朱 平，田玉蘭，陳雅婷，陳 煒，杜立萍，吳春生

(西安交通大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院 生物物理學系 醫(yī)學工程研究所，陜西 西安 710061)

自然界和日常生活中包含難以計數(shù)的氣味，這些氣味富含多種有用的信息。例如，食品的氣味可以反映其質(zhì)量，可應(yīng)用于食品安全檢測；不同生長階段或儲存狀態(tài)的農(nóng)作物、植物或水果具有不同的氣味，這有助于實現(xiàn)對農(nóng)業(yè)生長過程的監(jiān)控；在某些特殊的工業(yè)制造過程中，氣味是即將到來危險的一種預警。另外，通過分析人的呼出氣體或傷口的氣味，可以在早期為一些疾病提供有用的診斷信息，這增加了疾病治愈的可能性。因此，氣味檢測及其響應(yīng)機理的研究具有重要意義，在這些研究中，需要對氣味進行高靈敏、準確、快速和客觀的測量。目前氣體檢測已在食品安全、緝毒防爆、疾病診斷、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用[1-4]。氣體檢測的手段主要包括光學傳感系統(tǒng)[5]、質(zhì)譜分析[6]、氣相色譜分析[7]、離子淌度譜分析[8]等，上述幾類儀器檢測靈敏度高、結(jié)果準確，但同時存在操作復雜、分析時間長、儀器昂貴和尺寸大等局限性。

生物嗅覺的機理研究極大地推動了相關(guān)領(lǐng)域的快速發(fā)展，模仿天然嗅覺系統(tǒng)的生物電子鼻研究已經(jīng)進行了幾十年[9-10]。其基本原理是利用生物嗅覺受體或表達嗅覺受體的細胞作為識別元件，并與傳感器件相結(jié)合，通過檢測氣味分子與受體之間的相互作用信號，實現(xiàn)對氣味分子特異性檢測。在有機化合物與氣味配體的特異性識別方面，將生物嗅覺元件作為生物電子鼻的敏感材料，如嗅覺受體(Olfactory Receptors,ORs)[11]、嗅感覺神經(jīng)元(Olfactory Sensory Neurons,OSNs)[12]和氣味結(jié)合蛋白(Odorant-Binding Proteins,OBPs)[13]，實現(xiàn)了對有機化合物和氣味配體的特異性識別。這些生物敏感材料與微電極陣列(MicroelEctrode Array,MEA)、石英晶體微天平(Quartz Crystal Microbalance,QCM)、表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)、光尋址電位傳感器(Light-Addressable Potentiometric Sensor,LAPS)、場效應(yīng)晶體管(Field-Effect Transistor,FET)等二級換能器相結(jié)合，可以開發(fā)不同類型的氣味分子檢測傳感器[14-20]。與傳統(tǒng)電子鼻相比，生物電子鼻在檢測揮發(fā)性有機化合物(Volatile Organic Compounds,VOCs)方面具有獨特的優(yōu)點，比如常溫工作、高靈敏度和高選擇性等。在各種生物電子鼻中，采用整個生物體作為敏感元件比采用其他生物材料作為敏感元件具有更穩(wěn)定的性能和更完整的信息處理系統(tǒng)，這使得它們在開發(fā)可靠和便攜的檢測設(shè)備方面具有很大的優(yōu)勢和潛力。

生物嗅覺系統(tǒng)主要由主嗅覺上皮(Main Olfactory Epithelium,MOE)、嗅球(Olfactory Bulb,OB)和嗅皮層(Olfactory Cortex,OC)組成。1991年，Richard Axel和Linda Buck首次發(fā)現(xiàn)哺乳動物ORs基因超家族，揭示了OR基因在嗅覺信號處理中的重要作用。哺乳動物基因組含有約250～1200個功能性O(shè)R基因，主要分布于MOE的OSN。每個OSN僅表示一種類型的OR。一個OR可以識別多個氣味配體，并且一個氣味可以被多個OR識別。氣味的標識是由OR的組合編碼的，這一組合受體編碼方案是具有有限數(shù)量ORs的生物嗅覺系統(tǒng)能夠區(qū)分大量氣味的原因之一。一旦氣味與OR特異性結(jié)合，OSN會產(chǎn)生響應(yīng)信號，并通過軸突的投射將信息傳遞到OB的絲球小體。氣味信息被整合并編碼在OB中，然后傳輸?shù)酱竽X的OC進行進一步處理。

