王 珊，林昱芷，盧學(xué)春，仲懷宇，孫佳慧，安麗萍，杜培革，孫晶波

(1.北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院，北京 100853)

地梢瓜(Cynanchumthesioides(Freyn).K.Schum.)為蘿摩科鵝絨藤屬多年生草本植物，其全草及果實(shí)均可入藥.《蒙藥正典》最早記載的是果實(shí)入藥，其具有清腑熱、止瀉之功效.《河南中草藥手冊(cè)》及《現(xiàn)代本草綱目》記載地梢瓜具有補(bǔ)肺氣、清熱降火、生津止渴、消炎止痛等功效[1].通過文獻(xiàn)檢索，僅有針對(duì)其基本成分結(jié)構(gòu)鑒定[2-3]及地梢瓜苷活性的研究[4-7]，尚未見其抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理作用的相關(guān)研究.因此，本研究對(duì)長(zhǎng)白山地區(qū)地梢瓜的抗炎、鎮(zhèn)痛活性成分進(jìn)行提取、純化，進(jìn)一步通過體內(nèi)試驗(yàn)探索其作用機(jī)制，為地梢瓜有效部位的開發(fā)應(yīng)用提供參考.

1 儀器與材料

ICR雄性小鼠(長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK (吉)-2016-0003)；植物樣品(吉林省長(zhǎng)白山地區(qū))經(jīng)吉林市食品藥品檢驗(yàn)所金英蘭教授鑒定為蘿摩科植物地梢瓜.

UV-2550型紫外分光光度計(jì)(島津公司，日本)；Infinite M200型全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(NanoQuant公司，瑞士)；YLS-6B型智能熱板儀(上海精密儀器儀表有限公司)；齊墩果酸、蘆丁對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)；AB-8 型大孔吸附樹(沈陽鼎國(guó)生物試劑有限公司)；乙醇、醋酸等分析純?cè)噭?吉林市欣利化學(xué)試劑有限公司).

2 方 法

2.1 總?cè)坪涂傸S酮的提取及制備

取鮮地梢瓜果殼適量，加10倍量70%乙醇，回流提取3次，1.5 h/次，合并提取液，回收溶劑，蒸干，稱重.將提取物加蒸餾水溶解制成濃度為2 mg/mL的溶液，選用AB-8型大孔吸附樹脂濕法上柱，吸附2 h后依次以2倍柱體積的蒸餾水和25%乙醇洗脫，棄去洗脫液；再以5倍柱體積的80%乙醇洗脫，洗脫液濃縮干燥即得總?cè)?total triterpenoids，TTP)[8].

取地梢瓜果殼適量，加20倍量石油醚回流提取1 h，過濾，濾渣揮干石油醚后再用堿性(pH=9)70%乙醇回流提取2次，1 h/次；合并提取液并調(diào)至中性(pH=7)，回收溶劑后以80%乙醇溶解，于4 ℃條件下靜置24 h，過濾，將濾液濃縮、干燥，即得總黃酮(total flavonoids，TFN)[9].

2.2 總?cè)坪涂傸S酮的急性毒性研究

2.2.1 總?cè)频募毙远拘匝芯?/p>

取一定數(shù)目的小鼠進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，確定其中總?cè)平M小鼠全部致死的最小劑量及小鼠全部成活的最大劑量，給藥范圍為20.24～11.28 g/kg.根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選取60只小鼠，雌雄各半，隨機(jī)平均分為6組，給藥組分別給藥20.10、17.47、15.11、13.06、10.00 g/kg，對(duì)照組為等體積的生理鹽水，試驗(yàn)前禁食不禁水8 h，按照設(shè)置劑量灌胃給藥，觀察7 d內(nèi)各組小鼠死亡情況，結(jié)果用改進(jìn)寇式法計(jì)算半數(shù)致死量(LD50)及其95%可信區(qū)間[10]：

logLD50=xm-i(∑P-0.5)，

其中：xm為最大劑量的對(duì)數(shù)；i為相鄰前后兩組劑量的對(duì)數(shù)差；∑P為各組死亡率的總和.均取以10為底的對(duì)數(shù).

