林偉偉,李 娜,陳麗珊,吳則焰,林文雄**,沈荔花**

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 福州 350002; 2.福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 福州 350303)

全球人口迅速增長(zhǎng)給糧食生產(chǎn)帶來(lái)巨大壓力的同時(shí),也給環(huán)境生態(tài)和農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展帶來(lái)嚴(yán)重的影響。作物多樣化的種植體系,例如作物間套作,是發(fā)展可持續(xù)農(nóng)業(yè)的可行性策略,也是南方多熟種植制的主要 技術(shù)手段。與單作處理比較,豆科(Leguminosae)與禾本科(Gramineae)作物合理間套作,彼此對(duì)營(yíng)養(yǎng)吸收和產(chǎn)量表現(xiàn)均有明顯的互惠作用。因此,在傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)實(shí)踐中,特別是我國(guó)南方各省,人們常利用這一技術(shù)來(lái)發(fā)展多熟種植制,以提高作物復(fù)種指數(shù),達(dá)到增加產(chǎn)量的目的。張福鎖院士團(tuán)隊(duì)研究指出,在全球?qū)用嫔?間套作設(shè)計(jì)及管理有兩種不同的模式,即以糧食作物與玉米()間作和以禾谷類(lèi)作物與豆科植物混作或條播間作模式。前者在我國(guó)廣泛推廣應(yīng)用,該模式共生期短、肥料投入相對(duì)高,增產(chǎn)效應(yīng)大; 后者則在歐洲廣泛應(yīng)用,其共生期長(zhǎng)、肥料投入較低,增產(chǎn)效應(yīng)高。當(dāng)前中國(guó)應(yīng)用的100多種間作組合中,70%的組合都有豆科作物的參與。豆科禾本科間作體系作為一種可持續(xù)發(fā)展的種植模式不僅引起了許多國(guó)家的關(guān)注,而且豆科禾本科作為世界上重要的糧食作物對(duì)于保障全球糧食安全具有重要意義。豆科禾本科間作體系被廣泛應(yīng)用的原因在于豆科作物由于自身的固氮作用,能夠有效固定空氣中的氮,在與禾本科作物間作時(shí),其所固定氮素的一部分可以通過(guò)各種途徑轉(zhuǎn)移并被禾本科作物所利用,從而提高氮素的利用效率。另一方面,豆科與禾本科作物間作使得地上部以及地下部的時(shí)間、空間生態(tài)位分離,從而能夠更好地利用光、熱、水分等資源,同時(shí)挖掘土壤中不同層次的養(yǎng)分資源,達(dá)到顯著提高產(chǎn)量的優(yōu)勢(shì)。根際是養(yǎng)分、水分和有害物質(zhì)進(jìn)入作物系統(tǒng),參與食物鏈物質(zhì)循環(huán)的必經(jīng)之門(mén)戶,因此它是植物-土壤-微生物相互作用的重要界面,已成為近年來(lái)人們關(guān)注的重點(diǎn)領(lǐng)域。

前人對(duì)禾本科與豆科作物間套作體系增產(chǎn)機(jī)制的研究多集中于補(bǔ)償效應(yīng),即從資源利用生態(tài)位分化和種間互惠方面解釋增產(chǎn)效應(yīng),如玉米||蠶豆()的間作中,玉米根系生長(zhǎng)深度高于蠶豆,而蠶豆根系深度更淺,所以它們存在生態(tài)位互補(bǔ)效應(yīng)。從中不難看出,這是基于作物間套作的土地當(dāng)量比研究增產(chǎn)效果的。但土地當(dāng)量比,因該常數(shù)具有無(wú)量綱特性,所以很難直觀地反映間套作比單作在單位面積上的產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)。近年來(lái),研究認(rèn)為,種間互惠現(xiàn)象在作物間作中更多體現(xiàn)為養(yǎng)分資源利用有效性。比如玉米與蠶豆合理間作,其中豆科作物蠶豆的根系能分泌化感活性物質(zhì),如一些小分子有機(jī)酸和質(zhì)子等,活化土壤中難溶性磷元素,提高禾本科作物玉米對(duì)土壤中磷元素的吸收能力。選擇和補(bǔ)償效應(yīng)的貢獻(xiàn)在不同間作體系間存在差異,在礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的獲取上,玉米||蠶豆主要依賴于補(bǔ)償效應(yīng),而玉米||鷹嘴豆()在磷獲取上既有選擇效應(yīng),也有補(bǔ)償效應(yīng)。可見(jiàn),種植制度可有效調(diào)節(jié)作物間的生態(tài)互惠關(guān)系。

