王秋生

（江蘇省海安市畜牧獸醫(yī)站 226600）

在導(dǎo)致雞胚死亡的眾多原因中，細(xì)菌是常見原因之一，國內(nèi)外有不少因細(xì)菌感染而造成雞胚大量死亡的實(shí)例。研究表明，部分禽病如傳染性支氣管炎、雞傷寒、葡萄球菌病，這類禽病的病原菌或病毒傳遞給后代的主要途徑是侵害種禽卵巢，造成嚴(yán)重的危害。部分禽病如大腸桿菌病傳遞給后代的途徑有兩種，一是通過蛋殼，二是通過蛋內(nèi)。通過攜帶病原菌的糞便污染蛋殼，從而在孵化過程中造成不同程度的影響，另外可以引發(fā)一系列的禽類生殖器官方面的疾病，繼而可通過蛋傳遞，造成大批禽胚的死亡[1]。

為了搞清在孵化過程中導(dǎo)致雞胚死亡的細(xì)菌種類及其檢出率，需要對死亡雞胚進(jìn)行細(xì)菌的分離與鑒定。2021 年3 月海安市某養(yǎng)雞場送檢的80 份死亡雞胚，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室診斷為細(xì)菌感染。本文對該病原菌進(jìn)行了分離與鑒定，以及藥敏試驗(yàn)等，從細(xì)菌方面去分析雞胚死亡的原因，為提高種蛋孵化率提供理論依據(jù)，以此提高經(jīng)濟(jì)效益[2]。

1 材料

1.1 病料

2021 年3 月海安市某養(yǎng)雞場送檢的80 份死亡雞胚。

1.2 藥品試劑和器材

1.2.1 藥品試劑

藥品試劑：乙醇、碘酊、福爾馬林溶液、生理鹽水、乙醚、6%α 萘酚乙醇溶液、40%氫氧化鉀溶液、革蘭氏染色試劑、甲基紅試劑、吲哚試劑、藥敏紙片。

培養(yǎng)基：普通營養(yǎng)瓊脂平板、血液瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、EMB 平板、糖發(fā)酵試驗(yàn)培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。

1.2.2 器材

鑷子、剪刀、接種環(huán)、移液槍、托盤、廣口試劑瓶、眼科剪子、載玻片、蓋玻片、抗凝離心管，光學(xué)顯微鏡、超凈工作臺、冰箱、恒溫培養(yǎng)箱、PCR 儀、凝膠電泳儀、生物安全柜等。

1.3 引物

細(xì)菌的PCR 擴(kuò)增中通用引物為27F 和1492R，如下。

引物27F：5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'。

引物1492R：5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

擴(kuò)增長度約為1400bp。

2 方法

2.1 病理剖檢

在送來的80 份死亡雞胚中隨機(jī)取樣，抽取20 只死亡雞胚進(jìn)行剖檢，觀察尿囊液的變化和內(nèi)臟的病理變化，記錄結(jié)果。

2.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

在超凈工作臺上，先用75%酒精對死亡雞胚進(jìn)行消毒，然后用鑷子敲碎蛋殼一側(cè)，再用滅菌的眼科鑷子把殼膜撕開，扒出氣室。用鑷子將雞頭壓住，再操作移液槍吸取尿囊液，存放至抗凝離心管中。對從死亡雞胚中分離出的尿囊液材料采用平板劃線法進(jìn)行分離培養(yǎng)，使用無菌接種環(huán)沾取少許液體在平板上連續(xù)劃線，經(jīng)過37℃下培養(yǎng)約24h 可得到單菌落，然后再分辨不同形態(tài)特征的單菌落，挑取后進(jìn)行純培養(yǎng)。

從純培養(yǎng)的單菌落中挑取培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色試驗(yàn)，觀察其形態(tài)及在培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特性。

2.3 生化試驗(yàn)

穿刺接種糖發(fā)酵試驗(yàn)管、三糖鐵培養(yǎng)基。進(jìn)行甲基紅試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、VP 試驗(yàn)。進(jìn)行培養(yǎng)并記錄結(jié)果，判定標(biāo)準(zhǔn)可參照該公司操作方法與標(biāo)準(zhǔn)[3]。