2.2.2 總黃酮的急性毒性研究

取一定數(shù)目的小鼠進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，給藥劑量的選取范圍為54.64～25.28 g/kg.選取60只小鼠，雌雄各半，隨機(jī)平均分為6組，給藥組分別給藥55.19、44.79、37.01、30.59、25.00 g/kg，給藥方式及數(shù)據(jù)處理同2.2.1，計(jì)算LD50及其95%可信區(qū)間.

2.3 總?cè)坪涂傸S酮的抗炎作用

2.3.1 二甲苯致小鼠耳腫脹試驗(yàn)

將72只ICR雄性小鼠隨機(jī)平均分為9組，空白對(duì)照組、模型組、陽性對(duì)照組、總?cè)聘?、中、低劑量組(分別為132、66、33 mg/kg)和總黃酮高、中、低劑量組(分別為196、98、49 mg/kg).給藥組按劑量連續(xù)灌胃給藥7 d，模型組灌胃等體積生理鹽水(0.1 mL/10 g)，陽性對(duì)照組和空白組不給藥.給藥組末次給藥40 min、陽性對(duì)照組皮下注射25 mg/kg地塞米松40 min后，除空白對(duì)照組外，各組小鼠右耳正反兩面均勻涂抹25 μL二甲苯致炎[11]，左耳做空白對(duì)照.

致炎1 h后，各組小鼠眼眶取血，5 000 r/min離心10 min，分離血清，按照試劑盒說明書步驟檢測(cè)TNF-α和IL6含量.

將取血后的小鼠處死，剪下雙耳，用自動(dòng)打孔器于小鼠左右耳對(duì)稱處打下耳片，稱重并計(jì)算各組小鼠耳腫脹度和腫脹抑制率：

腫脹度(mg)=右耳重(mg)-左耳重(mg)，

2.3.2 蛋清溶液致小鼠足趾腫脹的試驗(yàn)

選用64只ICR雄性小鼠，隨機(jī)平均分為8組，分組及給藥與2.3.1相同，但無空白對(duì)照組.給藥組末次給藥60 min、陽性對(duì)照組皮下注射25 mg/kg地塞米松40 min后，于右后跖皮下注射1%蛋清溶液5 μL，注射3 h后測(cè)量各小鼠右后跖厚度，計(jì)算小鼠致炎前后的足腫脹度及抑制率[12-13]：

腫脹度(mm)=致炎后小鼠右后跖厚度(mm)-致炎前小鼠右后跖厚度(mm)，

2.3.3 智能熱板致小鼠的熱板疼痛性試驗(yàn)

將智能熱板儀的溫度調(diào)節(jié)到(60±5) ℃，分別測(cè)定給藥前每只小鼠的正常痛閾值：以小鼠置于熱板上開始舔跖后足或出現(xiàn)跳躍現(xiàn)象所需要的時(shí)間作為痛閾值[14]，共測(cè)3次，間隔40 min/次，取3次痛閾值的平均值作為該小鼠的給藥前痛閾值.選取痛閾值在10～40 s的64只雄性ICR小鼠進(jìn)行正式試驗(yàn).分組及給藥方法同2.3.2，分別測(cè)定末次給藥后30、60、90、120 min各個(gè)小鼠的痛閾值.若小鼠超過1 min無反應(yīng)，則將該小鼠取出.

2.3.4 醋酸致小鼠扭體試驗(yàn)

將64只ICR雄性小鼠隨機(jī)分為8組，分組及給藥方法同2.3.2.末次給藥60 min后，給小鼠腹腔注射0.7%冰醋酸溶液0.15 mL，觀察并記錄小鼠腹腔注射冰醋酸溶液15 min內(nèi)出現(xiàn)扭體反應(yīng)的時(shí)間及次數(shù)，并計(jì)算其疼痛抑制率：

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果與分析

3.1 地梢瓜總?cè)坪涂傸S酮的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)改良寇氏法計(jì)算得總?cè)频腖D50為14.62 g/kg，95%可信區(qū)間為12.09～20.34 g/kg；總黃酮的LD50為23.39 g/kg，95%可信區(qū)間為20.53～28.31 g/kg.