近年來(lái)研究認(rèn)為,豆科禾本科間作作為不同作物種類(lèi)組合而成的復(fù)合群體,對(duì)根際微生物數(shù)量、生物量及種群結(jié)構(gòu)和多樣性有很大影響。沈雪峰等在對(duì)甘蔗()花生()間作系統(tǒng)的研究得出,間作與單作相比能夠顯著提高花生和甘蔗根際土壤細(xì)菌及真菌的數(shù)量。章家恩等研究表明,間作能顯著提高玉米和花生根區(qū)的土壤細(xì)菌數(shù)量,但土壤真菌及放線菌數(shù)量只在間作玉米根區(qū)得到顯著提高。宋亞娜等在對(duì)小麥()||蠶豆間作體系的研究中發(fā)現(xiàn),根際細(xì)菌群落多樣性在小麥和蠶豆生長(zhǎng)進(jìn)入花期時(shí)得到顯著提高。陳平等研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),玉米與大豆()套作具有養(yǎng)分資源高效利用、增強(qiáng)土壤肥力和綜合高效的特點(diǎn),該團(tuán)隊(duì)研究還認(rèn)為,增強(qiáng)這兩種作物的種間根系互作能有效地促進(jìn)耗氧性作物玉米根系向水平生長(zhǎng)發(fā)展,這不僅有利于增強(qiáng)間作作物玉米對(duì)水分和養(yǎng)分的利用潛力,又能改善玉米地上部的生長(zhǎng)發(fā)育,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)增產(chǎn)目的; 然而,增強(qiáng)這兩種作物的種間根系互作,會(huì)引起共生期大豆根系在水平方向上分布減少,也不利其后期的恢復(fù)性生長(zhǎng),最終導(dǎo)致葉面積指數(shù)(LAI)下降和凈光合作用降低,分枝數(shù)、分枝莢數(shù)減少而減產(chǎn); 但玉米與大豆間作對(duì)根際微生物多樣性的影響研究還不深入。國(guó)內(nèi)外已有不少研究表明,根際土壤微生物對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育起到極其重要的作用,因而被稱(chēng)之為植物第二基因組。根際土壤中龐大的微生物群落彼此形成生命共同體,深刻影響著共生生物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。這是由于根際微生物組能夠直接與植物形成共生、寄生或腐生關(guān)系,或者通過(guò)促進(jìn)土壤有機(jī)質(zhì)分解和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化,參與土壤中生物地球化學(xué)過(guò)程和生物養(yǎng)分小循環(huán),進(jìn)而影響植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)養(yǎng)分的吸收和生命過(guò)程。同時(shí),植物對(duì)根系微生物具有選擇性,微生物群落的變化也能夠影響宿主植物及其共生生物,導(dǎo)致不同的土壤反饋效應(yīng)。因此,充分理解土壤微生物對(duì)間(混)作體系種間互作和多樣性-生產(chǎn)力關(guān)系的調(diào)節(jié)機(jī)制,對(duì)于優(yōu)化作物系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、提高復(fù)合作物群體產(chǎn)量和光溫等資源利用效率、發(fā)展綠色高質(zhì)量農(nóng)業(yè)具有重要意義。

Biolog ECO生態(tài)板技術(shù)是利用四唑紫在獲得電子后顏色變化的特征來(lái)監(jiān)控和評(píng)價(jià)微生物對(duì)特定底物的代謝能力。由于土壤中的微生物通過(guò)呼吸作用,氧化其所吸收的底物以獲得能量,該過(guò)程中所產(chǎn)生的電子則易于被四唑紫吸收,從而指示微生物利用底物的過(guò)程和程度。然而,由于可培養(yǎng)的土壤微生物不到1%,因而采用這種方法有一定的局限性。應(yīng)用分子生物學(xué)方法可以克服上述方法的不足。末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(T-RFLP)是一種描述性的指紋圖譜技術(shù),基于不同小亞基rRNA基因序列類(lèi)型之間的末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。該技術(shù)可以從分子水平全面地分析包括細(xì)菌和真菌在內(nèi)的土壤微生物群落種類(lèi)和功能,可實(shí)現(xiàn)土壤微生物的原位測(cè)定,同時(shí)具有操作簡(jiǎn)便、高通量以及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。前人研究認(rèn)為連作會(huì)導(dǎo)致土壤微生物種類(lèi)從營(yíng)養(yǎng)豐富型的細(xì)菌性菌群向營(yíng)養(yǎng)貧乏型的真菌性菌群轉(zhuǎn)變,禾本科與豆科作物間套種的根際土壤微生物變化方向則相反,即以營(yíng)養(yǎng)豐富型的細(xì)菌菌群為主。然而玉米與大豆間作互惠的機(jī)制是什么,盡管前人已從營(yíng)養(yǎng)生理學(xué)角度作了深入研究,但這種種間互作的根際微生物特性還有待進(jìn)一步研究與揭示。據(jù)此,本研究通過(guò)局部控制方法,設(shè)置無(wú)隔、網(wǎng)隔、全隔和對(duì)照(單作)處理,由此產(chǎn)生地下部不同的種間根系互作環(huán)境,并借助BIOLOG和T-RFLP等技術(shù)方法,深入研究玉米||大豆種間互作對(duì)根際細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)的影響及其與產(chǎn)量的關(guān)系,以期為深入理解特定作物間套作模式的產(chǎn)量效應(yīng)和根際微生態(tài)特性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地與供試材料

試驗(yàn)地位于福建省莆田市大洋鄉(xiāng)瑞云村( 25°43′E,119°5′N(xiāo),海拔328 m)福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)習(xí)基地。供試土壤類(lèi)型為棕紅壤,土壤肥力良好。其中,pH 6.48,速效氮123.68 mg·kg、速效磷25.06 mg·kg、速效鉀80.09 mg·kg。

在2015年3月31日播種前,以復(fù)合肥為基肥,施肥量占總施用量(300 kg·hm)的50%,其余用作追肥,于玉米拔節(jié)期之前一次性施用。復(fù)合肥中三要素含量N、P、K均為15% (即三者比例為1∶1∶1)。試驗(yàn)期間,在玉米拔節(jié)期、大豆分枝期和玉米、大豆的花期分別進(jìn)行定量灌溉和人工除草。

供試玉米品種為廣泛推廣的‘花糯66’雜交玉米品種; 大豆品種為當(dāng)?shù)爻Ｓ秘S產(chǎn)品種‘閩豆1711’,株型直立,抗病性好。

1.2 間作比例和分隔試驗(yàn)設(shè)計(jì)

