張晉霞，張志勇，張 蕊，劉 斌，費云瀚，毛文靜，鄧春穎，李世英

（華北理工大學附屬醫(yī)院，唐山 063000）

腦缺血再灌注損傷是指腦缺血引起的腦細胞損傷，再灌注后血液再通，而腦損傷程度卻進一步加重。血腦屏障（BBB）作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細胞與血液中的細胞交換的場所，在調(diào)節(jié)血腦之間的運輸和維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)起著重要作用。在腦缺血等病理條件下，血腦屏障被破壞，血液中的有毒物質(zhì)通過受損的血腦屏障滲透到腦實質(zhì)，損害了正常的腦功能。在缺血后幾h 內(nèi)促炎因子被激活并釋放［1］，內(nèi)皮細胞被炎性因子激活，粘附分子表達增多，包括ICAM-1、VCAM-1 等，促進了白細胞和血小板的移動和粘附。白藜蘆醇（Res）是一種植物多酚，具有抗炎、抗腫瘤、保護心臟、抗氧化和保護神經(jīng)等作用［2］。研究表明［3］白藜蘆醇可減輕腦缺血大鼠BBB 通透性，減輕腦損傷。但是，白藜蘆醇后處理對腦I/R 大鼠腦水腫、BBB 的通透性、超微結(jié)構(gòu)及ICAM-1，VCAM-1 的影響未見相關報道。本研究探討不同劑量白藜蘆醇后處理對I/R 大鼠血腦屏障及ICAM-1、VCAM-1 的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究材料 SPF 級健康雄性SD 大鼠105 只（北京華阜康公司），鼠齡8～10 周，體重250～300g。經(jīng)我院動物倫理委員會批準。白藜蘆醇購自Sigma 公司，ICAM-1、VCAM-1 試劑盒購自上海江萊生物公司。

1.2 建立大鼠MCAO 模型 參照改良的Longa 法，10%水合氯醛350mg/kg 麻醉，大鼠備皮、消毒，切開頸部正中皮膚，分離組織。找到右側(cè)頸外A，結(jié)扎其遠端。動脈夾夾閉右側(cè)頸內(nèi)A、頸總A。在右側(cè)頸外A 刺破一小口，將MCAO 栓線從頸外A 插入，松開頸內(nèi)A 動脈夾，將MCAO 栓線插入頸內(nèi)A，深度為18.5±0.5mm，待有阻力感后停止，2h 后將栓線拔出約10mm。

1.3 分組與給藥 隨機將大鼠分為：假手術(shù)組、I/R 組、Res 組：低劑量（10mg/kg/d）、中劑量（20mg/kg/d）、高劑量（40mg/kg/d），每組21 只。假手術(shù)組只分離血管，不結(jié)扎血管；其他組均建立MCAO 模型。白藜蘆醇組在2h 栓線拔出即刻給予腹腔注射Res，假手術(shù)組腹腔注射等體積生理鹽水。

1.4 觀察指標 （1）I/R 后23h，尾靜脈注入2%伊文思藍。將腦組織放入3mL 的甲酰胺中，60℃孵育48h，取上清，測630nm 處吸光度值。采用標準曲線，計算伊文思藍含量。（2）將大鼠斷頭取腦，稱重（為腦組織濕重），放入105℃烘箱烘干48h 后稱重（腦組織干重），含水率（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。（3）將腦組織固定2.5%戊二醛 2h，PBS 漂洗后用1%四氧化鋨固定1h，梯度酒精脫水，環(huán)氧樹脂812 浸透后包埋，制成70nm 的切片，電鏡觀察。（4）按照試劑盒檢測腦組織ICAM-1、VCAM-1。

1.5 統(tǒng)計方法 釆用SPSS 軟件包進行分析。計量資料用均數(shù)±標準差表示，多組間比較釆用單因素方差分析，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)行為學評分對比 I/R 后1d，假手術(shù)組評分為0.00±0.00 分，I/R 組為2.58±0.37 分，不同濃度Res 組為：2.33±0.71、2.06±0.69、1.88±0.49 分，高劑量組與I/R 組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分、梗死側(cè)腦組織的含水量、腦組織依文思藍含量結(jié)果