3.2 地梢瓜總?cè)坪涂傸S酮對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

與模型組比較，不同劑量的地梢瓜總?cè)坪涂傸S酮均能減輕二甲苯所致小鼠右耳的紅、腫等癥狀，且隨著給藥劑量的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng).其中，總?cè)聘邉┝拷M和總黃酮中、高劑量組與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與低劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)，但有減輕趨勢(shì).整體上，總黃酮抑制小鼠耳腫脹的效果相對(duì)優(yōu)于總?cè)?見表1.

表1 地梢瓜總?cè)坪涂傸S酮對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的抑制作用Tab.1 Inhibitory effects of TTP and TFN of Cynanchum thesioides on xylene-induced ear swelling of mice

3.3 地梢瓜總?cè)坪涂傸S酮對(duì)蛋清致小鼠足趾腫脹的影響

與模型組比較，不同劑量的地梢瓜總?cè)坪涂傸S酮對(duì)蛋清所致小鼠足腫脹均有抑制作用，且隨著給藥劑量的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)，其中，高劑量組與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).整體上，總黃酮對(duì)蛋清溶液致小鼠足趾腫脹的作用效果相對(duì)優(yōu)于總?cè)?見表2.

表2 地梢瓜總?cè)坪涂傸S酮對(duì)蛋清溶液致小鼠足趾腫脹的抑制作用Tab.2 Inhibitory effect of TTP and TFN of Cynanchum thesioides on the toe swelling of mice induced by egg white solution inparagraph

3.4 地梢瓜總?cè)坪涂傸S酮對(duì)小鼠血清中炎癥因子水平的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中TNF-α和IL-6含量均顯著升高(P<0.01)，表明炎癥模型建立成功.與模型組比較，總?cè)坪涂傸S酮給藥組均能降低小鼠血清中TNF-α和IL-6的含量，且隨著給藥劑量的增加其作用增強(qiáng)，高劑量組的作用明顯(P<0.05)，整體上總黃酮降低炎癥小鼠血清中TNF-α水平的作用更顯著，而總?cè)苿t降低IL-6水平的作用更強(qiáng)(低劑量組P<0.05，中、高劑量組P<0.01).總?cè)聘邉┝拷M和總黃酮中、高劑量組小鼠血清TNF-α水平與空白組小鼠無顯著性差異(P>0.01)，說明這3組藥物均可使炎癥小鼠血清TNF-α降至正常水平；而所有給藥組小鼠血清IL-6水平與空白對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明地梢瓜總?cè)坪涂傸S酮雖然可以降低炎癥小鼠血清中IL-6的含量，但不能恢復(fù)至正常水平，地塞米松也無法使其降至正常水平(P<0.01).見表3.

表3 各組小鼠血清中TNF-α和IL-6的含量Tab.3 Contents of TNF-α and IL-6 in serum of mice in each group

3.5 智能熱板致小鼠的熱板疼痛性試驗(yàn)

給藥前各組間基礎(chǔ)痛閾值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).與模型組比較，各給藥組均不同程度延長(zhǎng)了小鼠的痛閾值，其中，總?cè)坪涂傸S酮高劑量組在給藥后30 ～120 min的痛閾值均極顯著延長(zhǎng)，而且總黃酮高劑量組痛閾值較陽性對(duì)照組長(zhǎng)，說明其具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛活性.見表4.

表4 地梢瓜總?cè)坪涂傸S酮對(duì)小鼠熱板性疼痛的影響Tab.4 Effects of TTP and TFN of Cynanchum thesioides on hot plate pain in mice

3.6 醋酸致小鼠扭體試驗(yàn)

與模型組比較，不同劑量的地梢瓜總?cè)坪涂傸S酮均能減少醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù).其中，總?cè)坪涂傸S酮高劑量組與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其他給藥組之間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明這兩種有效部位均有較好的鎮(zhèn)痛作用.見表5.