最佳作物間作比例的確定: 2014年8月進(jìn)行田間試驗(yàn)。玉米和大豆株行比參考劉朝茂等分別設(shè)置為2∶2、2∶3和2∶4,每小區(qū)條播玉米兩條帶,大豆為2、3、4條帶,其中大豆株行距為35 cm×35 cm,玉米為30 cm×30 cm,玉米和大豆的行間距為35 cm。每組試驗(yàn)處理重復(fù)3次,進(jìn)行大豆||玉米最優(yōu)株行篩選。結(jié)果認(rèn)為玉米與大豆間作以2∶3株行比下產(chǎn)量最高,其土地當(dāng)量比(LER)最大。據(jù)此本試驗(yàn)采用這一間作的最佳行比2∶3。

玉米||大豆根系分隔試驗(yàn)設(shè)計(jì): 試驗(yàn)于2015年3月進(jìn)行。采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì),試驗(yàn)重復(fù)3次。試驗(yàn)地共設(shè)15個(gè)種植小區(qū),每個(gè)小區(qū)10 m。玉米||大豆相鄰株間分別采用塑料隔膜使種間根系全部隔離(簡(jiǎn)稱(chēng)“全隔”,polythene film barrier,PB; 使根系、根系分泌物質(zhì)以及根際微生物無(wú)法通過(guò))、300目尼龍網(wǎng)隔離(簡(jiǎn)稱(chēng)網(wǎng)隔,mesh barrier,MB; 保證種間根系不會(huì)互穿,但種間根系分泌物可以相互交流)和未隔離(簡(jiǎn)稱(chēng)無(wú)隔,no barrier,NB; 種間根系可以互穿)3種處理(圖1)。在2015年3月31日大豆和玉米同時(shí)播種,其中單作玉米株行距為35 cm×35 cm,大豆為30 cm×35 cm,每穴留1棵秧苗。為計(jì)算土地當(dāng)量比,分別以單作玉米(monoculture maize,MM)和單作大豆(monoculture soybean,MS)為對(duì)照,種植密度和水肥管理與上述保持一致。

圖1 大豆和玉米間作不同分隔處理模式圖Fig.1 Intercropped patterns of soybean and maize under different separating treatments

1.3 樣品采集

于2015年采用五點(diǎn)取樣法采集田間土壤樣本,每處理取樣3次。在玉米和大豆分別進(jìn)入成熟期和鼓粒期時(shí),采用鏟子收集玉米和大豆表層0～5 cm的土壤,然后用鏟子挖出玉米和大豆根部,采集緊貼在根表面的根際土。各處理隨機(jī)選2個(gè)間作帶,各取帶內(nèi)3株作物。收集的土壤樣品過(guò)2 mm篩以去除石頭、植物殘?bào)w和雜物等后,立即放入—80 ℃超低溫冰箱保存,用于后期的試驗(yàn); 另外一部分用于土壤化學(xué)性質(zhì)測(cè)定。

1.4 土壤有效養(yǎng)分測(cè)定

對(duì)處理土壤樣本進(jìn)行土壤氮、磷、鉀有效養(yǎng)分含量的測(cè)定,測(cè)定方法均參照關(guān)松蔭的方法。

1.5 間作作物產(chǎn)量測(cè)定

在大豆和玉米收獲前3 d (2015年7月31日)取樣測(cè)產(chǎn),采集每個(gè)小區(qū)的全部玉米穗并人工脫粒,分別裝好袋子并標(biāo)記,烘干稱(chēng)重,計(jì)算單位面積產(chǎn)量。同樣隨機(jī)收割每個(gè)小區(qū)大豆,分別裝好袋子和標(biāo)記,烘干稱(chēng)重,計(jì)算單位面積產(chǎn)量。

土地當(dāng)量比(land equivalent ratio,LER)計(jì)算如下:

式中:、分別為間作玉米和大豆的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量,和分別是為單作玉米和大豆的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量。LER＞1為間作優(yōu)勢(shì),LER＜1為間作劣勢(shì)。

1.6 根際土壤細(xì)菌群落測(cè)定

1.6.1 BIOLOG ECO微平板測(cè)定法

取上述待測(cè)不同處理的大豆和玉米根際土壤樣本,采用BIOLOG ECO微平板法進(jìn)行試驗(yàn)操作: 稱(chēng)取5 g新鮮根際土置于滅菌后的三角瓶中,加入100 mL 0.15 mol·LNaCl無(wú)菌溶液,封口,120 r·min恒溫振蕩器中震蕩30 min,冰浴,靜置5 min。取上清液5 mL于滅菌的100 mL三角瓶中,加入45 mL上述無(wú)菌水,重復(fù)稀釋3次,制得1∶1000的提取液,用于ELSIA反應(yīng)。將BIOLOG ECO平板預(yù)熱到25 ℃,用移液器取150 μL提取液于各個(gè)孔中,28 ℃恒溫培養(yǎng),在0 d、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d和7 d用ELISA反應(yīng)平板讀數(shù)器讀取590 nm的吸光值。

1.6.2 T-RFLP測(cè)定法

土樣DNA提取: 取上述同一處理的土樣提取土樣DNA,提取方法參照Bioflux公司生產(chǎn)的土壤DNA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行,并保存于—80 ℃冰箱。

