張曉宇，蘇建志，齊盼，衛(wèi)書飛，張愛莉

050000 石家莊，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院 泌尿外科

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)為常見惡性腫瘤，約占成人惡性腫瘤的2%～3%，其死亡率呈不斷增長(zhǎng)的態(tài)勢(shì)，全球每年約有10萬人死于RCC，嚴(yán)重威脅人類的健康[1]。腎透明細(xì)胞癌是RCC最常見的亞型，多發(fā)生于近端小管，約占腎癌的75%[2]。隨著RCC診療技術(shù)的不斷進(jìn)步，早期確診的患者可通過手術(shù)治愈，但術(shù)后仍有20%～40%的患者發(fā)生復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且大多數(shù)患者在診斷時(shí)已處于中晚期，預(yù)后較差。盡管靶向藥物可以改善患者的生存率，但耐藥性幾乎是不可避免的[3]。因此，探索RCC發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制，尋找有效的腫瘤轉(zhuǎn)移和耐藥靶點(diǎn)，對(duì)RCC的診斷和治療具有深遠(yuǎn)的意義。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是長(zhǎng)度大于200 bp的RNA分子，其特點(diǎn)為缺乏可識(shí)別的開放閱讀框，以及不具有編碼蛋白質(zhì)的能力[4]。研究表明，lncRNA在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，其調(diào)控方式包括介導(dǎo)染色質(zhì)重塑、組蛋白修飾、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[5]。由于lncRNA表達(dá)的組織特異性，一些特定的lncRNA可成為腫瘤診斷和治療的有效分子靶標(biāo)。LOC100130 476又名WAKMAR2，是位于6q23.3的lncRNA。研究表明，LOC100130476與食管鱗癌和胃賁門腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移以及患者預(yù)后緊密相關(guān)[6-7]，但LOC100130476在RCC的研究較少。本研究旨在檢測(cè)RCC中LOC100130476的表達(dá)和甲基化狀態(tài)，分析其表達(dá)與甲基化狀態(tài)的相關(guān)性，揭示LOC10013 0476甲基化在RCC進(jìn)展中的作用，為RCC的診斷與治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；FBS購自德國Pan-Biotech公司；TRIzol購自北京索萊寶公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、綠色體系和Wizard DNA純化試劑盒購自美國Promega公司；引物由北京賽百盛公司合成；5-Aza-dC購自Sigma公司。

1.2 研究對(duì)象及標(biāo)本來源

組織標(biāo)本取自河北醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院泌尿外科2018年7月1日至2020年7月1日確診為腎癌的手術(shù)患者，所有患者的臨床資料均來自病歷記錄。腎癌患者70 例，其中男性42 例(60%)，女性28 例(40%)。60 歲以下26 例(37.14%)，60 歲以上44 例(62.86%)。所有患者未接受術(shù)前放療或化療。每對(duì)標(biāo)本均取腎癌原發(fā)灶及距原發(fā)灶5 cm以上的相應(yīng)正常組織(針對(duì)較大腫瘤，盡可能選取距原發(fā)灶2 cm以上的正常組織)，并將標(biāo)本分為兩部分,一部分以新鮮狀態(tài)放入組織固定液(RNA later)中，在4℃冰箱孵育過夜，然后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱中以備提取RNA; 另一部分用4%中性甲醛溶液固定，常規(guī)制備蠟塊，切4 μm切片用于HE染色和病理分析。腫瘤組織標(biāo)本由3位病理醫(yī)師診斷為腎透明細(xì)胞癌，且在正常組織中沒有癌細(xì)胞浸潤(rùn)。所有標(biāo)本均具有完整的病理診斷和臨床數(shù)據(jù)，患者的臨床分期符合美國癌癥聯(lián)合會(huì)和國際抗癌聯(lián)盟的標(biāo)準(zhǔn)，腫瘤病理分級(jí)符合WHO標(biāo)準(zhǔn)。本研究的所有患者均已簽署了經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的知情同意書(倫理編號(hào):2020k-1147)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將腎癌細(xì)胞系(A498、ACHN、786-O)及人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞(HK-2)置于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，并在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 5-Aza-dC藥物干預(yù) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分為2組：1)未處理組：不加藥，加入等體積培養(yǎng)液；2)5-Aza-dC處理組：按參考文獻(xiàn)[6]將5 μmol/L 5-Aza-dC加入到培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h。

