金文文，張 曉，劉 龍，周 瓊，毛玉環(huán)，譚咸操，譚黎明

（湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院/湖南省人民醫(yī)院，長沙 410000）

引言在全球范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌是三大最常見的惡性腫瘤，也是癌癥死亡率的重要原因之一［1，2］。在中國，由于人們生活水平的提高，飲食習(xí)慣發(fā)生改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率成逐年增長趨勢，在中國的發(fā)病率和死亡率居于第二位和第五位。結(jié)直腸癌早期通常無臨床癥狀，大約5%的早期結(jié)直腸癌可以得到確診，多數(shù)患者確診時已屬于中、晚期［3］，其治療及預(yù)后情況不佳；而早期及時發(fā)現(xiàn)、早治療5 年生存率可達90%，所以，結(jié)直腸癌的早發(fā)現(xiàn)、早診斷是降低結(jié)直腸癌患者的發(fā)病率和死亡率的關(guān)鍵。因此，加強中國結(jié)直腸癌篩查及發(fā)現(xiàn)合適有效的篩查方法，從而提高早期腫瘤的檢出率和降低病死率有重要意義。近年來，腫瘤標記物的聯(lián)合檢測對提升腫瘤早期診斷在臨床應(yīng)用中較為多見。我國的一項研究結(jié)果表明血清AFP、CEA 及CA125 的聯(lián)合檢測可明顯提高原發(fā)性肝癌的陽性檢出率［4］。糞便基因甲基化作為一種易保存、高檢出率、靈敏度較高、特異性較好的無創(chuàng)性結(jié)直腸腫瘤標志物，能通過其陽性結(jié)果對疑似病例進行進一步檢測，可作為篩查診斷結(jié)直腸腫瘤的一種重要的輔助手段。結(jié)直腸細胞更新速度比較快，一般每天結(jié)直腸脫落細胞大約有1010 個，與正常大腸黏膜相比，結(jié)直腸癌時的大腸黏膜脫落細胞數(shù)量更多，所以通過分析糞便脫落癌細胞和游離DNA 甲基化的狀況可進行有效的大腸癌篩查［5-6］。SDC2 為syndecan 家族，可以編碼完整的膜蛋白，該膜蛋白被高度糖基化以充當(dāng)細胞外基質(zhì)成分的受體。在結(jié)直腸癌中，SDC2 基因啟動子區(qū)發(fā)生異常甲基化，可做為腫瘤標志物用于結(jié)直腸癌的篩查［7-10］。NDRG4（N-mycdownstream-regulatedgene4）為抑癌基因NDRG 基因家族成員，此基因家族在人體多數(shù)其他正常組織中高表達，在一些腫瘤組織中，NDRG4 不表達或低表達，而低表達則可能與DNA 啟動子區(qū)域的高甲基化相關(guān)。該基因5'端調(diào)控區(qū)域內(nèi)含有的CpG 島容易在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中被檢出甲基化狀態(tài)［11-12］。因此，本研究作為研究對象，旨在通過對糞便SDC2 和NDRG4 基因甲基化檢測與結(jié)直腸癌的關(guān)聯(lián)性，來判斷人糞便SDC2 和NDRG4 基因在結(jié)直腸癌篩查中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 病例選擇與一般資料選擇 湖南省人民醫(yī)院2020年9 月1 日～2020 年12 月31 日期間住院收治的結(jié)直腸癌高危人群共32 例作為研究對象，年齡30～85 歲，其中男性16 例，女性16 例。納入標準：①有大便習(xí)慣改變（慢性腹瀉，慢性便秘）；大便性質(zhì)改變（粘液便，便血）；大便次數(shù)增多，＞3/天，腹部固定部位疼痛的患者；②原因不明的貧血患者；③有炎癥性腸病病史；④有結(jié)直腸癌家族病史；⑤有腸息肉的患者；⑥大腸癌手術(shù)后的患者。收集其新鮮糞便標本置-20℃保存?zhèn)溆?。本研究?jīng)醫(yī)院倫理委員會討論通過，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 NDRG4 和SDC2 基因甲基化檢測試劑購自人和未來生物科技（長沙）有限公司，癌胚抗原（carcinoembryonicantigen，CEA）檢測試劑購自蘇州豐泰醫(yī)療用品貿(mào)易有限公司，糖類抗原19－9（carbohydrateantigen199，CA19-9）檢測試劑購自北京健安生物科技有限公司，DJE-9 基礎(chǔ)電泳儀購自北京中慧天誠科技有限公司，C1000TMPCR 儀、GelDocTM EZSystemDE 等購自BIO-RAD 公司，全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（GBI-MAP800）購自武漢華大基因生物醫(yī)學(xué)工程有限公司，QIAampDNAStoolMiniKit（51604）、EpiTectBisulfiteKits（59104）等購自德國Qiagen 公司，Premix Taq（Ex Taq Version 2.0 plus dye）和TaKaRaEpiTaqTMHS（forbisulfite-treatedDNA）等購自Takara 公司，引物由引物由人和未來生物科技（長沙）有限公司合成。