PCR擴(kuò)增: 引物序列為27F-FAM (5′-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACC TTG TTACGACTT-3′),其中27F的5′端以熒光染料FAM標(biāo)記。試驗(yàn)使用PCR擴(kuò)增儀,使用的反應(yīng)體系為50 μL體系: 1.0 μL 1492R,1.0 μL 27F,1.0 μL模板DNA,1.0 μL DMSO,1.0 μL BSA,25 μL 2×Taq Mix,20 μL ddHO。擴(kuò)增條件: 94 ℃變性l min,56 ℃退火45 s,72 ℃延伸1.6 min,35個(gè)循環(huán); 第一步94 ℃預(yù)變性5 min,最后一步結(jié)束于72 ℃,繼保溫10 min,4 ℃保存。之后PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收,并采用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè),按照美國(guó)Omega Bio-Tek公司生產(chǎn)說(shuō)明書(shū)的膠回收試劑盒的方法步驟進(jìn)行回收。

PCR產(chǎn)物酶切: 純化回收的16s rRNA片段采用4種限制性內(nèi)切酶(MspⅠ、HaeⅢ、AfaⅠ、AluⅠ)[這4種酶購(gòu)于寶生物工程(大連)公司]進(jìn)行4酶切,MspⅠ 或 AfaⅠ的酶切體系(20 μL)為: 10 μL目的片段(0.6～0.8 μg),2 μL 10×T buffer,2 μL 0.1% BSA(TAKARA BIO,Otsu,Japan),1 μL MspⅠ或AfaⅠ (10 U),5 μL ddHO。HaeⅢ或AluⅠ的酶切體系(20 μL)為:10 μL目的片段(0.6～0.8 μg),2 μL 10×L buffer,1 μL MspⅠ或AfaⅠ (10 U),7 μL ddHO。放于37 ℃水浴鍋中進(jìn)行酶切4～5 h,同時(shí)在酶切過(guò)程中注意避光。由北京諾禾公司測(cè)序。

1.7 數(shù)據(jù)分析

土壤細(xì)菌群落ELISA反應(yīng)采用BIOLOG平板每孔顏色平均變化率(average well color development,AWCD)表示,并參照植物生態(tài)學(xué)方法計(jì)算Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)和McIntosh指數(shù),以比較不同樣品的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)相似性。數(shù)據(jù)整理采用Excel 2010,采用DPS 7.05軟件進(jìn)行單因素方差分析,多重比較用LSD法(＜0.05),主成分分析(PCA)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行。

T-RFLP分析的原始數(shù)據(jù)采用Gene Marker V1.2軟件(Soft Genetics LLC,PA,USA)進(jìn)行圖譜分析。每個(gè)T-RF的豐度百分比(P)按照以下公式計(jì)算:

式中:表示每個(gè)可分辨的T-RF片段的峰面積,表示所有T-RF片段峰面積總和。Shannon-Wiener指數(shù)()、Simpson指數(shù)()及McIntosh指數(shù)()采用SPSS 20軟件進(jìn)行計(jì)算,計(jì)算公式如下:

式中:P代表每個(gè)T-RF片段的相對(duì)豐度,代表可分辨的T-RF片段總數(shù)。分析采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析使用T-RFLP Phylogenetic Assignment Tool (PAT)進(jìn)行細(xì)菌限制性片段(T-RFs)的比庫(kù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米和大豆在不同種間根系互作下的產(chǎn)量表現(xiàn)

由表1可見(jiàn),全隔、網(wǎng)隔和無(wú)隔處理下玉米的籽粒產(chǎn)量隨根間互作的增強(qiáng)而提高,其中無(wú)隔處理比單作對(duì)照顯著提高61.02% (＜0.05)。玉米的百粒重與其籽粒產(chǎn)量表現(xiàn)一致,各處理均高于單作,無(wú)隔和網(wǎng)隔處理下百粒重比單作百粒重提高21.88%和19.48%(＜0.05)。

表1 種間根系分隔處理對(duì)間作玉米和大豆籽粒產(chǎn)量、百粒重和土地當(dāng)量比的影響Table 1 Effects of partition patterns of interspecific roots on grain yield,hundred-grain weight and land equivalent ratio of intercropped soybean and maize

就大豆產(chǎn)量而言,較單作大豆,無(wú)隔和網(wǎng)隔處理的大豆籽粒產(chǎn)量顯著提高39.15%和46.25% (＜0.05),而全隔處理則差異不顯著; 大豆百粒重的表現(xiàn)與籽粒產(chǎn)量趨勢(shì)類(lèi)似,具體為: 網(wǎng)隔＞無(wú)隔＞全隔＞單作,其中網(wǎng)隔比單作顯著增加9.82% (＜0.05),其他處理之間差異不顯著。

就LER而言,無(wú)隔處理的LER為1.39,顯著高于其他兩個(gè)處理(＜0.05),說(shuō)明無(wú)隔處理與其他處理相比,土地資源利用效率最高,因而產(chǎn)量表現(xiàn)也最高。網(wǎng)隔處理的資源利用效率次之,其LER為1.13。全隔處理最小,為0.98,說(shuō)明其資源利用效率不及單作處理?？梢?jiàn),不同根系互作處理對(duì)復(fù)合群體地上部產(chǎn)量有明顯影響,表現(xiàn)在無(wú)隔處理的土地當(dāng)量比最高,因而其復(fù)合群體產(chǎn)量也最高,網(wǎng)隔處理(即不完全隔離處理)產(chǎn)量居中,而全隔處理(即全隔)的最低,說(shuō)明種間根系互作強(qiáng)度增強(qiáng)對(duì)作物間作產(chǎn)量具有明顯促進(jìn)作用,這可能與根系互作強(qiáng)度不同導(dǎo)致根系微生物組成差異有關(guān)。

