程穎穎，於子翔，徐露佳，高夢葉，劉勝兵

(嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 嘉興 314000)

0 引言

作為婦科惡性腫瘤，卵巢癌嚴重危害女性生命健康。化療是目前卵巢癌治療的重要手段，雖然化療可以提高卵巢癌患者生存率，但隨著用藥時間的延長，化療抗性難以避免[1]，降低化療抗性，則可以提高臨床療效。Hippo信號通路在調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡，以及對干細胞調(diào)控中都有重要作用，Hippo信號通路與癌癥發(fā)生發(fā)展有緊密聯(lián)系。Hippo信號通路中，Mst1/2激酶與SAV1形成復(fù)合物，繼而磷酸化LATS1/2，隨后磷酸化的LATS1/2激酶可以磷酸化Hippo信號通路下游關(guān)鍵效應(yīng)分YAP/TAZ，抑制YAP/TAZ轉(zhuǎn)錄活性。研究發(fā)現(xiàn)，LATS1/2基因敲除可抑制卵巢癌細胞ES-2的增殖，克隆形成和遷移，人卵巢癌細胞ES-2中敲除LATS1/2可以促進細胞凋亡，影響細胞周期。關(guān)于ES-2中敲除LATS1/2后，對卵巢癌細胞的化療效果和耐藥性的影響，未做進一步研究。本研究以LATS1/2敲除的卵巢癌細胞ES-2為研究對象，以順鉑處理卵巢癌細胞，通過檢測化療藥物處理后的卵巢癌細胞轉(zhuǎn)移侵襲能力、化療抗性檢測以及通路中的YAP蛋白的表達情況，初步闡明LATS1/2在卵巢癌細胞化療中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青鏈霉素購自Hyclone公司；胎牛血清購于Gibco公司；β-actin、LATS1、LATS2、p-YAP抗體購自Cellsignaling公司；YAP、p-Taz和Taz抗體購自SantaCruze。

1.2 細胞培養(yǎng)

卵巢癌ES-2細胞和LATS1/2敲除的ES-2細胞由本實驗室保存于-80℃冰箱，取ES-2細胞復(fù)蘇至，用加1%青鏈霉素的含10%胎牛血清的DMEM，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)環(huán)境培養(yǎng)。隔天換液至細胞密度到90%后，分盤接種到10cm培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 CCK8檢測細胞增殖

將對數(shù)生長期ES-2細胞懸液和LATS1/2敲除的ES-2細胞懸液分別以每孔100μL接種于 96 孔板，實驗組分別加入DDP 5、20和100μg/mL。各組細胞設(shè) 3 個復(fù)孔，細胞密度為10000個/孔，96 孔板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后每孔加入20μL CCK-8 溶液和80μL培養(yǎng)基后避光置于培養(yǎng)箱中，2h 取材96孔板，酶標儀檢測 450nm 處的吸光度(OD)值。

1.4 細胞遷移實驗

培養(yǎng)到對數(shù)生殖期的將WT組與LATS1/2 KO的ES-2細胞各分為對照組和實驗組，實驗組加DDP 0.5μg/mL 24小時，各組細胞計數(shù)，取細胞懸液(3×103)100μL加置培養(yǎng)板，并加入無血清培養(yǎng)基200μL。培養(yǎng)板下室加入500μL無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)12h后用預(yù)冷后的甲醇固定細胞30min后進行蘇木精染色，染色時間30s，顯微鏡下取10個視野計數(shù)。

1.5 細胞凋亡檢測

將WT與LATS1/2 KO的ES-2細胞各分為對照組和實驗組，實驗組加DDP 0.5μg/mL，24小時，計數(shù)取1×106個細胞，預(yù)冷PBS洗滌3次后重懸細胞，取100μL置于1.5mL離心管(細胞濃度1×105)，室溫下避光15min后流式細胞儀檢測。

1.6 western blotting 檢測

將WT與LATS1/2 KO的ES-2細胞各分為對照組和實驗組，實驗組加DDP 0.5μg/mL，24小時后收各組細胞后加入適量RIPA蛋白質(zhì)裂解液冰上消化30min，后高速離心機4℃下10000rpm15min，取上清，BCA試劑盒檢測蛋白濃度后，調(diào)整各組蛋白濃度加5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液，充分混合后95℃水浴加熱5min，水浴后置于冰上冷卻。各組樣品10μL加至濃縮膠上樣孔中，100min后結(jié)束電泳，濕轉(zhuǎn)90min后取膜，室溫下用5%脫脂奶粉封閉1h，PBST洗3次/5min。4℃一抗孵育過夜后用PBST洗膜，3次/5min。室溫二抗處理1h后PBST洗膜3次/10min，ECL發(fā)光試劑盒顯影。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

均數(shù)±標準差的統(tǒng)計學(xué)方法處理數(shù)據(jù)，組別之間通過t檢驗分析和One-wayANOVA檢驗分析。當(dāng)P＜0.05時表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Lats1/2 KO的ES-2細胞鑒定

本實驗室之前通過慢病毒載體構(gòu)建Lats1/2KO的卵巢癌ES-2細胞，通過western檢測Lats1/2 KO的ES-2細胞，結(jié)果顯示，Lats1/2 KO的ES-2細胞中Lats1/2表達明顯減少(圖1A)。