2.4 溶血性試驗(yàn)

從培養(yǎng)基中挑取不同分離菌的單個菌落接種至血平板上，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時間為24h，再觀察培養(yǎng)基中是否出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。

2.5 16S rDNA 擴(kuò)增和測序

將試驗(yàn)中分離到的細(xì)菌依照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒的說明書制備DNA 模板，采用通用引物擴(kuò)增出細(xì)菌16S rRNA序列，再將目的片段進(jìn)行切膠純化后送生物公司進(jìn)行測序，測序后將其結(jié)果與BLAST 和GenBank 公布的序列進(jìn)行比對分析，鑒定細(xì)菌種屬。

若測得的序列與基因庫中細(xì)菌的比對同源性達(dá)到97%以上則可認(rèn)為是同一種細(xì)菌。

2.6 藥敏試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法。

3 結(jié)果

3.1 剖檢變化

部分死亡雞胚剖檢結(jié)果為卵黃囊發(fā)炎，卵黃有吸收不良現(xiàn)象，大部分有黃綠色干酪樣物質(zhì)。部分死亡雞胚剖檢可觀察到機(jī)體消瘦和關(guān)節(jié)局部化膿的現(xiàn)象[4]。

3.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

從送檢雞胚尿囊液中分離細(xì)菌，于血平板上培養(yǎng)24h 后，結(jié)果共分離到7 種細(xì)菌，本試驗(yàn)中分別命名為B1～B9，將分離到的細(xì)菌進(jìn)行純培養(yǎng)。

3.3 細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察

37℃培養(yǎng)24h 后顯示，B1在平板上形成比較大的白色或略帶一些灰色的表面光滑、濕潤的大菌落，大部分呈不透明狀，少部分邊緣少許透明，B2、B4在平板上形成圓形凸起狀、表面光滑濕潤的菌落，邊緣整齊，不透明，B3、B9在平板上形成圓形凸起狀、露珠狀的菌落，B5、B6在平板上形成圓形、表面光滑的黃色菌落，不透明，B7在平板上形成圓形凸起狀、表面光滑濕潤的白色露滴狀菌落，呈半透明狀態(tài)，B8在平板上形成圓形、表面光滑的灰色菌落，直徑約為1mm 左右。

挑取B1～B9單個菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，結(jié)果顯示：B1、B3和B9為革蘭氏染色陰性桿菌，B1菌體呈兩端鈍圓狀，多數(shù)為單個散在或者成對存在，偶爾有2～3 個菌體相連，菌體直徑約為0.4～2.0μm。B3、B9為革蘭氏陰性小桿菌，菌體呈單個散在、成對存在或絲狀存在，菌體直徑約為0.2～0.4μm×1～5μm，無芽孢，不運(yùn)動；B2、B4、B5、B6、B7和B8為革蘭氏染色陽性菌，B2、B4、B5和B6菌體呈球形或橢圓形，排列成葡萄狀，菌體直徑約1.0μm，無芽孢，無鞭毛，B7為革蘭陽性短桿狀或球桿狀，排列不規(guī)則，B8 為革蘭氏陽性球菌，呈四聯(lián)、成團(tuán)塊狀排列，也有單個成雙排列。

3.4 溶血試驗(yàn)結(jié)果

B1出現(xiàn)明顯溶血現(xiàn)象，B2、B4出現(xiàn)明顯的β 溶血現(xiàn)象，B3、B9無溶血現(xiàn)象，B5、B6在血培養(yǎng)基上出現(xiàn)透明的溶血環(huán)，B7不溶血，B8 出現(xiàn)α 溶血現(xiàn)象。

3.5 生化鑒定結(jié)果

結(jié)果見表1。

表1 生化試驗(yàn)結(jié)果

3.6 16S rDNA 的序列分析

對16S rDNA 引物進(jìn)行PCR 反應(yīng)，電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符合的條帶。目的片段送至公司測序，結(jié)果鑒定出B1為大腸埃希菌，B2為腐生葡萄球菌，B3為鴨疫里默氏桿菌，B4為葡萄球菌，B5為松鼠葡萄球菌，B6為松鼠葡萄球菌，B7為棒狀桿菌，B8為氣球菌，B9為鴨疫里默氏桿菌。