1.3.3 RT-qPCR檢測(cè) 根據(jù)TRIzol試劑說明書，從HK-2細(xì)胞、腎癌細(xì)胞系、腎癌及相應(yīng)正常組織樣本中提取總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以cDNA為模板，以β-肌動(dòng)蛋白(β-Actin，ACTB)作為內(nèi)參，進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。RT-qPCR引物如下，LOC100130476上游引物：F:5’-AGACAGTCTAACCGTGGGGTA -3’，下游引物：R:5’-CCCAAATTGTRCCGGACCAG-3’；ACTB上游引物：F:5’-ACCGAGCGCGGCTACAG-3’，下游引物：R:5’-CTTAATGTCACRCCCGATT TCC-3’。RT-qPCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min后；95 ℃變性15 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共35 個(gè)循環(huán)；每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。根據(jù)每孔熒光信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)記為該組織中LOC100130476和ACTB基因轉(zhuǎn)錄水平的CT值。采用相對(duì)定量法：△CT=CTLOC100130476-CTACTB，△△CT=△CT癌組織-△CT配對(duì)正常組織，以N=2-△△CT表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量，其數(shù)值表示癌組織與正常組織的相對(duì)倍數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.3.4 甲基化特異性PCR(methylation specific PCR,MSP)檢測(cè) 采用酚/氯仿抽提法，提取組織DNA，定量后，將適量的DNA用2 mol/L氫氧化鈉變性，置10 mmol/L氫醌和3 mmol/L亞硫酸氫鈉中50℃反應(yīng)16 h，然后用DNA純化試劑盒純化DNA樣品。經(jīng)亞硫酸鹽處理后，單鏈DNA的未甲基化胞嘧啶可通過亞硫酸氫鹽脫氨作用轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶則不能被修飾。根據(jù)這一原理，并結(jié)合Meth primer軟件，分別設(shè)計(jì)該基因的甲基化及非甲基化引物，然后進(jìn)行擴(kuò)增和MSP檢測(cè)。圖1中顯示了LOC100130476轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游1 000 bp及CpG島的分布情況，黑色箭頭標(biāo)示MSP引物所在的位置。甲基化引物:F:5’-TATTGCGGTATTTTACGTTTCGTCG-3’，R:5’-AAACGCCCCTCGAACCCTCCGATCG-3’(產(chǎn)物長(zhǎng)度169 bp);非甲基化引物:F:5-’TATTGTGGTATTTTATGTTTTGTTG-3’，R:5’-AAACACCCCTCAAACCCTCCAATCA-3’(產(chǎn)物長(zhǎng)度169 bp)。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min后，95 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)后進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。用經(jīng)甲基化酶處理以后的基因組DNA作為甲基化的陽性對(duì)照，用正常人外周血DNA作為非甲基化的陽性對(duì)照，陰性對(duì)照則用滅菌雙蒸水取代DNA模板進(jìn)行PCR。另隨機(jī)選取10%標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證結(jié)果的可靠性。

圖1 LOC100130476 CpG島及引物位置

1.3.5 MSP結(jié)果判定 使用凝膠電泳成像和GeneSys軟件進(jìn)行圖像分析。MSP的結(jié)果如下：1)甲基化：甲基化特異性引物(M)擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，而非甲基化特異性引物(U)未擴(kuò)增；2)非甲基化：非甲基化引物(U)擴(kuò)增出靶條帶，而甲基化的引物(M)未擴(kuò)增；3)甲基化不完全：這兩對(duì)引物均具有靶條帶擴(kuò)增功能，并包含在非甲基化中以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。甲基化率是發(fā)生完全甲基化和不完全甲基化標(biāo)本數(shù)占總的標(biāo)本數(shù)的百分比。隨機(jī)選擇10%的樣品進(jìn)行重復(fù)測(cè)試，空白對(duì)照沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，則說明結(jié)果可靠[8]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 LOC100130476在腎癌及其相應(yīng)正常組織中的表達(dá)情況

