李文娟

（濱州市自然資源和規(guī)劃局，山東 濱州 256600）

植物生長環(huán)境中存在各種各樣的微生物，例如細(xì)菌、真菌、古菌等，它們生活于植物器官內(nèi)部或附著在其表面[1]。微生物在維持植物健康和促進(jìn)植物生長過程中起著關(guān)鍵作用[1]。微生物可以通過溶磷作用[2]、固氮作用或者分泌鐵載體[3]促進(jìn)植物對(duì)所需營養(yǎng)元素的吸收，產(chǎn)生植物激素[3]、抗菌物質(zhì)等促進(jìn)植物生長、提高作物產(chǎn)量、保護(hù)寄主植物免受病原體的侵害[4]。微生物還能增強(qiáng)植物在各種脅迫條件下的適應(yīng)能力[5]。此外，植物也對(duì)微生物群落產(chǎn)生重要影響。植物為微生物群落提供棲息場所，微生物群落能夠在同一植物的不同部位定殖，如根際、葉際以及葉、莖、根內(nèi)部[6]。植物種類是決定微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因子[7]。植物根系分泌的化學(xué)物質(zhì)可以釋放到土壤中，進(jìn)而影響土壤中微生物群落的結(jié)構(gòu)[6]和生物量[8]。植物還可以通過刺激有益于植物生長的微生物來影響根際微生物群落組成[9]。

同一株植物的微生物群落在不同部位具有一定差異。對(duì)葡萄不同器官（葉、花、根）和土壤微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)地上部分微生物群落結(jié)構(gòu)明顯與地下部分不同，但是在葉、花聚集的部分微生物同樣在土壤中出現(xiàn)[10]。BAI等[11]采用分離培養(yǎng)技術(shù)對(duì)擬南芥的葉際和根際微生物群落進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)葉際微生物群落明顯區(qū)別于根際。BECKERS等[12]應(yīng)用16S rDNA測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，相比楊樹莖、葉，根際微生物群落結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。目前，關(guān)于藥用植物微生物的研究多集中于根際微生物與藥用植物的互作以及微生物轉(zhuǎn)化對(duì)藥用植物的影響方面[13-24]，對(duì)藥用植物地上部分與地下部分微生物群落結(jié)構(gòu)差異的研究尚不多見。甘草是豆科草本植物，主要分布于我國西北地區(qū)，其藥用部位是根和根莖，具有清熱解毒、祛痰止咳以及補(bǔ)脾益氣等功效，市場需求旺盛。目前，野生甘草資源正迅速減少，提高甘草的栽培質(zhì)量成為當(dāng)前急需解決的一個(gè)問題。因此，以甘草為研究對(duì)象，采用16S rDNA測序技術(shù)對(duì)其葉際、莖部以及根際土壤的細(xì)菌群落的多樣性以及結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行初步研究，旨在了解甘草不同部位細(xì)菌群落差異，為進(jìn)一步探究微生物與植物的互作機(jī)制提供理論參考，且對(duì)于藥用植物的栽培具有指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 樣品采集與處理

甘草樣品采集地點(diǎn)為山東省濱州市無棣縣（北緯37°04' ~38°16'，東經(jīng)117°31'~118°04'），該區(qū)屬北溫帶東亞季風(fēng)區(qū)大陸性氣候，四季分明，降水多集中于7、8月份。無棣縣擁有豐富的野生植物資源，藥用植物分布廣泛。隨機(jī)選取3株長勢良好的甘草植株，小心挖出整株，采集其莖、葉以及附著于植物根表面的土壤顆粒，分別命名為莖部（GJ）、葉際（GY）、根際（TR），放入無菌自封袋中。采樣結(jié)束后，將樣品置于裝有冰袋的采樣箱中，帶回實(shí)驗(yàn)室于-20 ℃冰箱中保存，用于后續(xù)的DNA提取。