1.3 檢測方法

1.3.1 甲基化NDRG4 和SDC2 檢測 每個受檢者領(lǐng)取一份糞便收集盒，受檢者在醫(yī)院按要求取5g 糞便放入糞便收集盒。嚴格按照試劑說明書進行檢測，使用糞便DNA 提取試劑盒從糞便樣本中提取基因組DNA，使用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒將基因組DNA 進行修飾，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變；隨后設(shè)計針對甲基化和非甲基化序列的引物進行PCR。通過計算NDRG4、SDC2 基因與內(nèi)標基因ACTB 的擴增Ct 比差值是否在判定臨界值內(nèi)，判斷甲基化水平。

1.3.2 腫瘤標志物檢測 受檢者均采取空腹靜脈血3mL，進行離心處理，3800r／min，離心5min，血清CEA、CA19-9 采用全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀以及試劑為儀器配套試劑。正常參考值為：CEA ≤5ng／mL，CA19-9 ≤35U／mL。

1.4 結(jié)果判斷 本試劑盒的陽性判斷值為：當(dāng)內(nèi)標基因ACTB 檢測Ct 值≤37 時，SDC 檢測Ct 值≤41.64 或NDRG4 檢測Ct 值≤36.07，檢測結(jié)果為陽性；當(dāng)內(nèi)標基因ACTB 檢測Ct 值≤37 時，SDC2 檢測CT 值>41.64 或無CT 值，且NDRG4 檢測CT 值>36.07 或無CT 值，檢測結(jié)果判定為陰性；當(dāng)內(nèi)標基因ACTB 檢測Ct 值>37或無CT 值時，檢測結(jié)果無效，需重新檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用 用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以百分比表示，采用χ2檢驗，采用ROC 曲線來評判靈敏度及特異度，當(dāng)P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糞便SDC2 基因甲基化水平分析 表1 示，結(jié)直腸癌術(shù)后化療組、結(jié)直腸息肉組和結(jié)直腸癌組糞便SDC2 基因甲基化陽性檢出率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，χ2=25.433，P<0.001，組間比較發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組SDC2基因甲基化陽性檢出率高于結(jié)直腸癌術(shù)后化療組、結(jié)直腸息肉組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。NDRG4 基因甲基化水平分析表2 示，結(jié)直腸癌術(shù)后化療組、結(jié)直腸息肉組和結(jié)直腸癌組糞便NDRG4 基因甲基化陽性檢出率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，χ2=8.983，P<0.05，組間比較發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組NDRG4 基因甲基化陽性檢出率高于結(jié)直腸癌術(shù)后化療組、結(jié)直腸息肉組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。SDC2/NDRG4 基因甲基化水平分析表3 示，結(jié)直腸癌術(shù)后化療組、結(jié)直腸息肉組和結(jié)直腸癌組糞便SDC2/NDRG4 基因甲基化陽性檢出率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，χ2=25.433，P<0.001，組間比較發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組SDC2/NDRG4 基因甲基化陽性檢出率高于結(jié)直腸癌術(shù)后化療組、結(jié)直腸息肉組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 各組患者糞便SDC2甲基化檢測結(jié)果比較

表2 各組患者糞便NDRG4甲基化檢測結(jié)果比較

表3 各組患者糞便SDC2、NDRG4甲基化檢測結(jié)果比較

2.2 血清腫瘤標志物水平分析 表4 示，結(jié)直腸癌術(shù)后化療組、結(jié)直腸息肉組和結(jié)直腸癌CA19-9 陽性檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表5 示，結(jié)直腸癌術(shù)后化療組、結(jié)直腸息肉組和結(jié)直腸癌CEA 陽性檢出率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，χ2＝13.411，P<0.05。組間比較顯示，結(jié)直腸癌組CEA 陽性檢出率高于結(jié)直腸癌術(shù)后化療組、結(jié)直腸息肉組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。表6 示，結(jié)直腸癌術(shù)后化療組、結(jié)直腸息肉組和結(jié)直腸癌CA19-9/CEA 陽性檢出率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，χ2=14.129，P<0.05。組間比較顯示，結(jié)直腸癌組CA19-9/CEA 陽性檢出率高于結(jié)直腸癌術(shù)后化療組、結(jié)直腸息肉組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表4 各組患者血清腫瘤標志物CA19-9檢測結(jié)果比較