腎癌組織中LOC100130476的表達(dá)明顯低于其相應(yīng)正常組織(0.593±0.306vs1.000±0.018,t=-11.143,P<0.001)(圖2)。結(jié)合表1的臨床病理資料分析，LOC100130476在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(0.736±0.367vs0.527±0.251，t=2.774,P=0.007)，并與臨床分期相關(guān)(F=5.436,P=0.002)；按照年齡、性別以及分化程度分組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，LOC100130476的表達(dá)差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 腎癌組織及其相應(yīng)正常組織中LOC100130476表達(dá)

表1 70例腎癌組織中LOC100130476表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.2 LOC100130476在腎癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況

HK-2作為正常細(xì)胞對(duì)照組，RT-qPCR分析結(jié)果顯示，LOC100130476在786-O、ACHN、A498腎癌細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)量分別為 0.338±0.029、0.144±0.016、0.133±0.018，均低于對(duì)照組1.102±0.149，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=107.068，P<0.001),其中786-O、ACHN、A498各自與正常細(xì)胞HK-2相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.737，P=0.001；t=11.090，P<0.001；t=11.215，P<0.001;圖3)。

圖3 LOC100130476在腎癌細(xì)胞系中的表達(dá)

2.3 經(jīng)5-Aza-dC處理前后LOC100130476在腎癌細(xì)胞系的表達(dá)情況

使用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(圖4)，LOC100130476在786-O未處理組的表達(dá)量為1.105±0.096，5-Aza-dC處理組為3.943±0.321，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-12.531，P=0.006)；LOC100130476在ACHN未處理組的表達(dá)量為0.473±0.053，5-Aza-dC處理組為2.110±0.273，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-11.990，P=0.007)；LOC100130476在A498未處理組的表達(dá)量為0.434±0.058，5-Aza-dC處理組為4.398±0.386，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-18.603，P=0.003)。

圖4 5-Aza-dC處理前后腎癌細(xì)胞系中LOC100130476的表達(dá)

2.4 LOC100130476在腎癌及其相應(yīng)正常組織中的甲基化狀態(tài)

MSP結(jié)果顯示，LOC100130476在腎癌和相應(yīng)正常組織中的甲基化率分別為[78.57%(55/70)vs30.00%(21/70)，χ2=33.273，P<0.01]。結(jié)合臨床病理特征發(fā)現(xiàn)(表1)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者[85.42%(41/48)vs63.64%(14/22)，χ2=4.250，P=0.039]；按照年齡、性別、分化程度、臨床分期進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，腎癌組織LOC100130476甲基化率差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖5顯示為部分病例腎癌組織的甲基化狀態(tài)，case1有未甲基化表達(dá)，可能是組織差異造成的。

圖5 腎癌組織中LOC100130476的甲基化狀態(tài)

2.5 LOC100130476在腎癌細(xì)胞系中的甲基化狀態(tài)

MSP結(jié)果(圖6)顯示，5-Aza-dC處理前A498、ACHN、786-O細(xì)胞系中LOC100130476呈高甲基化狀態(tài)；5-Aza-dC處理的3株細(xì)胞系使用甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增后，LOC100130476在A498和786-O細(xì)胞系中甲基化程度均消失，在ACHN細(xì)胞中甲基化程度降低；使用非甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增，A498、ACHN、786-O的LOC100130476非甲基化程度均顯著增高。

圖6 腎癌細(xì)胞系中LOC100130476的甲基化狀態(tài)

