，CK7 和CK19 在子宮上皮內(nèi)病變和宮頸癌中的表達(dá)呈正相關(guān)，提示CK19參與宮頸鱗狀上皮病變過程的作用機(jī)制可能與SCJ 有關(guān)。CK19的表達(dá)模式是自基底層向上延伸至表皮層，呈現(xiàn)一種自下而上的染色模式，與CK7 正好相反。HPV 首先感染宮頸上皮的基底細(xì)胞，基底細(xì)胞是鱗狀上皮的儲(chǔ)備細(xì)胞，受感染的基底細(xì)胞發(fā)生不典型增生，從基底層向表皮層自下而上增殖分化，導(dǎo)致子宮上皮內(nèi)病變甚至宮頸癌的發(fā)生［19］。而CK19 的表達(dá)有助于保留干細(xì)胞的自我增殖能力。因此，這些結(jié)果支持CK19 與HPV 感染均有可能作用于基底層的儲(chǔ)備細(xì)胞。我們觀察到，在宮頸癌前病變和宮頸癌發(fā)生過程中，宮頸上皮同時(shí)出現(xiàn)上層表皮細(xì)胞表達(dá)CK7 陽性和下層基底細(xì)胞表達(dá)CK19 陽性。盡管CK7是CK19的伴侶蛋白，但兩者沒有共同表達(dá)在相同部位的癌組織，可能是由于不同HPV 同時(shí)感染SCJ 細(xì)胞和基底細(xì)胞，導(dǎo)致SCJ 細(xì)胞和基底細(xì)胞同時(shí)發(fā)生癌變［20-21］。目前對(duì)于CK7、CK19 與HPV 感染導(dǎo)致宮頸癌前病變甚至宮頸癌這一系列變化過程的相關(guān)機(jī)制仍不清楚。

值得注意的是，本研究中CK7 在SCC 組中的表達(dá)低于HSIL組，與潘嬙微等［15］研究結(jié)果不一致。有研究表明，CK7 的缺失與早期宮頸癌的不良預(yù)后相關(guān)［22］。這提示我們，宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變發(fā)展至浸潤癌的過程中，CK7 的缺失可能與腫瘤細(xì)胞的侵襲性增強(qiáng)有關(guān)，這有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，CK7 和CK19 陽性率在不同級(jí)別的宮頸病變演變過程中逐漸上升，與病變程度相一致，二者聯(lián)合檢測(cè)可作為預(yù)測(cè)子宮上皮內(nèi)病變進(jìn)展的評(píng)估指標(biāo)。