2.2 不同種間根系互作下玉米和大豆的根際土壤細(xì)菌群落變化

在玉米與大豆間作體系中,每隔24 h測(cè)定1次AWCD值,得到其隨時(shí)間變化的動(dòng)態(tài)圖(圖2),隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),微生物對(duì)碳源的利用量增加,24～120 h不同碳源被利用的變化方式明顯不同。圖2顯示,玉米和大豆的根際微生物群落均為無(wú)隔處理對(duì)底物碳源的利用能力高于其他處理,網(wǎng)隔次之,全隔和單作較為接近。可見(jiàn),無(wú)隔和網(wǎng)隔處理下,根際土壤微生物群落對(duì)碳源底物利用總能力最強(qiáng),全隔和單作處理最弱。這說(shuō)明越強(qiáng)的種間根系互作,微生物群落結(jié)構(gòu)組成也越復(fù)雜,其代謝能力也越強(qiáng)。

圖2 不同種間根系分隔處理下間作大豆（a）和玉米（b）根際土壤微生物平均顏色變化率（AWCD）隨培養(yǎng)時(shí)間的變化Fig.2 Changes of average well color development (AWCD) of microorganisms in rhizosphere soil of soybean (a) and maize (b)with incubation time under different partition patterns of interspecific roots of intercropped maize and soybean

2.3 不同種間根系互作下間作玉米、大豆的根際土壤微生物對(duì)碳源底物的利用強(qiáng)度

表2顯示,大豆根際土壤微生物對(duì)6大類(lèi)碳源底物利用能力最強(qiáng)的為酚類(lèi)和羧酸類(lèi),對(duì)碳水化合物類(lèi)利用能力最弱; 而玉米根際微生物對(duì)酚類(lèi)和羧酸類(lèi)(無(wú)隔和網(wǎng)隔)或酚類(lèi)和聚合物類(lèi)(全隔和單作)利用能力最強(qiáng),對(duì)碳水化合物類(lèi)利用最弱。對(duì)酚類(lèi)利用能力最強(qiáng)、對(duì)碳水化合物類(lèi)利用能力最弱是兩種作物的共同特點(diǎn)。同時(shí),隨著種間根系互作的增強(qiáng),大豆根際土壤微生物對(duì)上述6大類(lèi)碳源利用能力除了酚類(lèi)和羧酸類(lèi)有所下降或下降不明顯外,對(duì)胺類(lèi)、聚合物類(lèi)、氨基酸類(lèi)和碳水化合物類(lèi)等4大類(lèi)碳源底物利用分別平均提高181.01%、32.6%、37.84%和78.28%。而玉米根際微生物,除了對(duì)酚類(lèi)、聚合物類(lèi)和氨基酸類(lèi)利用水平有所下降外,對(duì)羧酸類(lèi)、碳水化合物類(lèi)和胺類(lèi)的碳源底物利用分別平均增加46.26%、6.54%和15.84%。這一結(jié)果再次說(shuō)明大豆和玉米種間根系相互增強(qiáng)對(duì)其根際土壤微生物利用碳源效果明顯不同。

表2 不同種間根系分隔處理下間作玉米與大豆的根際微生物對(duì)碳源底物的利用能力Table 2 Utilization ability to carbon substrates of rhizosphere microbes under different partition patterns of interspecific roots of intercropped maize and soybean

2.4 不同種間根系互作下間作玉米、大豆的根際土壤微生物群落主成分分析

分析結(jié)果如圖3所示,與土壤微生物碳源利用功能多樣性相關(guān)的有主成分1 (PC1)、主成分2 (PC2),兩者分別解釋了方差變量的27.88%和26.06%。進(jìn)一步分析結(jié)果顯示,5種根系互作處理的根際土壤微生物菌群組成得到很好的分離。在PC1上無(wú)隔、網(wǎng)隔和全隔處理的間作大豆和單作大豆之間的根際微生物菌群組成有明顯差異,分別位于不同的區(qū)間(象限),其中無(wú)隔和網(wǎng)隔處理的大豆根際微生物聚雖然分布在不同的區(qū)間內(nèi),但相對(duì)距離較近; 而全隔和單作處理的大豆根際微生物組成相近,聚集距離最短;可見(jiàn),網(wǎng)隔和無(wú)隔處理的大豆根際微生物差異相對(duì)較小,聚在相近區(qū)域,可歸為一類(lèi); 而全隔與單作處理的大豆根際微生物組成較近,分布距離相近,歸為另一類(lèi)。進(jìn)一步從玉米根際微生物組成看,無(wú)隔、網(wǎng)隔、全隔和單作玉米根際微生物組成分離程度及其表現(xiàn)趨勢(shì)與大豆相似。其中無(wú)隔與網(wǎng)隔處理根際微生物組成多數(shù)相疊近,歸成一類(lèi),而全隔與單作玉米根際微生物組成也相近,可歸為另一類(lèi)。網(wǎng)隔與全隔根際微生物組成存在一個(gè)逐漸差異的過(guò)渡類(lèi)型。網(wǎng)隔對(duì)無(wú)隔處理來(lái)說(shuō),其根際微生物組成是個(gè)漸進(jìn)變化的過(guò)程,并向無(wú)隔處理貼近的過(guò)渡; 后者(全隔處理)則向單作處理貼近。可見(jiàn),隨著根系互作強(qiáng)度增強(qiáng)對(duì)根際微生物的組成與功能的影響變得更加明顯。

圖3 不同種間根系分隔處理下間作大豆和玉米根際微生物碳源利用特征的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of carbon utilization profiles of microbes in rhizosphere soil under different partition patterns of interspecific roots of intercropped maize and soybean

