王坤
(齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,黑龍江 齊齊哈爾 161006)
糖尿病、高血壓等因素導致的出血性腦中風(Intracerebral hemorrhage,ICH)發(fā)病率和死亡率高[1]。即使ICH患者存活,也常出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損或障礙,生存質量造成嚴重影響。
對ICH實施有效的神經(jīng)元保護,是緩解ICH損傷,維持患者神經(jīng)系統(tǒng)功能的關鍵。NGF、BDNG等神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員對維持神經(jīng)元功能具有重要作用。BDNF能夠改善ICH疾病預后,逆轉神經(jīng)元損傷[2]。但是這些神經(jīng)營養(yǎng)因子含量低,制備工藝比較復雜,如果能找到與BDNF具有相似作用,對神經(jīng)元具有保護作用的替代物,將有效保持ICH神經(jīng)元的功能,促進患者康復。
7,8-二羥基黃酮(7,8-dihydroxyflavone,DHF)可以活化PI3K/Akt信號路徑,促進結腸平滑肌蠕動改善便秘[3];腹腔注射DHF能夠恢復阿爾茲海默病ICV-STZ大鼠模型的中樞神經(jīng)系統(tǒng)線粒體功能障礙,發(fā)揮較好的神經(jīng)保護作用[4]。盡管DHF具有類似BDNF的結構,但是DHF激活通過何種分子機制發(fā)揮對ICH神經(jīng)元的保護作用還不清楚。觀察DHF對人腦神經(jīng)元細胞的保護作用和潛在分子機制,為指導神經(jīng)元保護奠定研究基礎。
1.1.1 細胞株
人腦皮質神經(jīng)元細胞(Procell公司)。
1.1.2 主要試劑和儀器
人神經(jīng)元專用完全培養(yǎng)基(Procell公司),Triciribine(Sigma-Aldrich公 司),DHF(日 本TCI公司),CCK-8試劑(日本Dojindo公司)、AnnexinⅤ-FITC(上海碧云天生物科技公司),F(xiàn)ACSAriaⅡ流式細胞儀(BD公司),人TrkB、Akt、磷酸化Akt蛋白的ELISA試劑盒(R&D公司)。日本OLYMPUS倒置顯微鏡,Thermo公司的Multiskan FC酶標儀。
1.2.1 人神經(jīng)元細胞培養(yǎng)與分組
人神經(jīng)元專用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)人腦皮質神經(jīng)元細胞。第3-5代細胞進行實驗,這些細胞未出現(xiàn)死亡等現(xiàn)象。無任何刺激進行培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞為對照組。35μmol/L DHF刺激神經(jīng)元細胞為DHF組;若同時加入10μmol/L Triciribine者為Akt抑制劑組。
1.2.2 CCK-8實驗
7.50×103人腦皮質神經(jīng)元細胞種植到96孔細胞培養(yǎng)板,37?C,5%CO2培養(yǎng)12h。按實驗分組添加相應試劑,同時添加10μl CCK-8試劑,37?C,5%CO2培養(yǎng)4h。Multiskan FC酶標儀于450 nm測量吸光度值(Absorbance value,A值)。
1.2.3 流式細胞凋亡實驗
0.25%胰酶-EDTA溶液消化各組細胞,5.5×105各組細胞以12.5ml/L(體積比)AnnexinⅤ-FITC溶液重懸孵育15min;4℃,1000r/min離心5min,加入20g/L碘化丙啶孵育3min;4℃,0.01mmol/L PBS懸浮細胞。FACSAriaⅡ流式細胞儀檢測細胞凋亡數(shù)目。
1.2.4 ELISA
9.0×106各組細胞,4℃,以RIPA蛋白裂解液裂解并提取蛋白質;BCA蛋白定量試劑盒檢測總蛋白濃度,每組30μg蛋白用于ELISA檢測。人Akt、磷酸化Akt蛋白的ELISA試劑盒檢測各組細胞裂解液中Akt(312.0-20,000 pg/mL)、磷酸化Akt蛋白(156.0-10,000 pg/mL)蛋白含量。
1.2.5 統(tǒng)計學分析
GraphPad_Prism 8.0.2.263軟件分析數(shù)據(jù),計量資料采用單因素方差分析,兩兩間比較采用Q檢驗。P<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。