1.2 DNA提取、測序

參照試劑盒說明書，使用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit試劑盒對(duì)土壤、葉、莖樣品進(jìn)行DNA提取。16S rDNA擴(kuò) 增 引 物 為341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）和805R（5'- GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）。PCR反應(yīng)體系為25μL，包含50 ng模板DNA，Phusion Hot start flex 2× Master Mix 12.5μL，上、下游引物各2.5 μL，用超純水（ddH2O）補(bǔ)至25μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 最終延伸 10 min。擴(kuò)增完成后，用2% 瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物由AMPure XT beads (Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA, USA)純化，Qubit (Invitrogen, USA)定量。采用Agilent 2100生物分析儀（Agilent，美國）和Illumina（Kapa Biosciences, Woburn, MA，美國）的文庫定量試劑盒評(píng)估擴(kuò)增子文庫大小和數(shù)量。利用NovaSeq PE250平臺(tái)對(duì)文庫進(jìn)行測序。

1.3 細(xì)菌群落多樣性分析

測序完成后，得到原始數(shù)據(jù)，通過overlap對(duì)雙端數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，并通過質(zhì)控、過濾嵌合體，得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)。利用DADA2進(jìn)行調(diào)解，獲得特征表和特征序列。根據(jù)SILVA分類器，使用每個(gè)樣本的相對(duì)豐度將特征豐度進(jìn)行歸一化。α多樣性主要通過Chao1、Observed species、Goods_coverage、Shannon、Simpson 5個(gè)指數(shù)反映，這些指數(shù)用QIIME2計(jì)算。采用主成分分析 (Principal component analysis，PCA)對(duì)甘草不同部位細(xì)菌群落組成差異進(jìn)行分析。采用Blast進(jìn)行序列比對(duì)，每個(gè)代表性序列通過SILVA數(shù)據(jù)庫對(duì)特征序列進(jìn)行注釋。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2017和SPSS 20進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用R語言和Excel 2017軟件做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘草莖部、葉際、根際細(xì)菌特征值分布

由圖1可知，甘草3個(gè)部位莖部、葉際、根際細(xì)菌文庫共有特征值102個(gè)。莖部獨(dú)有特征值最少，為432個(gè)；葉際獨(dú)有特征值為818個(gè)；根際獨(dú)有特征值最多，為4 801個(gè)（圖1）。因此，甘草不同部位特有細(xì)菌群落組成差異較大。除了3個(gè)部位的共有特征值，根際與莖部、葉際，莖部與葉際也分別都有共有特征值。

圖1 甘草莖部、葉際、根際細(xì)菌特征值分布

2.2 甘草莖部、葉際、根際細(xì)菌的α多樣性

微生物物種的豐富度和均勻性主要由Chao1、Observed species、Goods_coverage、Shannon、Simpson 5個(gè)指數(shù)反映。Chao1和Observed species指數(shù)反映物種的豐富度信息，數(shù)值越大，物種總數(shù)越多。Goods_coverage表示微生物覆蓋率，其數(shù)值越高，則樣本中新物種被測出的概率越高。Shannon和Simpson指數(shù)用于反映樣本物種的多樣性，數(shù)值越大，物種多樣性越高。由表1可知，甘草莖部、葉際、根際細(xì)菌多樣性指數(shù)具有一定差異。Observed species指數(shù)、Chao1指數(shù)均表現(xiàn)為根際＞葉際＞莖部，表明根際微生物群落的豐富度最高，其次是葉際，莖部最低。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)總體表現(xiàn)為根際＞莖部＞葉際。此外，樣品Goods_coverage指數(shù)介于0.99～1.00，真實(shí)地反映了樣本中的微生物情況。

表1 甘草莖部、葉際、根際細(xì)菌的α多樣性

2.3 甘草莖部、葉際、根際細(xì)菌的主成分分析

2個(gè)樣品在PCA圖中的距離越近，2個(gè)樣品物種組成越相似。由圖2可以看出，相較于不同類型樣品間距離，同類型樣品間的距離更近，差異更小。根際與莖部、葉際樣品的距離較遠(yuǎn)，表明細(xì)菌的分布因植物部位而有所不同。