表5 各組患者血清腫瘤標志物CEA檢測結(jié)果比較

表6 3組患者血清腫瘤標志物CEA/CA19-9檢測結(jié)果比較

2.3 糞便基因甲基化及血清腫瘤標志物曲線下面積分析 SDC2/ NDRG4、NDRG4、SDC2 基因甲基化檢測特異度高于CEA、CA19-9、CEA/CA19-9，NDRG4 特異度最高。SDC2/ NDRG4、SDC2 基因甲基化檢測靈敏度高于NDRG4、CEA、CA19-9、CEA/CA19-9。SDC2/NDRG4，SDC2 檢測陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值最高。分析ROCAUC 示，SDC2 和NDRG4 甲基化聯(lián)合檢測最高，其次為SDC2 基因檢測。

表7 結(jié)直腸癌患者糞便SDC2、NDRG4、SDC2/NDRG4及CEA/CA19-9檢測效果比較

圖1 3組受試者的SDC2甲基化（45-Ct）

圖2 3組受試者的NDRG4甲基化（45-Ct）

3 討論

根據(jù)IARC 發(fā)布的2020 年全球最新癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，直腸癌新發(fā)病例數(shù)和死亡病例數(shù)分別位于所有惡性腫瘤的第三位和第二位。目前結(jié)腸鏡是早期發(fā)現(xiàn)腸癌的最重要的檢查，其敏感度及特異度最好，但是結(jié)腸鏡作為侵入性檢查，檢查過程中要求患者做腸道準備及存在暴露隱私等缺點，使其難以廣泛應(yīng)用于篩查。還有一些檢測方法如糞便隱血試驗、直腸指檢、腫瘤標記物檢測、結(jié)腸CT 等，均存在不同程度的敏感度低及特異度不高的缺點。CEA、CA19-9 等血清學(xué)腫瘤標志物是CRC 臨床輔助診斷和預(yù)后判斷中常見的方式，但特異性不高，使其在臨床診斷的應(yīng)用中價值不高。SDC2 、NDRG4 基因甲基化是CRC 重要的生物學(xué)特征［13-16］，因此通過分析糞便中游離DNA 甲基化的狀況可以進行有效的結(jié)直腸癌篩查。在糞便樣本中檢測特定基因的DNA 甲基化是實現(xiàn)結(jié)直腸癌檢測的一種有潛力的選擇［17-18］，近來發(fā)布的直腸癌篩查指南中提出要將糞便DNA 檢測作為理想的篩查技術(shù)。DNA 甲基化是表觀遺傳學(xué)的主要范疇，可以通過各種機制來影響不同基因的表達，在結(jié)直腸癌的形成和發(fā)展過程中有著重要意義［19-21］。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組糞便基因SDC2 、NDRG4 陽性檢出率顯著高于結(jié)直腸癌術(shù)后化療組、直腸息肉組，說明糞便基因SDC2 、NDRG4甲基化檢測可作為結(jié)直腸癌患者篩查的有效指標；結(jié)直腸癌組陽性檢出率顯著高于術(shù)后化療組，說明糞便基因SDC2 、NDRG4 甲基化檢測不僅有助于結(jié)直腸癌手術(shù)效果的評價，還能用于監(jiān)測疾病的復(fù)發(fā)。糞便基因SDC2/ NDRG4、NDRG4、SD2 甲基化檢測特異度高于CEA、CA19-9、CEA/CA19-9。SDC2/ NDRG4，SDC2 檢測陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值最高。同樣根據(jù)ROCAUC分析顯示，SDC2 和NDRG4 甲基化聯(lián)合檢測最高，說明SDC2 、NDRG4 甲基化聯(lián)合檢測可作為CRC 篩查的有效指標。聯(lián)合糞便基因SDC2 、NDRG4 甲基化檢測優(yōu)于CEA 聯(lián)合CA19-9 的診斷效能。糞便基因SDC2 、NDRG4 甲基化檢測有助于CRC 患者的篩查及預(yù)后，對于指導(dǎo)臨床診療工作有重大意義。由于該研究中樣本量有限，要進一步證實SDC2 、NDRG4 甲基化水平與結(jié)直腸癌發(fā)展及預(yù)后的關(guān)聯(lián)性還需要開展更多大樣本研究。

圖3 NDRG4、SDC2及由Logistic回歸所得預(yù)測概率P的ROC曲線