朱 平,田玉蘭,陳雅婷,陳 煒,杜立萍,吳春生
(西安交通大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物物理學(xué)系 醫(yī)學(xué)工程研究所,陜西 西安 710061)
自然界和日常生活中包含難以計(jì)數(shù)的氣味,這些氣味富含多種有用的信息。例如,食品的氣味可以反映其質(zhì)量,可應(yīng)用于食品安全檢測(cè);不同生長(zhǎng)階段或儲(chǔ)存狀態(tài)的農(nóng)作物、植物或水果具有不同的氣味,這有助于實(shí)現(xiàn)對(duì)農(nóng)業(yè)生長(zhǎng)過(guò)程的監(jiān)控;在某些特殊的工業(yè)制造過(guò)程中,氣味是即將到來(lái)危險(xiǎn)的一種預(yù)警。另外,通過(guò)分析人的呼出氣體或傷口的氣味,可以在早期為一些疾病提供有用的診斷信息,這增加了疾病治愈的可能性。因此,氣味檢測(cè)及其響應(yīng)機(jī)理的研究具有重要意義,在這些研究中,需要對(duì)氣味進(jìn)行高靈敏、準(zhǔn)確、快速和客觀的測(cè)量。目前氣體檢測(cè)已在食品安全、緝毒防爆、疾病診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用[1-4]。氣體檢測(cè)的手段主要包括光學(xué)傳感系統(tǒng)[5]、質(zhì)譜分析[6]、氣相色譜分析[7]、離子淌度譜分析[8]等,上述幾類儀器檢測(cè)靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確,但同時(shí)存在操作復(fù)雜、分析時(shí)間長(zhǎng)、儀器昂貴和尺寸大等局限性。
生物嗅覺(jué)的機(jī)理研究極大地推動(dòng)了相關(guān)領(lǐng)域的快速發(fā)展,模仿天然嗅覺(jué)系統(tǒng)的生物電子鼻研究已經(jīng)進(jìn)行了幾十年[9-10]。其基本原理是利用生物嗅覺(jué)受體或表達(dá)嗅覺(jué)受體的細(xì)胞作為識(shí)別元件,并與傳感器件相結(jié)合,通過(guò)檢測(cè)氣味分子與受體之間的相互作用信號(hào),實(shí)現(xiàn)對(duì)氣味分子特異性檢測(cè)。在有機(jī)化合物與氣味配體的特異性識(shí)別方面,將生物嗅覺(jué)元件作為生物電子鼻的敏感材料,如嗅覺(jué)受體(Olfactory Receptors,ORs)[11]、嗅感覺(jué)神經(jīng)元(Olfactory Sensory Neurons,OSNs)[12]和氣味結(jié)合蛋白(Odorant-Binding Proteins,OBPs)[13],實(shí)現(xiàn)了對(duì)有機(jī)化合物和氣味配體的特異性識(shí)別。這些生物敏感材料與微電極陣列(MicroelEctrode Array,MEA)、石英晶體微天平(Quartz Crystal Microbalance,QCM)、表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)、光尋址電位傳感器(Light-Addressable Potentiometric Sensor,LAPS)、場(chǎng)效應(yīng)晶體管(Field-Effect Transistor,FET)等二級(jí)換能器相結(jié)合,可以開(kāi)發(fā)不同類型的氣味分子檢測(cè)傳感器[14-20]。與傳統(tǒng)電子鼻相比,生物電子鼻在檢測(cè)揮發(fā)性有機(jī)化合物(Volatile Organic Compounds,VOCs)方面具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn),比如常溫工作、高靈敏度和高選擇性等。在各種生物電子鼻中,采用整個(gè)生物體作為敏感元件比采用其他生物材料作為敏感元件具有更穩(wěn)定的性能和更完整的信息處理系統(tǒng),這使得它們?cè)陂_(kāi)發(fā)可靠和便攜的檢測(cè)設(shè)備方面具有很大的優(yōu)勢(shì)和潛力。