天然生物嗅覺系統(tǒng)具有相當廣泛的氣味響應(yīng)譜。在筆者團隊前期的研究中，通過將異源ORs轉(zhuǎn)染到OSNs中并檢測OSNs的響應(yīng)，可以獲得特異性的反應(yīng)，證實通過調(diào)節(jié)ORs的表達可以調(diào)節(jié)對氣味的特異性響應(yīng)?？紤]到氣味信息可以主要在MOE中編碼，并在OB中進一步處理，由此推測表達特定ORs的生物工程化MOE有可能提高嗅覺系統(tǒng)對氣味配體的特異性響應(yīng)。因此，在本研究中，提出通過對大鼠嗅覺系統(tǒng)進行生物工程化改造，并檢測來自O(shè)B的編碼信號來開發(fā)在體生物電子鼻。本研究在構(gòu)建該生物工程仿生電子鼻的過程中，綜合考慮了其特異性、靈敏度、穩(wěn)定性、便攜性、工作條件以及操作時間等多方面的特性，旨在提供一種新型氣味檢測途徑，為其在不同領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供可能。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西安交通大學實驗動物中心提供Sprague-Dawley大鼠；由OBiO技術(shù)公司(上海)使用腺病毒相關(guān)病毒(AAV)對大鼠進行基因工程改造，包括pAAV-CMV-EGFP-2A-Olfr15-3FLAG載體和 pAAV-CMV-EGFP-2A-MCS-3FLAG.Urethane；牙科用水泥(Luxatemp，Dental Milestones Guaranteed)；腦立體定位儀(RWD Life Science)；自制16通道微絲陣列用于電生理記錄；鎳鉻微絲電極(AM系統(tǒng)，WA；#761500)的直徑為38 μm，每條微絲之間的間隔距離約為200 μm；氣味包括壬酸、辛酸和庚酸；抗β微管蛋白抗體和抗FLAG標簽多克隆抗體；所有與Western Blotting有關(guān)的試劑均購自Beyotime(中國)。

1.2 腺病毒載體的制備與遞送

OR3(Olfr15)基因包裝成9型AAV載體，制成pAAV-CMV-EGFP-2A-olfr15-3FLAG載體，借助2A自切多肽實現(xiàn)了靶蛋白(OR3)過表達，并用FLAG-Tag進一步驗證了過表達。用滴鼻的方式遞送病毒載體。大鼠在用氨基甲酸乙酯(25%,5 mL/kg)麻醉后，兩個月大時鼻內(nèi)注射AAV-EGFP-Olfr15載體。將載體在PBS中稀釋至適當濃度，然后通過用微量移液器將10滴2.5 μL滴劑滴加到每只大鼠的鼻腔中，在左右鼻孔之間交替，每只鼻孔之間間隔1 min，用微量移液器給藥25 μL。

用Western Blotting方法檢測過表達目標蛋白OR3。首先，進行標準的SDS-AGE，并將所得的凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF支鏈中。封閉后，將β微管蛋白抗體用于內(nèi)部對照，并先用FLAG標簽兔多克隆抗體印跡膜，再用HRP偶聯(lián)的山羊抗兔IgG印跡。使用HRP的EZ-ECL化學發(fā)光檢測試劑盒可以觀察到OR3的表達。

1.3 微電極植入

將微絲電極陣列植入大鼠嗅球內(nèi)。開顱手術(shù)暴露OB及相關(guān)腦區(qū)利用立體定位儀實現(xiàn)嗅球的精準定位。在遞送AAV后的第二周，將微絲電極陣列植入大鼠的嗅球中。用氨基甲酸乙酯(25%，5 mL/kg)麻醉后，將大鼠固定在腦立體定位儀上。進行了開顱手術(shù)以暴露OB和相關(guān)的大腦區(qū)域。將電極植入大鼠的OB(坐標前位(AP)：+ 8.2 mm，內(nèi)側(cè)-外側(cè)(ML)：-1.0 mm，背側(cè)-背側(cè)(DV)：+ 0.8 mm)，植入深度為600～800 μm，最后用牙科水泥長期固定在大鼠的頭部(西安交通大學醫(yī)學倫理委員會批準使用動物)。

