崔承遠(yuǎn)

北大荒完達(dá)山乳業(yè)股份有限公司，黑龍江哈爾濱 150078

0 引言

丁酸是一種短鏈飽和脂肪酸，其最大功能是供應(yīng)能量，而聚集在脂細(xì)胞內(nèi)形成脂肪的很少，具有參與基因調(diào)控調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，抑制腫瘤生長，促進(jìn)細(xì)胞分化和凋亡的作用。己酸（俗稱羊油酸）、辛酸（俗稱羊脂酸）、癸酸（俗稱羊蠟酸）三種飽和脂肪酸具有相似的生物活性。辛酸和癸酸都具有抗病毒的生物活性。癸酸與甘油三酯生成的癸酸單酰甘油酯具有抗艾滋病毒的功能[1～3]。

奶粉中天然含有丁酸、己酸、辛酸和癸酸，雖然不屬于嬰幼兒配方奶粉中常規(guī)考核及檢測項目，但其對于嬰幼兒成長同樣起到了一定的積極作用，因此，對丁酸、己酸、辛酸和癸酸的檢測以及針對檢測方法進(jìn)行方法驗證[4～7]具有必要性。

1 試劑與方法

1.1 試劑

乙酰氯（C2H3ClO）：色譜純；甲醇（CH3OH）：色譜純；甲苯（C7H8）：色譜純；無水碳酸鈉（Na2CO3）：分析純。

1.2 溶液配制

1.2.1 乙酰氯-甲醇溶液（10.00%）

向100.0 mL容量瓶內(nèi)加入約40.0 mL甲醇，并將盛裝有甲醇的容量瓶置于冷水中，再吸取乙酰氯10.0 mL，并逐滴緩慢加入到容量瓶內(nèi)，待溶液恢復(fù)至室溫后取出容量瓶，以甲醇定容至刻度線，混勻，此為濃度10.00%的乙酰氯-甲醇溶液。

1.2.2 碳酸鈉溶液（60 g/L）

稱取無水碳酸鈉60 g于1 000.0 mL容量瓶內(nèi)，加入約600.0 mL超純水，超聲震蕩至無水碳酸鈉完全溶解，再以超純水定容至刻度線，混勻，此為濃度60 g/L的碳酸鈉溶液。

1.3 儀器設(shè)備及參數(shù)

1.3.1 儀器設(shè)備

氣相色譜儀（配置有FID氫火焰離子檢測器）；分析天平：感量0.1 mg；離心機：轉(zhuǎn)速≥5 000 r/min；38.0 mL帶有聚四氟乙烯內(nèi)墊的螺紋帽試管；恒溫磁力攪拌器；渦旋振蕩器。

1.3.2 儀器參數(shù)

毛細(xì)管色譜柱：DB-23型，柱長30 m，內(nèi)徑0.25 mm，膜厚0.25 μm；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；檢測器溫度：260 ℃；載氣：高純氮氣，純度99.999%，流速1.0 mL/min；分流比：20∶1；輔助氣體：氫氣45.0 mL/min，空氣450.0 mL/min；進(jìn)樣體積：1 μL/min；

1.3.3 程序升溫

丁酸、己酸、辛酸和癸酸程序升溫見表1。

表1 丁酸、己酸、辛酸和癸酸程序升溫

1.4 分析步驟

1.4.1 試樣處理

稱取嬰幼兒配方奶粉試樣0.5 g（精確至0.001 g）于38.0 mL螺口玻璃管中，加入5.0 mL甲苯和6.0 mL 10.00%的乙酰氯-甲醇溶液，充氮氣后，旋緊螺紋蓋。振蕩混合后于（80±1）℃水浴中放置2 h，期間每隔20 min取出振搖1 次，水浴后取出冷卻至室溫。

將甲酯化衍生反應(yīng)后的樣液轉(zhuǎn)移至50.0 mL離心管內(nèi)，分別用3.0 mL碳酸鈉溶液清洗玻璃管3 次。將螺紋管內(nèi)溶液全部轉(zhuǎn)移至50.0 mL離心管中，混勻。以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min。取出上清液作為脂肪酸測試樣液，氣相色譜儀分析測定。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液測試

（1）丁酸甘油三酯、己酸甘油三酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備液

分別稱取丁酸甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、己酸甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、辛酸甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和癸酸甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各100 mg于同1 支100.0 mL容量瓶中，以甲苯定容至刻度線，此為丁酸甘油三酯、己酸甘油三酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中間液。

（2）丁酸甘油三酯、己酸甘油三酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液

吸取上述四種組分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備液5.0 mL于38.0 mL螺口玻璃管內(nèi)，加入6.0 mL 10.00%的乙酰氯-甲醇溶液，后續(xù)操作按照1.4.1中的操作步驟進(jìn)行。甲酯化衍生結(jié)束后，從上清液中吸取4.0 mL于10.0 mL容量瓶內(nèi)，以甲苯定容至刻度線，即為丁酸甘油三酯、己酸甘油三酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液。

1.4.3 試樣溶液的測定

相同條件下，將樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液分別引入氣相色譜儀進(jìn)行測定。試樣中各脂肪酸含量按公式（1）進(jìn)行計算。

式中：Xi為試樣中各脂肪酸的含量，單位為克每百克（g/100 g）；Ai為試樣測定液中各脂肪酸甲酯的峰面積；msi為在標(biāo)準(zhǔn)測定液的制備中吸取的脂肪酸甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)工作液中所含有的標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量，單位為毫克（mg）；FTG-FAi為各脂肪酸甘油三酯轉(zhuǎn)化為脂肪酸的換算系數(shù)；ASi為標(biāo)準(zhǔn)測定液中各脂肪酸的峰面積；m為試樣的稱樣質(zhì)量，單位為毫克（mg）；100為將含量轉(zhuǎn)換為每100 g試樣中含量的系數(shù)。計算結(jié)果保留3 位有效數(shù)字。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液測定

分別稱取丁酸甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)105.90 mg、己酸甘油三酯83.80 mg、辛酸甘油三酯82.11 mg、癸酸甘油三酯82.10 mg于同一只100.0 mL容量瓶內(nèi)，以甲苯定容至刻度線，此為丁酸甘油三酯、己酸甘油三酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備液。

吸取上述四種組分混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備液5.0 mL于38.0 mL螺口玻璃管內(nèi)，加入6.0 mL 10.00%的乙酰氯-甲醇溶液，后續(xù)操作按照1.4.1中的操作步驟進(jìn)行。甲酯化衍生結(jié)束后，從上清液中吸取4.0 mL于10.0 mL容量瓶內(nèi)，以甲苯定容至刻度線，即為丁酸甘油三酯、己酸甘油三酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液。

丁酸甘油三酯、己酸甘油三酯、辛酸甘油三酯和癸酸甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備液、工作液濃度詳見表2。

表2 丁酸、己酸、辛酸和癸酸混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備液、工作液濃度

將丁酸、己酸、辛酸和癸酸混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液連續(xù)運行6 次，得到6 次運行圖譜及各組分響應(yīng)值（峰面積），并分別計算每個組分響應(yīng)值（峰面積）的標(biāo)準(zhǔn)偏差，如表3所示。

表3 丁酸、己酸、辛酸和癸酸混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液各組分響應(yīng)值（峰面積）及RSD

2.2 方法檢出限與定量限

采用空白標(biāo)準(zhǔn)偏差法，選擇嬰幼兒配方奶粉樣品作為試驗對象，稱取40 份，每份0.5 g，按照1.4.1中的操作步驟對試樣進(jìn)行前處理。對處理結(jié)束后的試樣樣液分別進(jìn)行50.0 倍稀釋、50.0 倍稀釋、100.0倍稀釋和50.0 倍稀釋。其中50.0 倍稀釋樣液用于丁酸方法檢出限的測定、50.0 倍稀釋樣液用于己酸方法檢出限的測定、100 倍稀釋樣液用于辛酸方法檢出限的測定、50.0 倍稀釋樣液用于癸酸方法檢出限的測定。

將上述樣液分別通過氣相色譜儀進(jìn)行檢測分析，得出4 種組分的樣品圖片及相關(guān)參數(shù)，進(jìn)而計算出4 種組分的方法檢出限及定量限，如表4～7所示。