表5 地梢瓜總?cè)坪涂傸S酮對(duì)醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響Tab.5 Effects of TTP and TNF of Cynanchum thesioides on the writhing response of mice induced by acetic acid

4 討 論

地梢瓜中含有黃酮、三萜、甾體、酚酸[15]等化合物，有研究[16-17]表明：黃酮類化合物具有活血化瘀、保肝抗炎、抗病毒、抗輻射、抗菌等功效，三萜類化合物具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗菌、降低膽固醇等生理活性.因此，本研究以地梢瓜中的總黃酮、總?cè)茷閷?duì)象，研究其提取純化工藝、含量測(cè)定方法及抗炎鎮(zhèn)痛活性.通過適宜的提取、純化方法富集有效部分，其中地梢瓜總?cè)坪繛?3.9%，總黃酮含量達(dá)到51.2%，表明地梢瓜中三萜和黃酮類化合物含量較高，采用本研究方法能很好富集.炎癥反應(yīng)為機(jī)體對(duì)損傷因子產(chǎn)生的防御性反應(yīng)，常表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛等癥狀[18]，是機(jī)體對(duì)有害刺激所產(chǎn)生的復(fù)雜的病理、生理反應(yīng)[19]，這些反應(yīng)受多種炎癥因子和炎性介質(zhì)的調(diào)控，存在于許多重大疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中[20-21].疼痛是由高級(jí)中樞對(duì)傷害性刺激進(jìn)行整合，傷害性刺激產(chǎn)生相應(yīng)的主觀體驗(yàn)，進(jìn)而改變了大腦區(qū)域之間的信息流動(dòng)和整合.當(dāng)機(jī)體受到外界刺激或損傷時(shí)，會(huì)將其轉(zhuǎn)化為傷害性信息，由傷害性傳入通路再傳入中樞神經(jīng)系統(tǒng)[22]，從而產(chǎn)生痛覺.因此，抗炎、鎮(zhèn)痛藥物的研究是當(dāng)前熱門研究領(lǐng)域之一.

本研究在致炎試驗(yàn)中，使用二甲苯和1%蛋清致使小鼠產(chǎn)生炎癥.在小鼠耳腫脹試驗(yàn)及足腫脹試驗(yàn)中觀察到：不同劑量的總黃酮和總?cè)茖?duì)小鼠炎癥均有較強(qiáng)的抑制作用，且隨著給藥劑量的增加，其抑制作用逐漸增強(qiáng)，總體上看，地梢瓜的總黃酮對(duì)小鼠炎癥的抑制作用強(qiáng)于總?cè)?檢測(cè)小鼠血清中炎癥因子水平的結(jié)果表明：總黃酮和總?cè)凭芙档托∈笱逯蠺NF-α和IL-6的含量，且隨著給藥劑量的增加其作用也增強(qiáng)，表明地梢瓜總黃酮和總?cè)频目寡鬃饔脵C(jī)制可能與其抑制血清中TNF-α和IL-6水平升高有關(guān).在醋酸扭體試驗(yàn)中，不同劑量的總?cè)坪涂傸S酮對(duì)試驗(yàn)小鼠均有明顯的鎮(zhèn)痛作用，整體上總?cè)频逆?zhèn)痛效果強(qiáng)于總黃酮.而在熱板試驗(yàn)中，兩種有效部位均能延長(zhǎng)小鼠痛閾值，總黃酮的鎮(zhèn)痛效果強(qiáng)于總?cè)?兩種試驗(yàn)結(jié)果均證實(shí)了總黃酮和總?cè)频逆?zhèn)痛作用.

經(jīng)文獻(xiàn)檢索，尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)地梢瓜中總黃酮和總?cè)频难芯繄?bào)道.本研究對(duì)象為長(zhǎng)白山地區(qū)地梢瓜，符合我省有關(guān)長(zhǎng)白山地區(qū)藥用動(dòng)植物資源開發(fā)利用的政策.本文首次針對(duì)地梢瓜中總黃酮和總?cè)频奶崛　⒓兓に嚰版?zhèn)痛、抗炎作用進(jìn)行了系統(tǒng)研究：確定了地梢瓜總?cè)萍翱傸S酮的提取方法，優(yōu)化了其提取工藝，并通過動(dòng)物試驗(yàn)確定了地梢瓜中兩種有效部位的抗炎、鎮(zhèn)痛作用及其可能的作用機(jī)制.地梢瓜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值均較高，且對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性強(qiáng)，十分容易存活，可以大量的人工培植.因此，本研究為藥食兩用植物地梢瓜在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù).