崔曉亮，王曉丹

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132011)

人腦惡性膠質(zhì)瘤(Human brain malignant glio- ma)是人體顱內(nèi)最常見神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率、復(fù)發(fā)率和死亡率，影響人們的生命健康[1].在人腦惡性膠質(zhì)瘤中，存在很多異常表達(dá)的蛋白，選取與腫瘤增殖能力相關(guān)的抗原Ki-67、人體抑癌基因p53及與侵襲能力相關(guān)的波形蛋白Vim，探討它們在不同級別人腦惡性膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，可作為判斷患者預(yù)后的重要指標(biāo)[2].

本研究收集神經(jīng)外科手術(shù)切除且保存完好的40例膠質(zhì)瘤的石蠟標(biāo)本，按世界衛(wèi)生組織(WHO)神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)(2007年)將其分為低級別組、高級別組及正常對照組，采用免疫組化法觀察Ki-67、p53、Vim與人腦惡性膠質(zhì)瘤病理分級的關(guān)系.

1 資料和方法

1.1 臨床資料

選擇北華大學(xué)附屬醫(yī)院2014年1月—2020年1月經(jīng)病理學(xué)解剖結(jié)果證實為惡性膠質(zhì)瘤的患者40例為觀察組，選擇同期腦外傷開顱清除血腫患者20例為對照組，其中，觀察組男18例，女22例，年齡34～83歲，平均(56.18±9.82)歲；對照組男11例，女9例，年齡33～74歲，平均(56.05±10.87)歲.兩組患者的臨床資料在發(fā)病年限、治療方法、飲食習(xí)慣方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05).

1.2 方 法

組織病理HE染色：將正常腦組織及膠質(zhì)瘤腫瘤組織在10%中性甲醛中固定8～12 h，再經(jīng)過脫水、包埋等技術(shù)制備石蠟切片，厚4 μm，HE染色，并在鏡下觀察.

膠質(zhì)瘤的分級：以有或無4種形態(tài)學(xué)特征(細(xì)胞核的非典型性、血管內(nèi)細(xì)胞增生、核分裂、壞死灶)將膠質(zhì)瘤分為4級，4個特征都不具有的為I級，有1項的為Ⅱ級，有2項的為Ⅲ級，有3項或4項的為Ⅳ級.將Ⅰ～Ⅱ級膠質(zhì)瘤定為低級別膠質(zhì)瘤，Ⅲ～Ⅳ級定為高級別膠質(zhì)瘤.

免疫組化檢測：采用免疫組化Envision法(多聚體兩步法)檢測腦組織及腦膠質(zhì)瘤中Ki-67、p53、Vim蛋白的表達(dá)情況.主要程序：石蠟切片，依次經(jīng)二甲苯和梯度酒精脫水，并進(jìn)行抗原修復(fù)；經(jīng)PBS洗滌后加入3%過氧化氫溶液15 min，PBS洗滌后滴加一抗孵育1 h(37 ℃溫箱中)，PBS洗滌后滴加二抗孵育20 min(37 ℃溫箱中)；清洗后滴加DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核2 min；常規(guī)梯度酒精和二甲苯脫水封片，于顯微鏡下觀察，細(xì)胞膜和胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性表達(dá)(具體操作參照免疫組化試劑盒說明書，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司).

本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)，由病理科醫(yī)生協(xié)同取材、制片及數(shù)據(jù)統(tǒng)計工作.

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

本研究結(jié)果顯示：Ki-67在對照組中陽性率均<1%，低級別組陽性率為10%～20%，高級別組陽性率為30%～50%；60 例膠質(zhì)瘤中p53陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核，20例正常腦組織大部分呈陰性表達(dá)，陽性表達(dá)率僅為2.25%±1.41%；Ⅲ～Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤組織p53陽性表達(dá)率高于Ⅰ～Ⅱ級，分別為72.00%±16.58%、33.50%±13.09%，Ki-67及p53表達(dá)率在3組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Vim在對照組中僅2例陽性表達(dá)，陽性率僅為10%；低級別膠質(zhì)瘤組有10例表達(dá)Vim，陽性率為50%；高級別膠質(zhì)瘤組有18例表達(dá)Vim，陽性率為90%，提示隨著膠質(zhì)瘤病理分級的增高Vim表達(dá)率也增高，提示其預(yù)后不良.

