陳凱，廖芮，楊洪吉，朱世凱，楊沖，董丹丹，李科，李有贊

610072 成都，四川省人民醫(yī)院，電子科技大學(xué) 器官移植中心(陳凱、楊洪吉、朱世凱、楊沖)，病理科(董丹丹、李科)； 646099 四川 瀘州，西南醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院(廖芮、李有贊)

胰腺癌臨床表現(xiàn)隱匿、早期診斷困難、臨床預(yù)后極差，且全球范圍內(nèi)發(fā)病人數(shù)和病死率呈不斷上升的趨勢[1-2]，其中位生存時(shí)間6～9個(gè)月，1年生存率約18%，5年生存率僅約5%[3-4]。胰腺癌的病因及生物學(xué)行為復(fù)雜，探討胰腺癌侵襲及轉(zhuǎn)移過程的有關(guān)分子機(jī)制，對提高胰腺癌的治療效果具有重要的理論及臨床意義。巨噬細(xì)胞是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)中重要的組成部分，通過直接殺傷或誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答的方式清除腫瘤細(xì)胞，廣泛參與體內(nèi)固有免疫和適應(yīng)性免疫[5]。然而巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中也可發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長、抑制T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞抗腫瘤活性，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用，將其稱之為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages,TAMs)[6-7]。根據(jù)細(xì)胞自身及活化微環(huán)境的多樣性，TAMs又分為經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞型M1型(抗腫瘤)和替代激活的M2型(促腫瘤)[8]。然而M2型TAMs在胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制尚不明確，本研究通過免疫組織化學(xué)的方法，分析胰腺癌組織中巨噬細(xì)胞的表達(dá)及其與臨床病理特征之間的關(guān)系，探討其對患者預(yù)后的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象

研究對象來自2017年1月至2019年12月在四川省人民醫(yī)院器官移植中心接受手術(shù)治療的208例胰腺導(dǎo)管腺癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：1)術(shù)后病理證實(shí)為胰腺導(dǎo)管腺癌；2)在我院首治患者，且術(shù)前未進(jìn)行過放療、化療及抗炎治療等；3)行胰十二指腸切除術(shù)或胰體尾切除術(shù)；4)患者臨床病理及術(shù)后隨訪資料完整。本研究全部患者的知情同意均已獲得，且通過了四川省人民醫(yī)院倫理委員會的審查，符合倫理學(xué)要求。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料收集 通過病案管理系統(tǒng)采集患者入院時(shí)的基線資料，包括性別、年齡、既往疾病史等，記錄患者臨床病理特征，包括手術(shù)方式、腫瘤部位、臨床分期、腫瘤病理類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯等。

1.2.2 免疫組化染色及結(jié)果判定 所有手術(shù)標(biāo)本均常規(guī)石蠟包埋、切片，行免疫組織化學(xué)染色，首先采用鼠抗人CD68和CD163單克隆抗體單克隆抗體(北京中杉生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)，采用Envision二步法試劑盒和二氨基聯(lián)苯氨(DAB)顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品)按照說明書進(jìn)行操作。結(jié)果判斷：采用半定量法，在低倍視野下找到10個(gè)CD68和CD163陽性細(xì)胞聚集最多的熱點(diǎn)區(qū)域，在高倍視野下對熱點(diǎn)區(qū)域的TAMs細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并根據(jù)染色程度和著色細(xì)胞百分比進(jìn)行結(jié)果判定。染色程度：不著色計(jì)0分、淡黃色計(jì)1分、棕黃色計(jì)2分、棕褐色計(jì)3分；著色陽性細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分比<5%計(jì)0分、5%～25%計(jì)1分、>25%～50%計(jì)2分、>50%計(jì)3分；將兩項(xiàng)得分相加作為總分，總分0～1分為陰性(-)、2～3分為低表達(dá)(+)、4～5分為中表達(dá)(++)、6分為高表達(dá)(+++)，統(tǒng)計(jì)時(shí)將低、中、高表達(dá)歸入陽性表達(dá)組。