1.4 氣味刺激和信號記錄

在載體注射3周后進行信號記錄。在氣味刺激之前，微電極陣列以25 kHz的采樣率連接到多通道系統(tǒng)的前臺。在麻醉狀態(tài)下進行嗅覺刺激，測試大鼠的嗅覺反應(yīng)。將一定濃度的氣味物質(zhì)注入大鼠鼻內(nèi)5 s。

1.5 數(shù)據(jù)分析

記錄的電生理數(shù)據(jù)在Matlab中進行離線分析。利用三階巴特沃斯帶通濾波器對原始信號進行濾波，提取峰值電位(尖峰，300～5000 Hz)信號。設(shè)置尖峰閾值從峰值電位信號中檢測尖峰，并計算平均放電率。檢測波形進行神經(jīng)元分類。通過信號的互相關(guān)和自相關(guān)來分析兩個時間序列之間的相關(guān)程度和同一時間序列在任意兩個不同時刻的值。采用主成分分析(Principle Component Analysis,PCA)方法，以最小的信息損失從多通道信號中提取氣味響應(yīng)模式，實現(xiàn)數(shù)據(jù)的降維。在進行PCA時，將每個通道的特征變量設(shè)置為氣味分子刺激之前和之后每個通道的神經(jīng)元放電速率的差。假設(shè)有m個刺激，則每個刺激記錄n個特征值(n> 3)，形成一個m×n階數(shù)據(jù)矩陣。通過線性變換和正交化數(shù)據(jù)矩陣獲得3個方差最大的主成分，并將其用作3個特征值替換原始的n個特征量以實現(xiàn)數(shù)據(jù)的降維。

2 結(jié)果與討論

2.1 OR3在大鼠嗅黏膜的過表達

重組AAV載體(pAAV-CMV-EGFP-2A-Olfr15-3FLAG)在大鼠MOE中過表達目標嗅覺受體OR3，滴度分別為7.06×1012基因組/mL。本研究選擇AAV9血清型進行嗅覺神經(jīng)元轉(zhuǎn)導，鼻腔注射AAV9載體使靶基因在鼻上皮細胞成功表達。在AAV-EGFP-Olfr15給藥后3周，表達達到峰值。進行蛋白質(zhì)印跡分析以測試OR3的表達。從Western Blotting結(jié)果可以看出(圖2)，OR3在AAV接種3周后在大鼠嗅黏膜中有較高水平的表達，證明OR3成功過表達。

圖1 OR3蛋白表達的Western Blot結(jié)果

圖2 麻醉狀態(tài)下沒有氣味刺激的生物工程化大鼠的自發(fā)神經(jīng)元活動

2.2 嗅球信號的多通道采集

通過多通道微電極從OB的僧帽/從狀(Mitral/Tufted,M/T)細胞記錄電生理信號。M/T細胞層距OB表面的深度約為600～800 μm。在插入微電極陣列期間，同時監(jiān)測神經(jīng)元放電，并在觀察到重要信號時選擇位置，成功記錄高質(zhì)量信號是檢測和區(qū)分氣味的先決條件。在這項研究中，可以成功記錄高質(zhì)量的多通道信號。大約50%的通道的信噪比(Singnal-Noise Ratio,SNR)大于8，甚至高達13。圖2(a)顯示了來自生物工程大鼠的一個特征性自發(fā)放電信號，其SNR為9.5，神經(jīng)元在不同的激發(fā)狀態(tài)下自發(fā)活躍。為了進一步分析信號，執(zhí)行了尖峰排序，圖2(a)中顯示了通道的尖峰。應(yīng)用三階巴特沃斯帶通濾波器提取峰值電位(尖峰，300～5000 Hz)信號，然后從峰值電勢信號中檢測到尖峰。將基線噪聲級別設(shè)置為信號的標準偏差(Standard Deviation,SD)值，并將尖峰檢測閾值設(shè)置為3×SD。檢測到尖峰時，將生成一個時間戳以進一步計算尖峰脈沖的發(fā)放率。具有相同形狀的尖峰由相同的神經(jīng)元產(chǎn)生。有時，可以從一個單個通道中分出兩種類型的尖峰，如圖2(b)所示，從圖2(a)中分出了兩種尖峰波形，表明單個微電極可以記錄多個神經(jīng)元活動。