生物嗅覺(jué)系統(tǒng)主要由主嗅覺(jué)上皮(Main Olfactory Epithelium,MOE)、嗅球(Olfactory Bulb,OB)和嗅皮層(Olfactory Cortex,OC)組成。1991年,Richard Axel和Linda Buck首次發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物ORs基因超家族,揭示了OR基因在嗅覺(jué)信號(hào)處理中的重要作用。哺乳動(dòng)物基因組含有約250~1200個(gè)功能性O(shè)R基因,主要分布于MOE的OSN。每個(gè)OSN僅表示一種類型的OR。一個(gè)OR可以識(shí)別多個(gè)氣味配體,并且一個(gè)氣味可以被多個(gè)OR識(shí)別。氣味的標(biāo)識(shí)是由OR的組合編碼的,這一組合受體編碼方案是具有有限數(shù)量ORs的生物嗅覺(jué)系統(tǒng)能夠區(qū)分大量氣味的原因之一。一旦氣味與OR特異性結(jié)合,OSN會(huì)產(chǎn)生響應(yīng)信號(hào),并通過(guò)軸突的投射將信息傳遞到OB的絲球小體。氣味信息被整合并編碼在OB中,然后傳輸?shù)酱竽X的OC進(jìn)行進(jìn)一步處理。
天然生物嗅覺(jué)系統(tǒng)具有相當(dāng)廣泛的氣味響應(yīng)譜。在筆者團(tuán)隊(duì)前期的研究中,通過(guò)將異源ORs轉(zhuǎn)染到OSNs中并檢測(cè)OSNs的響應(yīng),可以獲得特異性的反應(yīng),證實(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)ORs的表達(dá)可以調(diào)節(jié)對(duì)氣味的特異性響應(yīng)??紤]到氣味信息可以主要在MOE中編碼,并在OB中進(jìn)一步處理,由此推測(cè)表達(dá)特定ORs的生物工程化MOE有可能提高嗅覺(jué)系統(tǒng)對(duì)氣味配體的特異性響應(yīng)。因此,在本研究中,提出通過(guò)對(duì)大鼠嗅覺(jué)系統(tǒng)進(jìn)行生物工程化改造,并檢測(cè)來(lái)自O(shè)B的編碼信號(hào)來(lái)開(kāi)發(fā)在體生物電子鼻。本研究在構(gòu)建該生物工程仿生電子鼻的過(guò)程中,綜合考慮了其特異性、靈敏度、穩(wěn)定性、便攜性、工作條件以及操作時(shí)間等多方面的特性,旨在提供一種新型氣味檢測(cè)途徑,為其在不同領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供可能。
西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供Sprague-Dawley大鼠;由OBiO技術(shù)公司(上海)使用腺病毒相關(guān)病毒(AAV)對(duì)大鼠進(jìn)行基因工程改造,包括pAAV-CMV-EGFP-2A-Olfr15-3FLAG載體和 pAAV-CMV-EGFP-2A-MCS-3FLAG.Urethane;牙科用水泥(Luxatemp,Dental Milestones Guaranteed);腦立體定位儀(RWD Life Science);自制16通道微絲陣列用于電生理記錄;鎳鉻微絲電極(AM系統(tǒng),WA;#761500)的直徑為38 μm,每條微絲之間的間隔距離約為200 μm;氣味包括壬酸、辛酸和庚酸;抗β微管蛋白抗體和抗FLAG標(biāo)簽多克隆抗體;所有與Western Blotting有關(guān)的試劑均購(gòu)自Beyotime(中國(guó))。
