張新圖，肖輝

(1.湖南中醫(yī)藥高等?？茖W校附屬第一醫(yī)院/湖南省直中醫(yī)醫(yī)院藥學部，湖南 株洲 412000；2.湖南中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院藥學部，湖南 長沙 410007)

0 引言

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)是伴隨于缺血性心臟病的病理生理過程，其受損程度可影響病情的預(yù)后，當前臨床上尚缺乏針對心肌缺血再灌注損傷的有效治療手段。雷帕霉素(rapamycin)為新型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，常用于治療自身免疫性疾病及器官移植排斥反應(yīng)[1,2]；近年有報道稱，雷帕霉素對心肌缺血再灌注損傷動物具有保護作用[3]。本研究通過制備心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，進一步探索雷帕霉素的心肌保護作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SD 大鼠，清潔級，♀♂各半，體重(180±20)g，由武漢生物制品研究所有限責任公司實驗動物室提供，所有動物相關(guān)操作均經(jīng)本單位動物倫理委員會批準。

1.2 藥物與試劑

雷帕霉素，美國Sigma 公司，臨用前用0.5% 羧甲基纖維素鈉(carboxymethylcellulose sodium salt, CMC-Na) 配制。氯化硝基四氮唑藍(nitro blue tetrazolium chloride, NBT)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO) 試劑盒，南京建成生物工程研究所。細胞間黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)多克隆抗體及免疫組織化學試劑盒，上海哈靈生物科技有限公司。

1.3 主要儀器

生物顯微鏡，日本Olympus 公司；自動勻漿機，金瑞鴻捷公司；冷凍離心機，德國Hettich 公司；醫(yī)學影像分析系統(tǒng)，北京眾實迪創(chuàng)公司；紫外可見分光光度計，美國Thermo 公司；十二導(dǎo)聯(lián)心電圖機，日本Nihon 公司；小動物人工呼吸機，安徽正華公司。

2 實驗方法

2.1 心肌缺血再灌注損傷模型的制備

參照文獻[4]，行冠脈結(jié)扎術(shù)。簡言之，大鼠以戊巴比妥鈉麻醉，仰位固定于手術(shù)臺，頸部備皮、分離氣管，連接小動物人工呼吸機以輔助呼吸，四肢連接十二導(dǎo)聯(lián)心電圖機以監(jiān)測心電圖；將左胸第3、4 肋骨處備皮、分離筋肉，將肋骨間隙撐大以暴露心臟，取縫合線穿過左冠脈前降支的起始部，于縫合線和冠脈間墊一軟管，將縫合線結(jié)扎以使心肌進入缺血狀態(tài)，最后將心臟納回原處；約30min 左右可見心電圖ST 段或T 波明顯抬高，繼而松開冠脈結(jié)扎處再灌注2h，可見抬高的ST 段或T 波明顯下降。假手術(shù)組大鼠開胸但不結(jié)扎冠脈，余操作同上。

2.2 分組治療

將30 只大鼠隨機分3 組(n=10)：模型組(等體積溶媒)、雷帕霉素組(5mg/kg)、假手術(shù)組(等體積溶媒)。造模前1 周開始灌胃給藥(體積按10 mL/kg)，每天1 次。

2.3 心肌梗死率的測算

再灌注結(jié)束后，動物處死，取心臟，清洗后，從心尖起將左心室平行切片，置于0.1% NBT 染色液15min，拍攝圖像并通過ImagePro 軟件分別測量心肌梗死區(qū)面積和心室總面積，計算心肌梗死率(%)。

2.4 檢測心肌MPO 活力

取部分洗凈的心臟，勻漿，低溫離心10min(3500r/min)后取上清，上紫外可見分光光度計比色法測定光密度(OD)值，并按說明書規(guī)程計算MPO 活力(U/g)。

2.5 檢測心肌組織ICAM-1 表達

取部分洗凈的心臟，固定于4%多聚甲醛液，按免疫組化說明書規(guī)程，常規(guī)脫水、包埋、切片、封片，采集圖像，導(dǎo)入醫(yī)學影像系統(tǒng)進行分析，ICAM-1 陽性表達以積分光密度(IOD)值表示。

2.6 統(tǒng)計學分析

3 實驗結(jié)果

3.1 雷帕霉素對心肌梗死率的影響

假手術(shù)組大鼠心肌未見梗死，模型組心肌梗死率37.92%，雷帕霉素組可使心肌梗死率降低至31.99%，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 各組大鼠心肌梗死率比較(± s, n = 10)

3.2 雷帕霉素對中性粒細胞浸潤的影響

模型組動物心肌MPO 活力顯著升高至425.70 U/g，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；雷帕霉素組心肌MPO活力明顯降低至332.69 U/g，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，提示雷帕霉素可減輕中性粒細胞浸潤程度，見圖2。

圖2 各組大鼠心肌MPO 活力比較(± s, n = 10)

3.3 雷帕霉素對心肌ICAM-1 表達的影響

假手術(shù)組心肌組織ICAM-1 表達極低，模型組動物心肌 組 織ICAM-1 表 達 則 明 顯 升 高(IOD 值：24.93 ± 4.98)，組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；與模型組相比，雷帕霉素組可顯著降低心肌組織ICAM-1 表達(IOD 值：17.06 ±4.17)(P＜0.01)，見圖3。

圖3 各組大鼠心肌ICAM-1 表達比較(±s, n = 10)