3 討 論

RCC為常見的惡性腫瘤，探索RCC發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制，尋找有效的腫瘤轉(zhuǎn)移和耐藥靶點(diǎn)，具有深遠(yuǎn)的意義。LncRNA曾被視為RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的“噪音”，沒有任何生物學(xué)功能[9]。但最近研究證實(shí)lncRNA在生物調(diào)控過程中扮演重要的作用，如染色質(zhì)修飾、X染色體沉默、轉(zhuǎn)錄激活、基因組印跡、轉(zhuǎn)錄干擾和核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)[10]。同時(shí)lncRNA可成為腫瘤診斷和治療的有效指標(biāo)。Li等[11]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA PLK1S1在RCC組織和細(xì)胞中上調(diào)，并與患者臨床分期相關(guān)，PLK1S1高表達(dá)患者的總生存時(shí)間更短。生信及熒光素酶報(bào)告基因表明，PLK1S1可通過miR653/CXCR5軸促進(jìn)RCC進(jìn)展和索拉非尼耐藥。Yang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA FGD5-AS1在腎癌組織中高表達(dá)，并與miR-5590-3p競(jìng)爭(zhēng)性相互作用并調(diào)節(jié)ERK/AKT的下游信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)RCC的增殖和轉(zhuǎn)移。Wang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在舒尼替尼耐藥的RCC組織和細(xì)胞系中，MALAT1表達(dá)顯著上調(diào)。LncRNA MALAT1通過miR-362-3p/G3BP1來促進(jìn)SU化學(xué)耐藥性。

LOC100130476位于6q23.3，與食管鱗癌、胃賁門腺癌侵襲轉(zhuǎn)移以及預(yù)后緊密相關(guān)[14-15]。本研究檢測(cè)LOC100130476在RCC組織、正常組織及細(xì)胞系中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，癌組織中LOC100130476的表達(dá)水平明顯低于正常組織，在腎癌細(xì)胞系(A498、ACHN、786-O)及人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞(HK-2)中，LOC100130476在3種RCC細(xì)胞的表達(dá)均低于對(duì)照組。進(jìn)一步分析LOC100130476的表達(dá)水平與臨床病理數(shù)據(jù)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，LOC100130476的表達(dá)水平與RCC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)。提示LOC100130476可能在RCC中起抑癌基因的作用。