OR3(Olfr15)基因包裝成9型AAV載體,制成pAAV-CMV-EGFP-2A-olfr15-3FLAG載體,借助2A自切多肽實(shí)現(xiàn)了靶蛋白(OR3)過(guò)表達(dá),并用FLAG-Tag進(jìn)一步驗(yàn)證了過(guò)表達(dá)。用滴鼻的方式遞送病毒載體。大鼠在用氨基甲酸乙酯(25%,5 mL/kg)麻醉后,兩個(gè)月大時(shí)鼻內(nèi)注射AAV-EGFP-Olfr15載體。將載體在PBS中稀釋至適當(dāng)濃度,然后通過(guò)用微量移液器將10滴2.5 μL滴劑滴加到每只大鼠的鼻腔中,在左右鼻孔之間交替,每只鼻孔之間間隔1 min,用微量移液器給藥25 μL。
用Western Blotting方法檢測(cè)過(guò)表達(dá)目標(biāo)蛋白OR3。首先,進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的SDS-AGE,并將所得的凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF支鏈中。封閉后,將β微管蛋白抗體用于內(nèi)部對(duì)照,并先用FLAG標(biāo)簽兔多克隆抗體印跡膜,再用HRP偶聯(lián)的山羊抗兔IgG印跡。使用HRP的EZ-ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒可以觀察到OR3的表達(dá)。
將微絲電極陣列植入大鼠嗅球內(nèi)。開(kāi)顱手術(shù)暴露OB及相關(guān)腦區(qū)利用立體定位儀實(shí)現(xiàn)嗅球的精準(zhǔn)定位。在遞送AAV后的第二周,將微絲電極陣列植入大鼠的嗅球中。用氨基甲酸乙酯(25%,5 mL/kg)麻醉后,將大鼠固定在腦立體定位儀上。進(jìn)行了開(kāi)顱手術(shù)以暴露OB和相關(guān)的大腦區(qū)域。將電極植入大鼠的OB(坐標(biāo)前位(AP):+ 8.2 mm,內(nèi)側(cè)-外側(cè)(ML):-1.0 mm,背側(cè)-背側(cè)(DV):+ 0.8 mm),植入深度為600~800 μm,最后用牙科水泥長(zhǎng)期固定在大鼠的頭部(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)使用動(dòng)物)。
在載體注射3周后進(jìn)行信號(hào)記錄。在氣味刺激之前,微電極陣列以25 kHz的采樣率連接到多通道系統(tǒng)的前臺(tái)。在麻醉狀態(tài)下進(jìn)行嗅覺(jué)刺激,測(cè)試大鼠的嗅覺(jué)反應(yīng)。將一定濃度的氣味物質(zhì)注入大鼠鼻內(nèi)5 s。
記錄的電生理數(shù)據(jù)在Matlab中進(jìn)行離線分析。利用三階巴特沃斯帶通濾波器對(duì)原始信號(hào)進(jìn)行濾波,提取峰值電位(尖峰,300~5000 Hz)信號(hào)。設(shè)置尖峰閾值從峰值電位信號(hào)中檢測(cè)尖峰,并計(jì)算平均放電率。檢測(cè)波形進(jìn)行神經(jīng)元分類。通過(guò)信號(hào)的互相關(guān)和自相關(guān)來(lái)分析兩個(gè)時(shí)間序列之間的相關(guān)程度和同一時(shí)間序列在任意兩個(gè)不同時(shí)刻的值。采用主成分分析(Principle Component Analysis,PCA)方法,以最小的信息損失從多通道信號(hào)中提取氣味響應(yīng)模式,實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的降維。在進(jìn)行PCA時(shí),將每個(gè)通道的特征變量設(shè)置為氣味分子刺激之前和之后每個(gè)通道的神經(jīng)元放電速率的差。假設(shè)有m個(gè)刺激,則每個(gè)刺激記錄n個(gè)特征值(n> 3),形成一個(gè)m×n階數(shù)據(jù)矩陣。通過(guò)線性變換和正交化數(shù)據(jù)矩陣獲得3個(gè)方差最大的主成分,并將其用作3個(gè)特征值替換原始的n個(gè)特征量以實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的降維。