圖2 甘草莖部、葉際、根際細(xì)菌的主成分分析

2.4 甘草莖部、葉際、根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成

為了進(jìn)一步研究甘草不同部位細(xì)菌群落組成差異，在門水平和屬水平上比較甘草根際、葉際和莖部微生物的相對(duì)豐度。各類型樣品在門、屬水平上豐度排名前30的物種見圖3、圖4。在門水平上（圖3），甘草莖部的優(yōu)勢細(xì)菌門為變形菌門（Proteobacteria）（93.73%）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）（4.15%）；葉 際的優(yōu)勢細(xì)菌門為變形菌門（55.64%）、藍(lán)細(xì)菌門（40.82%）、厚壁菌門（Firmicutes）（1.28%）；根際的優(yōu)勢細(xì)菌門為變形菌門（47.33%）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）（9.81%）、酸桿菌門（Acidobacteria）（8.71%）、放線菌門（Actinobacteria）（7.76%）、擬桿菌門（Bacteroidetes）（7.15%）、綠彎菌門（Chloroflexi）（5.28%）、浮霉菌門（Planctomycetes）（4.44%）、疣微菌門（Verrucomicrobia）（1.68%）、己科河菌門（Rokubacteria）（1.37%）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）（1.03%），可見不同部位的優(yōu)勢細(xì)菌門存在一定的差異。其中，變形菌門是所有類型樣品的優(yōu)勢菌門，但在各部位中所占比例有所不同，在莖部的相對(duì)豐度最高，其次是葉際，在根際中最低。

圖3 門水平上甘草莖部、葉際、根際細(xì)菌群落組成

在屬水平上（圖4），甘草莖部優(yōu)勢菌屬中能準(zhǔn)確分類的有泛菌屬（Pantoea）（34.82%）、假 單胞菌屬（Pseudomonas）（23.85%）、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）（9.63%）、Falsirhodobacter（7.89%）、Massilia（3.02%）、歐文氏菌屬（Erwinia）（2.19%）；葉際優(yōu)勢菌屬中能準(zhǔn)確分類的有泛菌屬（15.99%）、假單胞菌屬（8.66%）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）（3.67%）、Falsirhodobacter（2.94%）、鞘氨醇單胞菌屬（2.62%）、Massilia（1.29%）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）（1.22%）；根際優(yōu)勢菌屬中能準(zhǔn)確分類的有Pelagibius（2.41%）、Haliangium（1.13%），未準(zhǔn)確分類的有Geminicoccaceae科未知屬（5.00%）、α變形菌綱未知屬（3.00%）、芽單胞菌科未知屬（1.58%）、Actinomarinales目未知屬（1.57%）、Rokubacteriales門未知屬（1.57%）、變形菌門未知屬（1.10%）。

圖4 屬水平上甘草莖部、葉際、根際細(xì)菌群落組成

3 結(jié)論與討論

甘草莖部、葉際、根際細(xì)菌群落共有特征值102個(gè)，根際獨(dú)有特征值最多，其次為葉際，莖部最少。植物地上部分細(xì)菌的來源之一是土壤[25]。因此，葉際、莖部與根際細(xì)菌群落之間存在共性。葉際生態(tài)系統(tǒng)因具有開放性強(qiáng)的特點(diǎn)而使其微生物來源多樣，微生物除來自土壤外也可能是經(jīng)氣溶膠或昆蟲傳播而來[11，26]。所以，不同部位細(xì)菌的不同來源使各部位存在特定的群落。在α多樣性上，不同部位的細(xì)菌群落多樣性、豐富度均表現(xiàn)出差異，根際細(xì)菌群落的α多樣性遠(yuǎn)高于葉際和莖部。本研究結(jié)果與使用高通量測序技術(shù)對(duì)楊樹葉、莖、根和土壤微生物的研究結(jié)果相似，即地下部分微生物多樣性高于地上部分[27]。根際環(huán)境中細(xì)菌面臨的非生物因素影響較弱，而且植物根系分泌化學(xué)物質(zhì)如有機(jī)酸、氨基酸并將其釋放到周圍環(huán)境中，極大地吸引了微生物在根際周圍聚集[28-29]，進(jìn)而構(gòu)成了包含豐富多樣物種的根際微生物群落。植物地上部環(huán)境條件嚴(yán)苛，尤其是葉片壽命短，面臨眾多非生物因素的影響，如紫外線照射強(qiáng)烈、溫濕度變化大、營養(yǎng)物質(zhì)有限，只有適應(yīng)該環(huán)境的細(xì)菌才能在此定殖[1，30]。應(yīng)用主成分分析比較各部位細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，細(xì)菌群落根據(jù)植物部位聚類，葉際與莖部群落結(jié)構(gòu)的相似性高于根際與葉際或莖部之間的相似性。對(duì)楊樹以及擬南芥細(xì)菌群落的研究發(fā)現(xiàn)，不同部位雖存在相同物種，但群落結(jié)構(gòu)差異顯著[12,31]，與本研究結(jié)果一致。上述結(jié)果表明，甘草根際、葉際和莖部的細(xì)菌群落既存在共性，也具有差異性。