本研究結(jié)果顯示：病理分級程度越高，Ki-67、 p53、Vim的表達(dá)也隨著腫瘤惡性程度的增高而增高.見表1.

表1 各組Ki-67、p53、Vim的表達(dá)結(jié)果Tab.1 Expression results of KI-67，p53 and Vim in each group

3 討 論

腦膠質(zhì)瘤是由大腦和脊髓膠質(zhì)細(xì)胞癌變所產(chǎn)生的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤之一，是顱內(nèi)和椎管內(nèi)最常見的一類神經(jīng)上皮組織腫瘤，以星形膠質(zhì)瘤最常見，占神經(jīng)上皮性腫瘤的60%～80%.腦膠質(zhì)瘤主要的生物學(xué)行為為侵襲性生長，增殖迅速，易復(fù)發(fā)，死亡率高，預(yù)后較差.膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制目前還不十分清楚，但腫瘤的發(fā)生與基因、環(huán)境、電離輻射密切相關(guān).

有研究[3]表明：一些已知的遺傳疾病，如患有神經(jīng)纖維瘤病以及結(jié)核性硬化疾病的患者易發(fā)生膠質(zhì)瘤.此外，電離輻射，如手機(jī)的使用也可能與膠質(zhì)瘤的產(chǎn)生密切相關(guān).低級別膠質(zhì)瘤(Ⅰ～Ⅱ級)常見的類型有纖維型星形細(xì)胞瘤、毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤和肥大細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤等.在高級別膠質(zhì)瘤中，間變性星形細(xì)胞瘤(Ⅲ級)和多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBN，Ⅳ級)最常見.膠質(zhì)瘤的臨床治療多以手術(shù)治療為主、聯(lián)合術(shù)后放療和化療為輔的綜合治療，且級別不同的膠質(zhì)瘤治療原則差異很大.低級別膠質(zhì)瘤主張安全有效且最大范圍的切除病灶，術(shù)后輔助放療，口服替莫唑胺(TMZ)6個療程，術(shù)后同步進(jìn)行放療.高級別膠質(zhì)瘤患者由于腫瘤的生長呈彌漫性、浸潤性生長，與周圍神經(jīng)組織分界不清，因此，即使進(jìn)行手術(shù)也不易完全切除，術(shù)后需根據(jù)病理分型進(jìn)行規(guī)范性的放化療，以提高患者的機(jī)體免疫能力，有效控制腫瘤生長，延緩腫瘤復(fù)發(fā)，延長患者生命.腦膠質(zhì)瘤術(shù)后極易復(fù)發(fā)，進(jìn)一步危及患者的生命，預(yù)后不良，因此，膠質(zhì)瘤的治療需要多學(xué)科合作，采用個體化綜合治療，并規(guī)范和優(yōu)化合理的治療方案.

Ki-67抗原是一種在人類中由MKI67基因(由單克隆抗體Ki-67識別的抗原)編碼的蛋白質(zhì)，也是一種核蛋白，是與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白質(zhì).此外，它還與核糖體RNA轉(zhuǎn)錄有關(guān).Ki-67抗原的失活導(dǎo)致核糖體RNA合成受到抑制[4].Ki-67是目前公認(rèn)的用于檢測細(xì)胞增殖活性較為準(zhǔn)確、理想的抗原[5]，是細(xì)胞增殖的標(biāo)記.Ki-67主要標(biāo)記在細(xì)胞周期G1、S、M和G2期，但G0期不表達(dá).有研究[6-7]表明：腫瘤組織的Ki-67增殖指數(shù)與腫瘤的分化程度、侵襲能力及預(yù)后均密切相關(guān).本研究結(jié)果顯示：Ki-67在對照組中陽性率<1%，低級別組多在10%～20%之間，高級別組則在30%～50%之間，表明Ki-67與膠質(zhì)瘤的病理分級及惡性程度呈正相關(guān).膠質(zhì)瘤級別越高，Ki-67的陽性表達(dá)率亦越高，且預(yù)后越差.由此可見，免疫組化Ki-67可對腫瘤病理分級和細(xì)胞膜侵襲能力提供臨床依據(jù)，為救治患者提供有利的實驗室支持[5-6].