1.2.3 隨訪 術(shù)后采用電話隨訪、門診復(fù)診的方式對患者術(shù)后生存情況進(jìn)行隨訪以獲取患者的總生存期(overall survival,OS)，隨訪截止日期為2020年12月31日，OS是指從手術(shù)之日起至死亡或隨訪截止時(shí)所經(jīng)歷的時(shí)間?；颊呔芙^隨訪或因各種原因無法聯(lián)系者視為失訪。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。對符合或近似符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，組間比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用率或構(gòu)成比[n(%)]進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；雙向有序變量之間的相關(guān)性檢驗(yàn)采用兩組或多組獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，生存期的單因素比較采用Log-rank法，采用多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析影響患者預(yù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。以P<0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床病理特征

本研究共納入胰腺導(dǎo)管腺癌患者208例，其中男性92例(44.2%)、女性116例(55.8%)；年齡41～77歲，平均年齡(58.8±7.7)歲；腫瘤部位：胰頭129例(62.0%)、胰體尾79例(38.0%)；分化程度：高分化50例(24.0%)、中分化87例(41.8%)、低分化71例(34.1%)；腫瘤平均大小(3.1±0.6)cm，≤2 cm者67例(32.2%)、>2cm者141例(67.8%)；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期62例(29.8%)、Ⅲ～Ⅳ期146例(70.2%)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移137例(65.9%)，血管侵犯75例(36.1%)。

2.2 胰腺癌組織中CD68、CD163的蛋白表達(dá)

CD68及CD163的蛋白表達(dá)主要定位于胞質(zhì)，兩者染色均呈為棕黃或棕褐色，見圖1、2。CD68和CD163的陽性表達(dá)率分別為84.1%(175/208)和76.0%(158/208)。

圖1 胰腺癌組織中CD68的表達(dá)(免疫組化染色，×100)

圖2 胰腺癌組織中CD163的表達(dá)(免疫組化染色，×100)

2.3 CD68、CD163的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

CD68的陽性表達(dá)與腫瘤臨床分期密切相關(guān)，腫瘤臨床分期越晚其陽性表達(dá)率也越高(P<0.05)；CD163的陽性表達(dá)與腫瘤臨床分期、腫瘤大小密切相關(guān)，臨床分期越晚、腫瘤越大其陽性表達(dá)率也越高(P<0.05;表1)。

表1 CD68、CD163的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 CD68、CD163雙表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

將208例胰腺癌患者依據(jù)其CD68、CD163雙表達(dá)情況分為4組：CD68-/CD163-組24例(11.5%)、CD68-/CD163+組62例(29.8%)、CD68+/CD163-組47例(22.6%)、CD68+/CD163+組75例(36.1%)。結(jié)果顯示，CD68+和CD163+雙表達(dá)與腫瘤臨床分期、腫瘤大小密切相關(guān)，臨床分期越晚、腫瘤越大其雙陽性表達(dá)率也越高(P<0.05;表2)。

表2 CD68、CD163雙表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

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Clinicopathological parameterCD68-CD68+CD163-(n)CD163+(n)CD163-(n)CD163+(n)χ2/ H/ZPTumor site0.833a0.842 Head of pancreas13383048 Tail of pancreas11241727Degree of differentiation0.512c0.774 Highly differentiated8141117 Moderately differentiated9272031 Poorly differentiated7211627Clinical stage-3.454b0.001 I-II11211218 III-IV13413557Lymph node metastasis-0.132b0.895 No9201725 Yes15423050Vascular invasion-0.304b0.761 No14412949 Yes10211826

2.5 影響胰腺癌患者預(yù)后生存的單因素及多因素分析

單因素分析顯示，腫瘤大小、臨床分期及CD68、CD163陽性表達(dá)均與患者的預(yù)后生存相關(guān)(P<0.05)。進(jìn)一步的多因素分析顯示，腫瘤大小>2 cm、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期及CD68陽性表達(dá)是影響胰腺導(dǎo)管腺癌患者預(yù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05;表3。)

表3 胰腺癌患者預(yù)后生存的單因素及多因素分析

(Table 3 continues on next page)