4 討論

心肌缺血再灌注損傷仍缺乏行之有效的防治方法，目前其治療措施主要有：①模擬內(nèi)源性保護劑；②清除氧自由基；③抗細胞凋亡；④減輕細胞內(nèi)Ca2+超載；⑤抑制炎癥反應(yīng)；⑥缺血預(yù)處理(ischemic preconditioning，IP)等。缺血預(yù)處理使人們對器官保護產(chǎn)生了新的認識，但往往因倫理問題而難以在臨床上推廣開來。近年來有學者提出藥物預(yù)處理(pharmacological preconditioning，PP)的新策略，通過藥物預(yù)處理，提前激活內(nèi)源性保護途徑，抑制機體內(nèi)源性毒性物質(zhì)的產(chǎn)生，阻斷繼發(fā)性損傷的級聯(lián)反應(yīng)，或促進機體釋放生物活性物質(zhì)，以增強心肌對缺血再灌注損傷的耐受[5,6]，這對探索心肌缺血再灌注損傷的臨床治療方法具有重要意義。本研究采用心肌缺血再灌注損傷發(fā)生前1 周口服雷帕霉素的預(yù)處理方式，結(jié)果表明雷帕霉素能顯著降低心肌缺血再灌注損傷大鼠的心肌梗死率，提示雷帕霉素具有心肌保護作用。

炎癥反應(yīng)是缺血再灌注引發(fā)間接損傷的重要病理特點之一，主要表現(xiàn)為炎癥細胞( 如中性粒細胞) 聚集浸潤、多種炎性細胞因子和黏附分子過度表達等[7]；抑制炎癥反應(yīng)可能成為防治心肌缺血再灌注損傷的有效手段[8]。心肌缺血再灌注損傷發(fā)生時炎癥細胞因子被激活，誘導(dǎo)大量的炎性細胞黏附于血管內(nèi)皮細胞，進而促使蛋白水解酶、氧自由基、收縮血管因子等參與心肌缺血再灌注損傷進程，缺血區(qū)的炎癥細胞則同時分泌大量的細胞因子及炎癥介質(zhì)，如白介素(interleukin)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa B)、MPO 等，這些因子誘導(dǎo)缺血區(qū)內(nèi)皮細胞表達更多的細胞間黏附分子1(ICAM-1)、P 選擇素及E 選擇素等，進而介導(dǎo)中性粒細胞黏附于內(nèi)皮細胞并浸潤到心肌組織，既可影響凝血系統(tǒng)減少血供，又可釋放蛋白水解酶破壞血管壁的完整性，造成心肌細胞受損或其功能降低[9-11]。研究證實，大鼠缺血心肌組織中性粒細胞數(shù)量明顯比正常心肌組織高，并可在再灌注2 h 時達到最高點[12]；而抑制中性粒細胞活化及浸潤則可減輕心肌受損程度[13]。本研究結(jié)果表明，再灌注2 h 后中性粒細胞標志物MPO 酶活力明顯增高，提示中性粒細胞的浸潤嚴重，雷帕霉素預(yù)處理可使心肌MPO 酶活力顯著降低(P＜0.01)，表明雷帕霉素可通過減少中性粒細胞活化，抑制其浸潤，實現(xiàn)心肌保護作用。

黏附分子ICAM-1 為免疫球蛋白超家族成員之一，又稱CD54，體內(nèi)存在于多種細胞表面，介導(dǎo)細胞間的黏附作用；ICAM-1 在正常心肌細胞表面僅有微量表達，當心肌缺血再灌注發(fā)生時在細胞因子(NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α 等)的誘導(dǎo)下會過量表達，與淋巴細胞功能相關(guān)抗原-1(lymphocyte function-associated antigen 1) 及巨噬細胞活化趨化因子-1(Macrophage activation chemokine 1)結(jié)合，參與炎癥級聯(lián)反應(yīng)[14]。在ICAM-1 介導(dǎo)下，可促使血液中白細胞激活和血管內(nèi)皮細胞活化，大量白細胞遷移、積聚到心肌缺血區(qū)，進而與血管內(nèi)皮細胞黏附，這些白細胞可活化血小板及凝血系統(tǒng)，引起血栓形成和微循環(huán)不暢，減少缺血區(qū)的血供；同時本身又會釋放多種蛋白水解酶、過氧化物、炎癥介質(zhì)等，蛋白水解酶可解離血管內(nèi)皮細胞和基底膜細胞，破壞血管壁的完整性，使炎癥細胞容易通過并聚集到缺血區(qū)，過氧化物和炎癥介質(zhì)可進一步損傷心肌細胞，造成心肌缺血再灌注損傷的加重[15]。據(jù)報道，實驗動物心肌組織中性粒細胞浸潤數(shù)量與ICAM-1的表達呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)[16]。本研究結(jié)果表明，再灌注2 h后心肌ICAM-1 表達明顯增高，提示ICAM-1 的高表達參與了缺血再灌注損傷的病理進程，這與上述報道結(jié)果類似；雷帕霉素組心肌ICAM-1 表達明顯降低(P＜0.01)，提示雷帕霉素可通過抑制ICAM-1 表達，減少中性粒細胞等炎性細胞在缺血區(qū)的黏附及浸潤，緩解了心肌缺血區(qū)的炎癥反應(yīng)。

總之，雷帕霉素預(yù)處理可保護心肌缺血再灌注損傷大鼠的受損心肌組織，其作用機制可能與減少中性粒細胞浸潤、抑制黏附分子ICAM-1 高表達、緩解炎癥反應(yīng)等有關(guān)。