2.5 不同種間根系互作下間作玉米、大豆的根際土壤微生物多樣性

表3結(jié)果顯示,間作大豆根際微生物的Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)和McIntosh指數(shù)均表現(xiàn)出無(wú)隔最高,網(wǎng)隔次之,全隔和單作最低的趨勢(shì),且全隔與單作之間無(wú)顯著差異; 而McIntosh指數(shù)無(wú)隔與網(wǎng)隔間差異顯著(＜0.05)。間作玉米根際微生物的Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)也表現(xiàn)出與大豆處理下相同的趨勢(shì); McIntosh指數(shù)多數(shù)情況下,無(wú)隔處理最優(yōu),網(wǎng)隔處理次之,全隔和單作最低。可見(jiàn),種間根系互作增強(qiáng)其根際土壤微生物種類(lèi)的多樣性和豐富度。

表3 不同種間根系互作對(duì)間作作物根際土壤微生物多樣性指數(shù)的影響Table 3 Effects of different partition patterns of interspecific roots on soil microbial diversity indexes of intercropped maize and soybean

2.6 不同種間根系互作對(duì)間作玉米、大豆根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

應(yīng)用T-RFLP分析結(jié)果如表4可知,大豆與玉米根際細(xì)菌群落Shannon-Wiener指數(shù)和McIntosh指數(shù)在無(wú)隔處理下均顯著高于全隔處理(＜0.05),且與網(wǎng)隔處理間無(wú)顯著差異; Simpson指數(shù)在這3種處理間差異不顯著。該結(jié)果與上述AWCD分析結(jié)果相一致。

表4 不同種間根系互作對(duì)間作玉米與大豆根際土壤細(xì)菌微生物多樣性和均勻度指數(shù)的影響Table 4 Effect of different partition patterns of interspecific roots on diversity indexes of soil bacteria community of intercropped system of maize and soybean

進(jìn)一步運(yùn)用Phylogenetic Assignment Tool (PAT)對(duì)細(xì)菌類(lèi)群進(jìn)行比庫(kù)分析,結(jié)果顯示: 除了未分類(lèi)細(xì)菌外,變形菌門(mén)(Proteobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)的細(xì)菌種類(lèi)在6種根際土壤中都是最豐富的。但是,在不同土壤樣品中每個(gè)微生物類(lèi)群的種類(lèi)百分比存在明顯差異。

圖4的結(jié)果所示,在大豆根際土壤中變形菌門(mén)在全隔、網(wǎng)隔和無(wú)隔處理中所占比例依次降低,分別為41.18%、32.76%和31.34%; 放線菌門(mén)在無(wú)隔、網(wǎng)隔和全隔處理中所占比例依次減少,分別為27.40%、21.49%和13.24%; 厚壁菌門(mén)在3種處理中的變化趨勢(shì)與放線菌門(mén)表現(xiàn)相似,比例依次降低,分別為18.43%、17.29%和15.69%; 擬桿菌門(mén)則全隔處理所占比例最高,為10.62%,無(wú)隔和網(wǎng)隔處理所占比例依次減少,但兩者差異不大(5.82%和5.04%)。在玉米根際土壤中變形菌門(mén)表現(xiàn)為全隔、網(wǎng)隔和無(wú)隔處理所占比例依次降低,分別為47.61%、38.70%和37.26%; 放線菌門(mén)則在無(wú)隔、全隔和網(wǎng)隔處理中所占比例依次減少,三者分別為18.34%、17.54%和12.07%; 厚壁菌門(mén)也在無(wú)隔和網(wǎng)隔處理中所占比例均大于全隔處理(三者所占比例分別為19.92%、19.65%和11.62%); 擬桿菌門(mén)則在無(wú)隔、網(wǎng)隔和全隔處理所占比例無(wú)明顯差異,三者所占比例分別為7.28%、7.28%和7.29%。由此可見(jiàn),隨著間作作物根系互作強(qiáng)度的減弱(即從無(wú)隔處理向全隔處理變化),大豆根際土壤微生物中的放線菌門(mén)和厚壁菌門(mén)所占比例均明顯減少,而變形菌門(mén)所占比例明顯增加。但玉米根際土壤微生物在無(wú)隔、網(wǎng)隔和全隔處理中除了擬桿菌門(mén)無(wú)顯著差異外,其他變化趨勢(shì)與大豆表現(xiàn)趨勢(shì)一致。

圖4 種間相互作用對(duì)間作大豆與玉米根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of interspecific interaction on microbial community structure in of rhizosphere soil of intercropped soybean and maize