2.3 精密度

選擇嬰幼兒配方奶粉樣品作為試驗對象，進(jìn)行10組平行試驗[8]，按照上述1.4.1中的描述進(jìn)行試樣前處理和測定，得出10 組試驗結(jié)果，如表8～11所示。

表8 辛酸正確度試驗加標(biāo)體積、加標(biāo)質(zhì)量及甲苯補充體積

2.4 正確度

結(jié)合上述精密度試驗中所得到的嬰幼兒配方奶粉試樣中4 種組分的含量數(shù)值，并以此作為本底，分別進(jìn)行4 種組分的加標(biāo)回收率試驗（即正確度試驗）[9]。加標(biāo)原則分為低、中、高3 個濃度水平，其中低濃度水平為以本底數(shù)值的0.8 倍進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)添加、中濃度水平為以本底數(shù)值的1.0 倍進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)添加、高濃度水平為以本底數(shù)值的1.2 倍進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)添加，每個濃度水平分別進(jìn)行6 組平行試驗。各組加標(biāo)回收率試驗標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液添加體積及甲苯補充體積詳見表6～27。

表6 丁酸正確度試驗加標(biāo)體積、加標(biāo)質(zhì)量及甲苯補充體積

丁酸、己酸、辛酸、癸酸低濃度加標(biāo)回收率（正確度）實驗結(jié)果如表10所示。

表10 丁酸、己酸、辛酸、癸酸低濃度加標(biāo)回收率（正確度）結(jié)果

丁酸、己酸、辛酸、癸酸中濃度加標(biāo)回收率（正確度）實驗結(jié)果如表11所示。

表11 丁酸、己酸、辛酸、癸酸中濃度加標(biāo)回收率（正確度）結(jié)果

丁酸、己酸、辛酸、癸酸高濃度加標(biāo)回收率（正確度）實驗結(jié)果如表12所示。

表 4 丁酸、己酸、辛酸、癸酸方法檢出限與定量限結(jié)果 單位：mg/100 g

表5 丁酸、己酸、辛酸、癸酸精密度試驗結(jié)果

表7 己酸正確度試驗加標(biāo)體積、加標(biāo)質(zhì)量及甲苯補充體積

表12 丁酸、己酸、辛酸、癸酸高濃度加標(biāo)回收率（正確度）結(jié)果

3 結(jié)論

經(jīng)方法檢出限、精密度和正確度方法特性參數(shù)的驗證，得出丁酸方法檢出限為0.608 mg/100 g，方法定量限為1.820 mg/100 g；己酸方法檢出限為0.276 mg/100 g，方法定量限為0.827 mg/100 g；辛酸方法檢出限為0.323 mg/100 g，方法定量限為0.969 mg/100 g；癸酸方法檢出限為0.801 mg/100 g，方法定量限為2.400 mg/100 g。對比《GB 5009.168—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪酸的測定》中各組分定量限數(shù)值，丁酸3.300 mg/100 g、己酸3.300 mg/100 g、辛酸3.300 mg/100 g、癸酸3.300 mg/100 g。本次試驗4 種組分方法定量限數(shù)值均低于標(biāo)準(zhǔn)中所給數(shù)值，符合要求。丁酸方法精密度為1.95%，己酸方法精密度為1.87%，辛酸方法精密度為1.67%，癸酸方法精密度為1.58%，均滿足《GB 5009.168—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪酸的測定》中對于精密度不大于10.00%的要求；丁酸3水平6平行共計18 組正確度試驗加標(biāo)回收率在95.70%～105.00%范圍內(nèi)，己酸3水平6平行共計18 組正確度試驗加標(biāo)回收率在95.90%～104.00%范圍內(nèi)，辛酸3水平6平行共計18 組正確度試驗加標(biāo)回收率在95.50%～104.00%范圍內(nèi)，癸酸3水平6平行共計18 組正確度試驗加標(biāo)回收率在95.10%～104.00%范圍內(nèi)，均滿足《GB/T 27417—2017 合格評定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗證指南附錄A》的要求[10]。

表9 癸酸正確度試驗加標(biāo)體積、加標(biāo)質(zhì)量及甲苯補充體積