CCK-8實驗發(fā)現(xiàn),對照組、DHF組和Akt抑制劑組人腦皮層神經(jīng)元細胞增殖A值相比,數(shù)據(jù)具有明顯差異(P<0.01)。相對于對照組和Akt抑制劑組,DHF組人腦皮層神經(jīng)元細胞增殖A值顯著增高(P<0.01);相對于DHF組,Akt抑制劑組人腦皮層神經(jīng)元細胞增殖A值顯著降低(P<0.01),見表1。
表1 各組人皮層神經(jīng)元細胞A值、凋亡數(shù)目的比較(,n=6)
表1 各組人皮層神經(jīng)元細胞A值、凋亡數(shù)目的比較(,n=6)
注:*P<0.01,與對照組相比;#P<0.01,與DHF組相比。
流式細胞凋亡實驗發(fā)現(xiàn),對照組、DHF組和Akt抑制劑組人皮層神經(jīng)元細胞凋亡數(shù)目相比,具有明顯差異(P<0.01)。相對于對照組和Akt抑制劑組,DHF組人皮層神經(jīng)元細胞凋亡數(shù)目明顯降低(P<0.01);相對于DHF組,Akt抑制劑組人腦皮層神經(jīng)元細胞凋亡數(shù)目顯著增多(P<0.01),見表1。體外實驗說明DHF能夠促進人腦皮層神經(jīng)元細胞增殖,抑制其凋亡。
對照組、DHF組和Akt抑制劑組人腦皮層神經(jīng)元細胞Akt、磷酸化-Akt蛋白含量有顯著差異(P<0.01)。與對照組相比,DHF組Akt、磷酸化-Akt蛋白含量均明顯增高(P<0.01),相對于DHF組,Akt抑制劑組的Akt、磷酸化-Akt蛋白含量均明顯降低(P<0.01),表2。
表2 各組人皮層神經(jīng)元細胞Akt、P-Akt蛋白含量的比較(,pg/mL,n=6)
表2 各組人皮層神經(jīng)元細胞Akt、P-Akt蛋白含量的比較(,pg/mL,n=6)
注:*P<0.01,與對照組相比;#P<0.01,與DHF組相比。
出血性腦中風(ICH)發(fā)病率和死亡率逐年升高[5]。即使出血性腦中風(ICH)患者存活,也常伴隨著長期的神經(jīng)功能障礙。研究發(fā)現(xiàn),7,8-二羥基黃酮(DHF)結構與BDNF相似,皆與TrkB結合,引起TrkB磷酸化,有效活化其下游PI3K/Akt、MAPK/Erk信號傳遞路徑以對抗細胞凋亡[6];動物實驗腹腔注射DHF后2小時,能有效活化腦神經(jīng)細胞上TrkB而抑制細胞凋亡[4]。以DHF取代BDNF的作用活化TrkB,在臨床抗高血壓、保護神經(jīng)細胞、并能有效改善腦神經(jīng)損傷壓力與老化所造成的記憶功能缺損、運動神經(jīng)傷害等問題,但是DHF對腦出血性腦損傷的保護作用,DHF能否改善ICH造成的神經(jīng)細胞凋亡還需要進一步研究。
為了研究DHF對ICH神經(jīng)元細胞的保護效果,利用CCK-8實驗發(fā)現(xiàn),對照組、DHF組和Akt抑制劑組三組人腦皮層神經(jīng)元細胞增殖A值具有顯著差異。相對于對照組和Akt抑制劑組,DHF組人腦皮層神經(jīng)元細胞增殖A值最高;相對于DHF組,Akt抑制劑組人腦皮層神經(jīng)元細胞增殖A值顯著降低(P<0.01)。在一項評價7,8-二羥基黃酮(DHF)對過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)引起PC12細胞損傷的研究中,也采用細胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)法檢測PC12細胞活力,AnnexinⅤ-FITC/碘化丙啶雙染法結合流式細胞儀觀察并分析PC12細胞凋亡情況。結果發(fā)現(xiàn),DHF可以減輕H2O2引起的PC12細胞損傷,促進PC12細胞增殖,抑制其凋亡[7]。本實驗研究結果與這些學者的研究相符,均證明DHF能夠促進細胞增殖,抑制細胞凋亡,對細胞具有一定保護效果。此外,本實驗還發(fā)現(xiàn)DHF組Akt、磷酸化Akt蛋白明顯高表達,在Akt信號通路與FUS相互作用關系的研究中,證實了FUS通過AKT通路促進內(nèi)皮祖細胞增殖并介導其自噬[8]。EGFR能夠活化PI3K-Akt信號通路,促進精原母細胞瘤細胞增殖和遷移[9]。若阻斷PI3K-Akt-BCL-2信號通路,可以減輕SD大鼠大腸癌發(fā)生和發(fā)展[10]。本實驗的結果提示DHF作用的ICH能夠顯著修復或改善ICH神經(jīng)元損傷。研究結果將為開展神經(jīng)元保護,促使ICH患者康復提供有效的靶向修復思路。體外實驗也發(fā)現(xiàn),DHF作用的人皮質神經(jīng)元細胞增殖水平明顯升高,其凋亡能力顯著降低,更證實了DHF能夠通過Akt信號通路調控人皮質細胞增殖和凋亡,與實驗的預期結果相符。本實驗在細胞水平進行初步探索,還缺少體內(nèi)動物實驗的相關證據(jù),后期將利用大鼠ICH模型,進一步觀察DHF對ICH神經(jīng)元的保護作用。