2.7 不同種間根系互作下間作玉米、大豆根際優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌群分析

不同處理中最豐富的是變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)和擬桿菌門(mén)細(xì)菌(圖4)。進(jìn)一步分析其群落優(yōu)勢(shì)種菌群變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表5),大豆根際細(xì)菌群落中變形菌門(mén)的伯克氏菌屬()、脫硫桿菌屬())和奈瑟菌屬()是優(yōu)勢(shì)菌群,后兩個(gè)屬全隔處理均顯著高于無(wú)隔處理(＜0.05),且網(wǎng)隔處理顯著大于無(wú)隔處理(＜0.05)。放線菌門(mén)的優(yōu)勢(shì)種群為棒狀桿菌屬()、紅球菌屬()和動(dòng)孢囊菌屬(),這3種優(yōu)勢(shì)菌群在不同處理中均為無(wú)隔處理＞網(wǎng)隔處理＞全隔處理,其中無(wú)隔處理與全隔處理差異達(dá)顯著水平(＜0.05),紅球菌屬和動(dòng)孢囊菌屬在無(wú)隔和網(wǎng)隔處理之間具有顯著差異(＜0.05)。厚壁菌門(mén)的喜鹽芽孢桿菌屬()在無(wú)隔、網(wǎng)隔和全隔3種處理的變化中呈現(xiàn)依次減少的趨勢(shì),其中無(wú)隔處理與網(wǎng)隔處理之間無(wú)顯著差異,但二者與全隔處理之間差異顯著。擬桿菌門(mén)中噬細(xì)胞菌屬()的變化趨勢(shì)與喜鹽芽孢桿菌屬的依次減少變化趨勢(shì)相同?？梢?jiàn),隨著種間根系互作的加強(qiáng),大豆根際土壤中厚壁菌門(mén)的喜鹽芽孢桿菌屬,放線菌門(mén)的棒狀桿菌屬、紅球菌屬和動(dòng)孢囊菌屬和擬桿菌門(mén)的噬細(xì)胞菌屬優(yōu)勢(shì)菌群豐度明顯增多,除伯克氏菌屬外,其他菌群反之(表5)。

玉米根際土壤細(xì)菌群落中,變形菌門(mén)的優(yōu)勢(shì)種群為無(wú)色菌屬()、伯克氏菌、假單胞菌屬()、艾肯氏菌屬()和脫硫桿菌屬(表5),其中除脫硫桿菌屬外,全隔處理均顯著高于無(wú)隔處理(＜0.05),伯克氏菌屬和假單胞菌屬全隔處理顯著高于無(wú)隔、網(wǎng)隔處理(＜0.05); 脫硫桿菌屬表現(xiàn)為無(wú)隔和網(wǎng)隔處理均顯著高于全隔處理(＜0.05)。放線菌門(mén)的優(yōu)勢(shì)種群為紅球菌屬和動(dòng)孢囊菌屬,均表現(xiàn)為無(wú)隔處理＞網(wǎng)隔處理＞全隔處理,其中無(wú)隔和網(wǎng)隔處理之間無(wú)顯著差異,無(wú)隔處理顯著高于全隔處理(＜0.05)。厚壁菌門(mén)的桿菌屬()和芽孢桿菌屬()均呈現(xiàn)無(wú)隔、網(wǎng)隔均大于全隔處理,其中桿菌屬在無(wú)隔與網(wǎng)隔處理之間差異達(dá)顯著水平(＜0.05),芽孢桿菌屬在無(wú)隔與網(wǎng)隔處理之間無(wú)顯著性差異,而網(wǎng)隔與全隔之間的差異顯著(＜0.05)。螺旋體門(mén)(Spirochaetes)中螺旋體屬()和擬桿菌門(mén)中噬細(xì)胞菌屬()的變化趨勢(shì)分別與桿菌屬、芽孢桿菌屬在無(wú)隔、網(wǎng)隔和全隔處理之間的變化趨勢(shì)相同。由此可見(jiàn),與全隔處理相比,無(wú)隔和網(wǎng)隔處理下玉米根際土壤微生物中變形菌門(mén)的脫硫桿菌屬、放線菌門(mén)的動(dòng)孢囊菌屬和紅球菌屬、厚壁菌門(mén)的芽孢桿菌屬和桿菌屬、螺旋體門(mén)的螺旋體屬和擬桿菌門(mén)的噬細(xì)胞菌屬優(yōu)勢(shì)菌群豐度明顯增多,其他相應(yīng)減少。

表5 不同種間根系互作對(duì)間作大豆和玉米根際土壤細(xì)菌群落的影響Table 5 Effect of interspecific interaction on bacterial community in rhizopshere soil of soybean and maize

3 討論和結(jié)論

本研究結(jié)果表明,玉米與大豆以2∶3行比間作時(shí),以無(wú)隔處理的土地當(dāng)量比最大,網(wǎng)隔處理其次,全隔處理最小,說(shuō)明種間根系互作增加對(duì)復(fù)合作物群體產(chǎn)量有明顯的正效應(yīng),這與種間根系互作影響根際微生物組成有關(guān)。運(yùn)用BIOLOG和T-RFLP技術(shù)分析結(jié)果表明,隨著玉米與大豆種間根系從完全隔離向網(wǎng)隔和無(wú)隔處理變化,即種間根系互作增強(qiáng)，其根際微生物多樣性和均勻度指數(shù)均顯著提高。AWCD分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),根際土壤細(xì)菌微生物利用6大類(lèi)碳源底物的共同特點(diǎn)是,對(duì)酚類(lèi)碳源和羧酸類(lèi)碳源利用能力最強(qiáng)。同時(shí),隨著種間根系互作的增強(qiáng),大豆根際土壤細(xì)菌微生物對(duì)酚類(lèi)碳源和羧酸類(lèi)碳源利用能力有所下降或下降不明顯,而對(duì)胺類(lèi)、聚合物類(lèi)、氨基酸類(lèi)和碳水化合物類(lèi)等4大類(lèi)碳源底物利用能力均明顯提高。玉米根際細(xì)菌群落,除了對(duì)酚類(lèi)碳源、聚合物類(lèi)碳源和氨基酸類(lèi)碳源利用能力有所下降外,對(duì)羧酸類(lèi)、碳水化合物類(lèi)和胺類(lèi)的碳源底物利用能力明顯增加。究其原因可能是由于種間根系互作導(dǎo)致釋放的根系分泌物組成濃度不同,并由此引發(fā)根際微生物功能類(lèi)群變異所致。