多通道記錄系統(tǒng)已廣泛用于神經(jīng)元放電記錄。通過繪制自相關(guān)曲線和互相關(guān)曲線來分析不同通道信號之間的相關(guān)性。此外，相關(guān)系數(shù)由Matlab系統(tǒng)的內(nèi)置“xcorr”函數(shù)計算得出，以專門分析通道之間的相關(guān)性。兩個相關(guān)性較低的渠道反映了渠道之間的相似性較低。圖2(c)示出了記錄的自發(fā)發(fā)射的通道之間的自相關(guān)系數(shù)和互相關(guān)系數(shù)。由于相關(guān)的交換性質(zhì)，相關(guān)矩陣關(guān)于其主對角線對稱。78.6%的互相關(guān)系數(shù)小于0.7，表明不同的通道同時記錄了豐富的信息，不同動物的情況并不完全相同，但所有信號均具有較高的SNR和相對獨立的信息。

2.3 在體生物電子鼻對目標氣味的特異性識別

在氣味分子作用下，神經(jīng)元的放電速率會發(fā)生不同程度的變化。計算平均放電率(Mean Firing Rates,MFR)以評估對不同氣味的響應(yīng)。MFR定義為每秒檢測到的尖峰數(shù)。如預期的那樣，記錄的神經(jīng)元在氣味濃度為10×10-3mol時，對辛酸和壬酸有顯著的響應(yīng)。相反，如圖3(a)所示的麻醉狀態(tài)下OR3大鼠對不同氣味刺激反應(yīng)的結(jié)果表明，神經(jīng)元對庚酸的反應(yīng)較低，這是由于庚酸不是OR3的配體，盡管庚酸與辛酸和壬酸的化學結(jié)構(gòu)類似。與非配體氣味劑(庚酸)相比，由OR3的配體氣味(辛酸和壬酸)引起的MFR變化顯著增高(圖3(b))。這進一步印證了之前的研究報道，即基因標記的鼠M72嗅覺感覺神經(jīng)元對目標氣味具有高敏感性反應(yīng)。當氣味濃度調(diào)整為10-4mol甚至10-5mol時，神經(jīng)元響應(yīng)變低(與氣味濃度為10×10-3mol相比，同一神經(jīng)元平均放電頻率分別下降1.6 Hz,3.0 Hz)。

圖3 麻醉狀態(tài)下OR3大鼠對不同氣味刺激反應(yīng)的高頻信號分析

結(jié)合生物工程的仿生電子鼻能夠特異性地識別目標配體氣味，但還需要一種更有效的方法來區(qū)分這些氣味分子。PCA可以將數(shù)據(jù)的維數(shù)減少到幾個主要成分[11]。在該研究中，利用PCA從多通道信號中提取了氣味響應(yīng)模式，并以最少的信息損失來區(qū)分氣味分子。選擇了前3個主要成分來代表所有響應(yīng)數(shù)據(jù)，占檢測總方差的90%以上，可以很好地代替原始特征量。將氣味刺激視為一個樣本集，將5個通道的響應(yīng)視為5維。一個通道的響應(yīng)是通過刺激后3 s內(nèi)的發(fā)射速率減去刺激前3 s內(nèi)的發(fā)射速率來評估的。樣品組在3個主要成分上的投影如圖3(d)所示。PCA的結(jié)果確定了兩個配體氣味(壬酸和辛酸)的清晰分離。盡管有微小的重疊，但可以成功區(qū)分不同化學類別的化合物，甚至是同一化學家族的相似化合物。這表明該體內(nèi)生物傳感系統(tǒng)具有很高的再現(xiàn)性和選擇性。

3 結(jié)束語

本文通過將大鼠的生物工程化嗅覺系統(tǒng)與可植入微電極相結(jié)合，開發(fā)了一種在體生物電子鼻用于特異性目標氣味的檢測。結(jié)果表明，該系統(tǒng)具有很高的特異性和穩(wěn)定性，是一種用于氣味檢測和識別的新技術(shù)。該生物電子鼻成功地記錄了多通道高質(zhì)量的大鼠嗅球M/T細胞信號，并且每個通道高度獨立，因此可以提供豐富的嗅覺信息。通過 PCA評估了針對不同氣味的獨特響應(yīng)模式。此外，通過Western Blotting的結(jié)果驗證了OR3在嗅覺黏膜上的過表達，通過不同的氣味測試探索了基因工程化大鼠對目標氣味的特異性，結(jié)果表明該生物電子鼻系統(tǒng)提供了一種新型的特異性目標氣味檢測方法，在相關(guān)領(lǐng)域具有廣泛的潛在應(yīng)用，例如環(huán)境監(jiān)測和爆炸物檢測等。