p53是目前公認(rèn)與人類多數(shù)腫瘤密切相關(guān)的抑癌基因，是膠質(zhì)瘤研究最多的生物學(xué)標(biāo)志物之一.p53基因位于染色體17P13.1，全長20 kb，其編碼產(chǎn)物為分子量53 KDa的p53蛋白[8]，包括野生型與突變型[9].當(dāng)細(xì)胞的DNA受到射線、電離輻射及抗癌劑等損傷時，p53蛋白可誘導(dǎo)p21蛋白表達(dá)，與細(xì)胞周期的各種轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生抑制作用，其結(jié)果是細(xì)胞在細(xì)胞周期的G1期停止，或修復(fù)損傷的DNA，或?qū)е伦陨硭劳?SIDRANSKY D等[10]研究發(fā)現(xiàn)：腦膠質(zhì)瘤的進(jìn)展與p53基因突變細(xì)胞的克隆增殖有關(guān)，即膠質(zhì)母細(xì)胞瘤有兩種發(fā)生方式，一種為進(jìn)展性途徑，是由帶有p53基因異常的低級別膠質(zhì)瘤再加上其他基因異常而進(jìn)展成高級別膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，也就是低級別膠質(zhì)瘤向膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的惡性轉(zhuǎn)化.另一種為始發(fā)途徑，是指沒有p53基因突變，但有第10號染色體的雜合性缺失(LOH)和EGFR基因擴(kuò)增，并且一發(fā)病就直接為高級別膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[11].本研究結(jié)果顯示：通過對p53蛋白的檢測，證實了突變型p53與腫瘤的分級程度、侵襲能力和復(fù)發(fā)有關(guān)，是腫瘤分級及預(yù)后的重要指標(biāo).由此可見，p53參與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展，可作為判斷腫瘤惡性程度的客觀指標(biāo).

波形蛋白(Vimentin)是一種分子量為57 kD的中間絲纖維蛋白，主要分布于間葉細(xì)胞及其起源的腫瘤，但近年來的研究[12-14]發(fā)現(xiàn)：Vim可作為一種腫瘤標(biāo)志物，與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)，是目前較為確定的間質(zhì)瘤標(biāo)志物之一，也是腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要分子基礎(chǔ).包陸君等[15]發(fā)現(xiàn)：Vim在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)明顯高于正常腦組織，提示腫瘤細(xì)胞為分化不成熟的星形細(xì)胞.另外，Vim也被證實參與了調(diào)控腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移，可為膠質(zhì)瘤分級診斷及預(yù)后評估提供參考.本研究結(jié)果顯示：對照組中僅2例表達(dá)Vim，陽性率為10%；低級別膠質(zhì)瘤組有10例表達(dá)Vim，陽性率為50%；高級別膠質(zhì)瘤組有18例表達(dá)Vim，陽性率為90%.由此可見，Vim隨著膠質(zhì)瘤病理分級的增高表達(dá)率也增高，提示其預(yù)后不良.

綜上所述，腦膠質(zhì)瘤組織中Ki-67、p53及Vim均呈高表達(dá)，且隨著病理分級的增加而顯著增加，提示這些抗原標(biāo)記物的表達(dá)在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生、進(jìn)展、預(yù)后及治療中發(fā)揮重要作用.我們在實際工作中通過分析上述3項指標(biāo)的表達(dá)情況，可輔助臨床及病理醫(yī)生對腫瘤進(jìn)行病理分級，以便明確其發(fā)病機(jī)制，提前干預(yù)，為腦膠質(zhì)瘤患者的診斷、治療及預(yù)后評估提供參考.