前人研究發(fā)現(xiàn),玉米根系釋放出比大豆根系更多的酚酸類(lèi)化感物質(zhì),在單作玉米和間作玉米的根分泌物中均能檢測(cè)到5種酚酸,分別是阿魏酸、對(duì)香豆酸、肉桂酸、水楊酸和沒(méi)食子酸,而在單作大豆根系分泌物中只檢測(cè)到?jīng)]食子酸,同時(shí)發(fā)現(xiàn)玉米||大豆間作能顯著提高上述5種酚酸,特別是肉桂酸化感物質(zhì)的含量。前人研究證明間作玉米可促進(jìn)大豆對(duì)紅冠腐病的抗病性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)大豆與玉米的根系互作,可抑制病原菌的生長(zhǎng)繁殖,并能有效提高寄主植物基因的表達(dá)和相應(yīng)酶的活性。已有試驗(yàn)證明肉桂酸是抑制該間作作物黑腐病菌的主要化感物質(zhì),因而認(rèn)為大豆與玉米間作是一種可持續(xù)防治土傳病害的有效手段,應(yīng)在農(nóng)業(yè)管理實(shí)踐中加以推廣應(yīng)用。

本研究還發(fā)現(xiàn)在玉米和大豆根系互作體系中,變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)和擬桿菌門(mén)都是最豐富的優(yōu)勢(shì)菌群。隨著種間根系互作的增強(qiáng),大豆根際中棒狀桿菌屬、紅球菌屬、動(dòng)孢囊菌屬、喜鹽芽孢桿菌屬和噬細(xì)胞菌屬等優(yōu)勢(shì)菌群豐度明顯增多,除伯克氏菌屬外,其他菌群反之。與全隔處理相比,無(wú)隔和網(wǎng)隔處理下玉米根際土壤微生物中變形菌門(mén)的脫硫桿菌屬、放線菌門(mén)的動(dòng)孢囊菌屬和紅球菌屬、厚壁菌門(mén)的芽孢桿菌屬和桿菌屬、螺旋體門(mén)的螺旋體屬和擬桿菌門(mén)的噬細(xì)胞菌屬優(yōu)勢(shì)菌群豐度明顯增多,其他相應(yīng)減少。從植物營(yíng)養(yǎng)生理角度,間作系統(tǒng)中玉米和豆科植物分泌的有機(jī)酸和黃酮類(lèi)物質(zhì)有助于對(duì)土壤磷的活化和作物固氮,并提高氮營(yíng)養(yǎng)供給的營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)效果。我們以往研究表明作物根系分泌物對(duì)根際土壤有差異促抑作用,進(jìn)而塑造出與之相適應(yīng)的根際特異細(xì)菌生理功能類(lèi)群。上述這些根際差異細(xì)菌微生物,如芽孢桿菌屬和紅球菌屬等是一類(lèi)很重要的根際促生菌,在土壤養(yǎng)分循環(huán)和病菌拮抗中起到重要的調(diào)控作用。馬瑞霞等和Li等也研究報(bào)道了芽孢桿菌等特異根際微生物的酶促活性與互作植物根系分泌的化感物質(zhì)及其濃度有關(guān),進(jìn)而影響作物的產(chǎn)量與質(zhì)量。

總之,本研究認(rèn)為,玉米與大豆種間根系互作能顯著影響根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與功能。隨著種間根系互作強(qiáng)度的增強(qiáng),即種間根系從完全隔離(全隔處理)到不完全隔離(網(wǎng)隔處理)再到自由開(kāi)放(無(wú)隔處理)變化,根際微生物多樣性和均勻度依次提高,其生理功能類(lèi)型也存在明顯差異,對(duì)碳源利用總能力不斷增強(qiáng),共同特點(diǎn)是對(duì)酚類(lèi)碳源利用能力均排名第一。同時(shí),隨著種間根系互作的增強(qiáng),其中大豆根際土壤微生物對(duì)酚類(lèi)碳源和羧酸類(lèi)碳源的利用能力有所下降或下降不明顯,對(duì)其余4大類(lèi)碳源利用能力均提高。而玉米根際土壤微生物則表現(xiàn)為,除了對(duì)酚類(lèi)碳源、聚合物類(lèi)碳源和氨基酸類(lèi)碳源底物利用能力有所下降外,對(duì)其余3大類(lèi)碳源利用能力顯著增強(qiáng)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),隨著種間根系互作增強(qiáng),大豆根際土壤中棒狀桿菌屬、紅球菌屬、動(dòng)孢囊菌屬、喜鹽芽孢桿菌屬和噬細(xì)胞菌屬等優(yōu)勢(shì)菌群豐度明顯增多,除伯克氏菌屬外,其他菌群反之。與全隔處理相比,無(wú)隔和網(wǎng)隔處理下玉米根際土壤微生物中變形菌門(mén)的脫硫桿菌屬、放線菌門(mén)的動(dòng)孢囊菌屬和紅球菌屬、厚壁菌門(mén)的芽孢桿菌屬和桿菌屬、螺旋體門(mén)的螺旋體屬和擬桿菌門(mén)的噬細(xì)胞菌屬優(yōu)勢(shì)菌群豐度明顯增多,其他相應(yīng)減少。可見(jiàn)在作物間套作體系中,種間根系及其與微生物存在明顯的互作效應(yīng),并影響根際的微生物生理類(lèi)群結(jié)構(gòu)與功能,最終影響作物的籽粒產(chǎn)量,導(dǎo)致土地當(dāng)量比的差異,這是復(fù)合作物群體產(chǎn)生不同產(chǎn)量效應(yīng)的重要根際微生態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。