重組AAV載體(pAAV-CMV-EGFP-2A-Olfr15-3FLAG)在大鼠MOE中過(guò)表達(dá)目標(biāo)嗅覺(jué)受體OR3,滴度分別為7.06×1012基因組/mL。本研究選擇AAV9血清型進(jìn)行嗅覺(jué)神經(jīng)元轉(zhuǎn)導(dǎo),鼻腔注射AAV9載體使靶基因在鼻上皮細(xì)胞成功表達(dá)。在AAV-EGFP-Olfr15給藥后3周,表達(dá)達(dá)到峰值。進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析以測(cè)試OR3的表達(dá)。從Western Blotting結(jié)果可以看出(圖2),OR3在AAV接種3周后在大鼠嗅黏膜中有較高水平的表達(dá),證明OR3成功過(guò)表達(dá)。
圖1 OR3蛋白表達(dá)的Western Blot結(jié)果
圖2 麻醉狀態(tài)下沒(méi)有氣味刺激的生物工程化大鼠的自發(fā)神經(jīng)元活動(dòng)
通過(guò)多通道微電極從OB的僧帽/從狀(Mitral/Tufted,M/T)細(xì)胞記錄電生理信號(hào)。M/T細(xì)胞層距OB表面的深度約為600~800 μm。在插入微電極陣列期間,同時(shí)監(jiān)測(cè)神經(jīng)元放電,并在觀察到重要信號(hào)時(shí)選擇位置,成功記錄高質(zhì)量信號(hào)是檢測(cè)和區(qū)分氣味的先決條件。在這項(xiàng)研究中,可以成功記錄高質(zhì)量的多通道信號(hào)。大約50%的通道的信噪比(Singnal-Noise Ratio,SNR)大于8,甚至高達(dá)13。圖2(a)顯示了來(lái)自生物工程大鼠的一個(gè)特征性自發(fā)放電信號(hào),其SNR為9.5,神經(jīng)元在不同的激發(fā)狀態(tài)下自發(fā)活躍。為了進(jìn)一步分析信號(hào),執(zhí)行了尖峰排序,圖2(a)中顯示了通道的尖峰。應(yīng)用三階巴特沃斯帶通濾波器提取峰值電位(尖峰,300~5000 Hz)信號(hào),然后從峰值電勢(shì)信號(hào)中檢測(cè)到尖峰。將基線噪聲級(jí)別設(shè)置為信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差(Standard Deviation,SD)值,并將尖峰檢測(cè)閾值設(shè)置為3×SD。檢測(cè)到尖峰時(shí),將生成一個(gè)時(shí)間戳以進(jìn)一步計(jì)算尖峰脈沖的發(fā)放率。具有相同形狀的尖峰由相同的神經(jīng)元產(chǎn)生。有時(shí),可以從一個(gè)單個(gè)通道中分出兩種類型的尖峰,如圖2(b)所示,從圖2(a)中分出了兩種尖峰波形,表明單個(gè)微電極可以記錄多個(gè)神經(jīng)元活動(dòng)。
多通道記錄系統(tǒng)已廣泛用于神經(jīng)元放電記錄。通過(guò)繪制自相關(guān)曲線和互相關(guān)曲線來(lái)分析不同通道信號(hào)之間的相關(guān)性。此外,相關(guān)系數(shù)由Matlab系統(tǒng)的內(nèi)置“xcorr”函數(shù)計(jì)算得出,以專門分析通道之間的相關(guān)性。兩個(gè)相關(guān)性較低的渠道反映了渠道之間的相似性較低。圖2(c)示出了記錄的自發(fā)發(fā)射的通道之間的自相關(guān)系數(shù)和互相關(guān)系數(shù)。由于相關(guān)的交換性質(zhì),相關(guān)矩陣關(guān)于其主對(duì)角線對(duì)稱。78.6%的互相關(guān)系數(shù)小于0.7,表明不同的通道同時(shí)記錄了豐富的信息,不同動(dòng)物的情況并不完全相同,但所有信號(hào)均具有較高的SNR和相對(duì)獨(dú)立的信息。