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FactorUnivariate analysisMultivariate analysisHR(95%CI)χ2PHR(95%CI)χ2PLymph node metastasis No13.6000.05812.9590.085 Yes1.028 (0.996-1.060)1.004 (0.992-1.016)Vascular invasion No12.0580.151 Yes1.468 (0.869-2.481)CD68 Negative11 Positive3.347 (1.518-7.378)10.5070.0012.754 (1.249-6.072)6.3090.012CD163 Negative11 Positive2.121 (1.030-4.368)4.1640.0412.091 (0.926-4.722)3.1480.076

3 討 論

胰腺導(dǎo)管腺癌與其它實(shí)體腫瘤一樣，腫瘤間質(zhì)中包含了很多浸潤性免疫細(xì)胞，這其中TAMs占大多數(shù)，然而巨噬細(xì)胞具有很大的異質(zhì)性，在腫瘤微環(huán)境中可作為免疫系統(tǒng)負(fù)向調(diào)控因素，絕大部分的TAMs被激活為M2型TAMs，抑制T細(xì)胞和NK細(xì)胞的抗腫瘤活性，產(chǎn)生大量抗炎因子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖發(fā)展。腫瘤組織內(nèi)或者癌周浸潤的高密度M2型TAMs往往伴隨著不良的預(yù)后。TAMs作為重要的免疫細(xì)胞，在胰腺腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移過程中同樣發(fā)揮著重要作用。Wei等[9]報(bào)道，97例非功能性胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤TAMs浸潤與術(shù)后復(fù)發(fā)關(guān)系密切，CD68評分高是其復(fù)發(fā)的重要預(yù)后因素。Song等[10]報(bào)道，151例非功能性胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤TAMs的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高Ki-67指數(shù)等相關(guān)。但目前針對M2型TAMs與胰腺導(dǎo)管腺癌的關(guān)系尚不十分明了。

本硏究采用免疫組織化學(xué)法檢測由CD68、CD163標(biāo)記的M2型TAMs在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的浸潤表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)CD68和CD163的陽性表達(dá)率分別為84.1%和76.0%。王夢一等[11]的研究顯示，CD68、CD163在胰腺癌標(biāo)本呈現(xiàn)較高的陽性表達(dá)率，且主要聚集在腫瘤侵襲的邊緣、淋巴管、血管和神經(jīng)周圍，其陽性表達(dá)率與腫瘤大小、臨床分期、血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。CD68、CD163是預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移重要指標(biāo)，可有效的評估多種腫瘤的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[12-13]。本研究結(jié)果也顯示，CD68、CD163的陽性表達(dá)與腫瘤臨床分期、腫瘤大小相關(guān)。提示由CD68、CD163標(biāo)記的M2型TAMs在胰腺癌侵襲、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移中起重要作用，并與胰腺癌的惡性生物學(xué)行為有關(guān)，影響胰腺癌患者的預(yù)后。

丁軍利等[14]、葉良濤等[15]對M2型TAMs在胰腺腫瘤患者癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理相關(guān)因素進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)CD68、CD163都具有較高的陽性表達(dá)率，且與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯和臨床分期等相關(guān)。本研究中對影響胰腺癌患者預(yù)后生存進(jìn)行單因素及多因素分析顯示，腫瘤大小>2 cm、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期及CD68陽性表達(dá)是影響胰腺導(dǎo)管腺癌患者預(yù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，危險(xiǎn)比越大，預(yù)后死亡的風(fēng)險(xiǎn)越高。這就可以解釋為何病理分級相同的患者，其預(yù)后之間可能存在巨大差異[16]，說明胰腺導(dǎo)管腺癌預(yù)后與多種危險(xiǎn)因素的綜合影響密切相關(guān)[17-18]，除了單純的評估腫瘤本身臨床病理因素外，還需要重點(diǎn)考慮腫瘤微環(huán)境對預(yù)后的影響[19-20]。

綜上所述，M2型TAMs在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中廣泛浸潤，CD68和CD163的陽性表達(dá)與腫瘤臨床分期、腫瘤大小密切相關(guān)，腫瘤大小>2 cm、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期及CD68陽性表達(dá)是預(yù)測胰腺導(dǎo)管腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。M2型TAMs可作為胰腺導(dǎo)管腺癌預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物。后續(xù)研究中，可以進(jìn)一步深入研究其相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制可能為胰腺癌的治療提供新的思路。

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