3.7 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果見表2 及表3。

表3 G+分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

4 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)通過分離培養(yǎng)和染色鏡檢觀察細(xì)菌形態(tài)，并將分離到的細(xì)菌進(jìn)行生化試驗(yàn)。通過16srRNA 方法對分離所得的細(xì)菌進(jìn)行鑒定，經(jīng)鑒定分別為大腸埃希菌、腐生葡萄球菌、鴨疫里默氏桿菌、葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、棒狀桿菌、氣球菌?？梢源_定該批雞胚的死亡與感染細(xì)菌有很大關(guān)系。

4.1 對生化試驗(yàn)和溶血試驗(yàn)等結(jié)果的討論

此次分離得的7 種細(xì)菌生化試驗(yàn)結(jié)果如上文結(jié)果所示，基本與各菌的生化特性相符合。另外，大部分分離菌在血平板上出現(xiàn)了明顯的溶血現(xiàn)象，這說明分離所得的大腸埃希菌、葡萄球菌、氣球菌具有一定的致病性。

4.2 對藥敏試驗(yàn)結(jié)果的討論

由藥敏試驗(yàn)結(jié)果表可知，從死亡雞胚中分離到的7 種細(xì)菌在不同抗生素藥物作用下的藥敏試驗(yàn)數(shù)據(jù)能有效篩選出適合防治細(xì)菌感染病的藥物[5]。

4.3 對防治雞胚感染細(xì)菌的建議

在研究和生產(chǎn)實(shí)踐中表明，本試驗(yàn)在死亡雞胚中分離所得的大腸桿菌、葡萄球菌、鴨疫里默氏菌等均是影響雞胚發(fā)育的常見病原菌，棒狀桿菌和氣球菌則比較少見，提醒人們在防治雞病過程中應(yīng)注意到可能會存在一些不常見細(xì)菌的混合感染。此次分離的不少菌株是條件性致病菌，與雞群的免疫力也有著密切的聯(lián)系。對細(xì)菌造成的雞胚疾病的防治重點(diǎn)在于，因?yàn)榧?xì)菌感染雞胚從而影響雞胚發(fā)育生長的途徑主要有兩種，一是母體垂直傳播感染，二是受外界環(huán)境污染所致，所以要預(yù)防細(xì)菌感染雞胚也要從兩個方面采取措施，一是預(yù)防種雞感染細(xì)菌，二是減少雞胚受環(huán)境污染[6]。

根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果可有效篩選適合用于防治這些細(xì)菌感染病的抗生素。不過在使用抗生素藥物時也要考慮細(xì)菌耐藥性，尤其是極易產(chǎn)生耐藥性的大腸桿菌，應(yīng)更加嚴(yán)謹(jǐn)合理地選擇用藥，避免濫用抗生素，減少細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，同時還要注意按時按量用藥及交替用藥，最大程度的降低養(yǎng)殖戶的損失。在本次試驗(yàn)中，重點(diǎn)觀察本次分離所得的松鼠葡萄球菌對本次藥敏試驗(yàn)所用的藥物均不敏感，需進(jìn)行更多的試驗(yàn)尋找能對其產(chǎn)生抑制作用的藥物[7]。

除了采取藥物措施外，還應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理方面問題，提供良好的禽舍環(huán)境，避免不良應(yīng)激因素對雞群造成的影響，同時需經(jīng)常對環(huán)境進(jìn)行消毒防疫，保證雞群生長環(huán)境的衛(wèi)生。這樣才能增強(qiáng)雞群自身的免疫力，減少條件性致病菌引發(fā)疾病的概率[8]。

總之，本試驗(yàn)從80 份死亡雞胚中成功分離鑒定出7 種細(xì)菌，為查明該雞場雞胚死亡的主要因素是細(xì)菌性感染提供了試驗(yàn)依據(jù)，藥敏試驗(yàn)研究結(jié)果為該雞場對細(xì)菌性疾病的防治用藥提供了數(shù)據(jù)支持。此外，這7 種細(xì)菌中的一些分離菌對雞的致病能力還存在未知部分，需要通過更多的試驗(yàn)去深入研究。