RCC是多基因和多階段突變積累的病理過程。腫瘤細(xì)胞基因組DNA中常伴有廣泛低甲基化和局部異常高甲基化[16]。DNA甲基化在真核細(xì)胞中多發(fā)生于CpG位點(diǎn)，在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶作用下，使CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?’-甲基胞嘧啶[17]，常見的具有甲基化活性的DNMTs主要為DNMT1、DNMT3A、DNMT3B[18]?；騿?dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)常呈聚集狀態(tài)，稱為CpG島，在人類正?；蚪M中呈低甲基化狀態(tài)，可調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄活性，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[19]。近年來，隨著對(duì)基因組研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)修飾可作為“開關(guān)”調(diào)控lncRNAs在腫瘤中作用[20]。抑癌基因啟動(dòng)子中CpG島的異常甲基化導(dǎo)致基因表達(dá)下降并誘導(dǎo)腫瘤形成[21]。通過UCSC序列檢索并結(jié)合 CpG島預(yù)測(cè)軟件Meth primer分析發(fā)現(xiàn)，LOC100130476有三個(gè)CpG島，長(zhǎng)度分別為224 bp、768 bp、151 bp，在食管癌和賁門腺癌中LOC100130476甲基化主要表現(xiàn)在第一個(gè)CpG島，本研究推測(cè)啟動(dòng)子區(qū)CpG島的高甲基化可能是LOC100130476表達(dá)異常的機(jī)制之一。因此,本課題組從RCC的甲基化狀態(tài)和LOC100130476的表達(dá)入手，初步探討了LOC1001 30476甲基化在RCC發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的干預(yù)藥物5-Aza-dC是一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，抑制DNA甲基化，通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、凋亡、DNA損傷等來發(fā)揮其抗腫瘤活性，應(yīng)用于多種惡性腫瘤的治療。我們檢測(cè)了LOC100130476在RCC細(xì)胞系(A498、ACHN、786-O)中5-Aza-dC處理前后表達(dá)水平的改變，初步探究其表觀遺傳學(xué)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LOC100130476在RCC細(xì)胞系(A498、ACHN、786-O)中5-Aza-dC單獨(dú)處理后表達(dá)均上調(diào)，這一結(jié)果提示LOC100130476在RCC中的低表達(dá)可能受到DNA甲基化的調(diào)控，并且這一修飾過程可被5-Aza-dC不同程度逆轉(zhuǎn)。我們進(jìn)一步應(yīng)用MSP的方法在70例RCC和相應(yīng)癌旁正常組織中檢測(cè)LOC100130476啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示LOC100130476啟動(dòng)子區(qū)在RCC組織中呈高甲基化狀態(tài)，顯著高于其相應(yīng)癌旁正常組織，且該位點(diǎn)甲基化率與RCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示LOC100130476啟動(dòng)子區(qū)DNA異常高甲基化可能是RCC中LOC100130476表達(dá)下調(diào)的主要機(jī)制之一，該區(qū)域CpG位點(diǎn)，對(duì)基因的表達(dá)起關(guān)鍵調(diào)控作用。我們進(jìn)一步深入研究，應(yīng)用MSP的方法檢測(cè)LOC100130476在RCC細(xì)胞系(A498、ACHN、786-O)中的甲基化狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在5-Aza-dC處理前，3株細(xì)胞系中LOC100130476啟動(dòng)子區(qū)表現(xiàn)為高甲基化狀態(tài)，而在5-Aza-dC處理后，LOC100130476啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度均有不同程度降低或表現(xiàn)為非甲基化狀態(tài)，這一結(jié)果證實(shí)，LOC100130476啟動(dòng)子區(qū)呈高甲基化狀態(tài)，并且其高甲基化狀態(tài)可抑制基因表達(dá)。在本實(shí)驗(yàn)中部分RCC細(xì)胞系的高甲基化狀態(tài)沒有被5-Aza-dC干預(yù)完全逆轉(zhuǎn)，分析可能的原因有：1)同一基因CpG島區(qū)域在不同細(xì)胞系中DNA甲基化程度不同；2)5-Aza-dC藥物劑量較低或處理時(shí)間不足導(dǎo)致甲基化狀態(tài)未完全逆轉(zhuǎn)；3)可能存在如組蛋白乙?；绕渌麢C(jī)制而導(dǎo)致該基因沉默表達(dá)。研究結(jié)果顯示經(jīng)5-Aza-dC干預(yù)后的細(xì)胞中LOC100130476的表達(dá)均顯著升高，5-Aza-dC能逆轉(zhuǎn)LOC100130476啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化狀態(tài)，使LOC100130476重新表達(dá)，并起到抑癌基因的作用。經(jīng)5-Aza-dC處理后，LOC100130476的甲基化程度明顯降低，非甲基化引物的表達(dá)明顯升高。表明LOC100130476啟動(dòng)子區(qū)甲基化與其基因表達(dá)相關(guān)，進(jìn)一步驗(yàn)證了LOC100130476異常甲基化是導(dǎo)致該基因失活的機(jī)制之一。因此，應(yīng)不斷研究DNA甲基化與基因表達(dá)之間的相關(guān)性，為RCC的早期診斷和脫甲基治療提供依據(jù)。

綜上所述，LOC100130476在腎癌中低表達(dá)，其啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化是導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的機(jī)制之一，5-Aza-dC可以逆轉(zhuǎn)LOC100130476啟動(dòng)子區(qū)域的異常甲基化并提高其表達(dá)水平?？傊?，希望本研究為L(zhǎng)OC100130476啟動(dòng)子區(qū)甲基化和異常表達(dá)的研究提供新的思路和理論依據(jù)。

作者聲明：本文全部作者對(duì)于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任；并承諾論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)資料等已按照有關(guān)規(guī)定保存，可接受核查。

學(xué)術(shù)不端：本文在初審、返修及出版前均通過中國知網(wǎng)(CNKI)科技期刊學(xué)術(shù)不端文獻(xiàn)檢測(cè)系統(tǒng)的學(xué)術(shù)不端檢測(cè)。

同行評(píng)議：經(jīng)同行專家雙盲外審，達(dá)到刊發(fā)要求。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

文章版權(quán)：本文出版前已與全體作者簽署了論文授權(quán)書等協(xié)議。