2.2 DDP對Lats1/2 KO的ES-2細胞增殖的影響

CCK8實驗結(jié)果顯示，DDP處理后的LATS1/2敲除細胞增能力降低(圖1B)。

圖1 A western檢測LAST1/2 敲除效果圖1B CCK8檢測LAST1/2敲除后對DDP作用的影響

2.3 DDP對Lats1/2 KO的ES-2細胞遷移的影響

Transwell小室實驗檢測LATS1/2 KO后的ES-2細胞遷移，DDP處理前后，野生型ES-2細胞遷移效率明顯高于LATS1/2 KO組和兩組DDP加藥組(P＜0.05)，LATS1/2 KO 細胞在加藥前后遷移沒有明顯變化(圖2)。

圖2 Transwell實驗檢測DDP對ES-2細胞LATS1/2 敲除后的遷移的影響(＊P＜0.05)

2.4 DDP對Lats1/2 KO的ES-2細胞凋亡的影響

流式細胞術(shù)檢測DDP對Lats1/2 KO的ES-2細胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，Lats1/2 KO后對細胞凋亡無明顯影響(圖3)。

圖3 流式細胞術(shù)檢測DDP對ES-2細胞LATS1/2敲除后的凋亡的影響

2.5 DDP對Lats1/2 KO的ES-2細胞中YAP和p-YAP的表達影響

western blotting檢測Lats1/2 KO的ES-2細胞中YAP和p-YAP在DDP處理前后的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DDP處理Lats1/2 KO的ES-2細胞中，YAP和p-YAP的表達無明顯變化(圖4)。

圖4 western檢測DDP對LATS1/2敲除后的ES-2細胞中YAP和PYAP表達的影響

3 討論

Hippo通路最初是在黑腹果蠅中發(fā)現(xiàn)的，Hippo通路在組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮核心作用。Hippo通路調(diào)節(jié)許多生物過程，包括細胞生長和命運決定，器官大小控制和再生。哺乳動物Hippo通路的核心包括激酶級聯(lián)，MST1/2和LATS1/2，以及下游效應(yīng)物，轉(zhuǎn)錄共激活物YAP和TAZ[2]。Hippo通路其失調(diào)可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，其核心成分(MST1/2、LATS1/2、YAP和TAZ)的突變和表達改變促進了癌細胞的遷移、侵襲和惡性[3]。LATS1/2是一種腫瘤抑制因子，在包括白血病、肺癌、前列腺癌和乳腺癌在內(nèi)的幾種人類癌癥中已顯示出突變或下調(diào)，LATS1/2可以作為腫瘤抑制基因發(fā)揮作用，LATS1/2被敲除后可導(dǎo)致細胞增殖增強，對藥物誘導(dǎo)的細胞死亡的抗性，以及細胞遷移的增加，LATS1/2通過多種機制和多種信號通路發(fā)揮作用，包括Hippo信號通路，以及p53、Ras-ERK或WNT網(wǎng)絡(luò)，以抑制腫瘤進展[4]。LATS1/2磷酸化并抑制Hippo途徑的主要效應(yīng)因子YAP/TAZ，近來也有研究發(fā)現(xiàn)MST1/2不是調(diào)節(jié)YAP/TAZ所必需的[5]。胃癌中LATS1/2、CD8和FOXP3聯(lián)合分析比單獨使用單項指標有更好的預(yù)后準確性，LATS1/2作為Hippo通路的核心激酶，與CD8和FOXP3密切相關(guān)[6]。LATS1/2缺失可增強了腫瘤疫苗的有效性。在腫瘤中缺失LATS1/2可提高腫瘤的免疫原性，通過增強抗腫瘤免疫應(yīng)答而破壞腫瘤，靶向LATS1/2在癌癥免疫治療有一定的意義[7]。LATS1/2通過調(diào)控Hippo通路、EMT和細胞分裂來觸發(fā)腫瘤干細胞的自我更新[8]。YAP和下游TEAD家族是維持可能參與卵巢癌干細胞干性和化療耐藥的特定基因表達所必需的，YAP/TEAD共激活劑調(diào)節(jié)卵巢癌起始細胞多能性和化療耐藥[9]。YAP/TAZ與TEAD家族共激活因子結(jié)合，促進癌細胞存活、增殖、侵襲性遷移和轉(zhuǎn)移。YAP/TAZ激活也可能導(dǎo)致對化療、放療或免疫治療的耐藥性[10]。

甲氨蝶呤和阿霉素提高了哺乳動物MST1的降解，降低了LATS1/2的總蛋白水平，增加了YAP的激活和核轉(zhuǎn)位。YAP能增強MG63細胞的增殖能力和耐藥能力[11]。研究發(fā)現(xiàn)絲氨酸/蘇氨酸激酶MK5是YAP的正調(diào)節(jié)因子。MK5與YAP發(fā)生物理作用，不依賴于LATS1/2抑制CK1δ/ε介導(dǎo)的YAP泛素化和降解。MK5可作為新的調(diào)控YAP穩(wěn)定性的因子，獨立于LATS1/2調(diào)控YAP，可作為癌癥治療的靶點[12]。關(guān)于LATS1/2在卵巢癌化療中的作用，本實驗通過DDP處理LATS1/2 KO的卵巢癌ES-2細胞，發(fā)現(xiàn)LATS1/2 KO后對細胞的遷移有一定的影響，這與前期的實驗結(jié)果一致[13]。而DDP對LATS1/2 KO前后的增殖、遷移和凋亡并未有影響，通過western blotting實驗，對DDP作用于野生型卵巢癌ES-2細胞后，YAP和p-YAP表達明顯下降，LATS1/2 KO后，DDP處理前后，YAP表達變化不明顯，初步說明在卵巢癌化療抵抗中LATS1/2的作用不明顯，YAP在DDP處理后的表達變化或許有其它的機制作用。