在門水平上，甘草莖部的優(yōu)勢細(xì)菌門是變形菌門和藍(lán)細(xì)菌門。其中，變形菌門的相對(duì)豐度高達(dá)90%以上，占絕對(duì)優(yōu)勢。葉際的部分優(yōu)勢細(xì)菌門與莖部重疊，為變形菌門、藍(lán)細(xì)菌門和厚壁菌門，但相對(duì)豐度有所不同。對(duì)楊樹細(xì)菌多樣性的研究發(fā)現(xiàn)，生活于植物地上部分（莖和葉際）的細(xì)菌群落存在相似性[32]，與本研究結(jié)果一致。對(duì)其他植物葉際微生物群落的研究發(fā)現(xiàn)，主要細(xì)菌門是變形菌門、放線菌門、鞘脂桿菌門和擬桿菌門[29，33-34]，表明不同植物葉際的優(yōu)勢菌群具有差異。甘草根際最主要的優(yōu)勢細(xì)菌門是變形菌門。此外，芽單胞菌門、酸桿菌門、放線菌門、擬桿菌門等也較豐富，根際的優(yōu)勢細(xì)菌門同樣在水稻、大麥、小麥根際中聚集[35-36]。甘草不同部位的優(yōu)勢菌群表現(xiàn)出顯著差異，根際的優(yōu)勢菌群種類遠(yuǎn)多于葉際和莖部。從上述結(jié)果可知，變形菌門在每個(gè)部位的相對(duì)豐度是最高的，且表現(xiàn)為根際<葉際<莖部。以往研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門也是其他植物優(yōu)勢菌群中最豐富的[26，29，37]，可見不同植物的關(guān)鍵群落成員是重疊的。放線菌已在許多藥用植物根際中被發(fā)現(xiàn)。前人研究表明，植物根際放線菌能夠保護(hù)植物根部免受病原菌感染[3]，產(chǎn)生生物活性物質(zhì)[38]，紅豆杉根際放線菌具有極強(qiáng)的抑菌活性[39]，可見放線菌在農(nóng)業(yè)和藥物開發(fā)方面具有較大潛力。

在屬水平上，假單胞菌屬、泛菌屬、鞘氨醇單胞菌屬均在莖部和葉際富集。泛菌屬是葉際和莖部最豐富的菌屬，在莖部的相對(duì)豐度高于葉際。但擬南芥葉際菌屬中豐度最高的是假單胞菌屬[31]。上述菌屬已在許多植物如葡萄[10]、擬南芥[40]葉際或莖部中被分離出來，此外甲基桿菌屬也已從葉際中被分離出來。紫外輻射是影響葉際微生物生存的一個(gè)重要因子，假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、甲基桿菌屬可以產(chǎn)生色素，幫助葉際微生物群落抵御紫外輻射的傷害[41]。此外，假單胞菌能夠增強(qiáng)葉片的濕潤性，促進(jìn)了物質(zhì)的溶解和擴(kuò)散，使之易從附生細(xì)菌中獲得[41]。本研究中根際優(yōu)勢菌屬豐富，但未明確分類的占比大，而以往研究中，植物根際的主要菌屬為假單胞菌屬、芽孢桿菌屬[28]、節(jié)桿菌屬[12]等。