在氣味分子作用下,神經(jīng)元的放電速率會(huì)發(fā)生不同程度的變化。計(jì)算平均放電率(Mean Firing Rates,MFR)以評(píng)估對(duì)不同氣味的響應(yīng)。MFR定義為每秒檢測(cè)到的尖峰數(shù)。如預(yù)期的那樣,記錄的神經(jīng)元在氣味濃度為10×10-3mol時(shí),對(duì)辛酸和壬酸有顯著的響應(yīng)。相反,如圖3(a)所示的麻醉狀態(tài)下OR3大鼠對(duì)不同氣味刺激反應(yīng)的結(jié)果表明,神經(jīng)元對(duì)庚酸的反應(yīng)較低,這是由于庚酸不是OR3的配體,盡管庚酸與辛酸和壬酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)類似。與非配體氣味劑(庚酸)相比,由OR3的配體氣味(辛酸和壬酸)引起的MFR變化顯著增高(圖3(b))。這進(jìn)一步印證了之前的研究報(bào)道,即基因標(biāo)記的鼠M72嗅覺(jué)感覺(jué)神經(jīng)元對(duì)目標(biāo)氣味具有高敏感性反應(yīng)。當(dāng)氣味濃度調(diào)整為10-4mol甚至10-5mol時(shí),神經(jīng)元響應(yīng)變低(與氣味濃度為10×10-3mol相比,同一神經(jīng)元平均放電頻率分別下降1.6 Hz,3.0 Hz)。
圖3 麻醉狀態(tài)下OR3大鼠對(duì)不同氣味刺激反應(yīng)的高頻信號(hào)分析
結(jié)合生物工程的仿生電子鼻能夠特異性地識(shí)別目標(biāo)配體氣味,但還需要一種更有效的方法來(lái)區(qū)分這些氣味分子。PCA可以將數(shù)據(jù)的維數(shù)減少到幾個(gè)主要成分[11]。在該研究中,利用PCA從多通道信號(hào)中提取了氣味響應(yīng)模式,并以最少的信息損失來(lái)區(qū)分氣味分子。選擇了前3個(gè)主要成分來(lái)代表所有響應(yīng)數(shù)據(jù),占檢測(cè)總方差的90%以上,可以很好地代替原始特征量。將氣味刺激視為一個(gè)樣本集,將5個(gè)通道的響應(yīng)視為5維。一個(gè)通道的響應(yīng)是通過(guò)刺激后3 s內(nèi)的發(fā)射速率減去刺激前3 s內(nèi)的發(fā)射速率來(lái)評(píng)估的。樣品組在3個(gè)主要成分上的投影如圖3(d)所示。PCA的結(jié)果確定了兩個(gè)配體氣味(壬酸和辛酸)的清晰分離。盡管有微小的重疊,但可以成功區(qū)分不同化學(xué)類別的化合物,甚至是同一化學(xué)家族的相似化合物。這表明該體內(nèi)生物傳感系統(tǒng)具有很高的再現(xiàn)性和選擇性。
本文通過(guò)將大鼠的生物工程化嗅覺(jué)系統(tǒng)與可植入微電極相結(jié)合,開(kāi)發(fā)了一種在體生物電子鼻用于特異性目標(biāo)氣味的檢測(cè)。結(jié)果表明,該系統(tǒng)具有很高的特異性和穩(wěn)定性,是一種用于氣味檢測(cè)和識(shí)別的新技術(shù)。該生物電子鼻成功地記錄了多通道高質(zhì)量的大鼠嗅球M/T細(xì)胞信號(hào),并且每個(gè)通道高度獨(dú)立,因此可以提供豐富的嗅覺(jué)信息。通過(guò) PCA評(píng)估了針對(duì)不同氣味的獨(dú)特響應(yīng)模式。此外,通過(guò)Western Blotting的結(jié)果驗(yàn)證了OR3在嗅覺(jué)黏膜上的過(guò)表達(dá),通過(guò)不同的氣味測(cè)試探索了基因工程化大鼠對(duì)目標(biāo)氣味的特異性,結(jié)果表明該生物電子鼻系統(tǒng)提供了一種新型的特異性目標(biāo)氣味檢測(cè)方法,在相關(guān)領(lǐng)域具有廣泛的潛在應(yīng)用,例如環(huán)境監(jiān)測(cè)和爆炸物檢測(cè)等。