2.2 干濕重法對比 I/R 后1d，假手術(shù)組腦組織含水量為（74.23±4.36）%，I/R 組為（82.97±4.47）%，不同濃度Res 組為：（80.76±5.82）%，（79.06±5.23）%，（77.65±4.02）%。I/R 組大鼠腦組織含水量高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。Res 組腦組織含水量均高于假手術(shù)組，低于I/R 組，高劑量組Res 腦組織含水量與I/R 組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），結(jié)果見表1。

2.3 依文思藍含量結(jié)果 I/R 后1d，假手術(shù)組依文思藍含量為0.96±0.33，I/R 組為6.51±1.21，不同濃度Res組為：6.32±1.36，6.19±1.17，5.96±0.92，I/R 組高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。不同濃度Res 組依文思藍含量低于I/R 組，高劑量組與I/R 組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），結(jié)果見表1。

2.4 電鏡觀察BBB 超微結(jié)構(gòu) 假手術(shù)組：血腦屏障結(jié)構(gòu)完整，血管結(jié)構(gòu)正常，無腫脹、變形，內(nèi)皮細胞、周細胞、星形膠質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)正常，未發(fā)現(xiàn)有細胞水腫或者空泡形成，基底膜與內(nèi)皮細胞之間連接緊密。I/R 組：血管周邊可見水腫，內(nèi)皮細胞、星形膠質(zhì)細胞和周細胞水腫非常明顯，周邊可見大片狀水腫及壞死，基底膜與內(nèi)皮細胞的連接出現(xiàn)大片狀斷裂。細胞器如線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等出現(xiàn)溶解或破壞。不同劑量Res 組：BBB損壞程度較I/R 組輕，內(nèi)皮細胞與基底膜連接較緊密，周細胞、星形細胞、內(nèi)皮細胞、基底膜等結(jié)構(gòu)較完整，破壞程度較輕。神經(jīng)細胞核、胞漿異常結(jié)構(gòu)改善，以高劑量組更為明顯（圖1）。

圖1 各組大鼠血腦屏障超微結(jié)構(gòu)

2.5 腦組織ICAM-1、VCAM-1 結(jié)果 I/R 后1d，I/R組腦組織中ICAM-1、VCAM-1 的含量高于假手術(shù)組，Res 組腦組織中ICAM-1、VCAM-1 的含量低于I/R 組，高劑量組與I/R 組ICAM-1、VCAM-1 的含量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠梗死側(cè)腦組織ICAM-1、VCAM-1結(jié)果（pg/ml）

3 討論

卒中是導致人類死亡的第二大病因，缺血性卒中占絕大多數(shù)（85%）。幾十年來，人們對I/R 進行了大量的研究，但其機制尚未完全闡明，涉及多種病理過程，包括自由基的大量生成、氧化應激的發(fā)生、炎癥級聯(lián)反應、Ca2+超載、細胞凋亡、興奮性氨基酸毒性等［4］。I/R對腦造成多種損害，如活性氧爆發(fā)、炎癥介質(zhì)過量產(chǎn)生、白細胞浸潤、微血管通透性增高、血腦屏障破壞、毛細血管灌注不足等［5］。

研究報道白藜蘆醇在大鼠腦組織缺血后具有保護作用［6］，可能與 AMPK/自噬途徑的激活有關。Hou等［7］研究表明白藜蘆醇的神經(jīng)保護作用可能是通過激活JAK2/STAT3 間接上調(diào) PI3K/AKT/mTOR 通路來實現(xiàn)的。本研究中，我們觀察了不同劑量Res 后處理對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能的影響，結(jié)果顯示不同劑量Res后處理均改善了I/R 大鼠的神經(jīng)功能，證明Res 后處理對I/R 損傷具有保護作用，以高劑量組最為顯著。

血腦屏障（BBB）通過維持微環(huán)境的穩(wěn)定性，保證腦功能的正常進行［8］。腦缺血后BBB 的破壞導致腦組織內(nèi)環(huán)境發(fā)生了變化，并伴有炎癥反應、氧化應激等，引起腦水腫，導致神經(jīng)元功能障礙。I/R 對BBB 的結(jié)構(gòu)造成了破壞，增加了BBB 的通透性［9］。本研究采用EB法、干濕重法、電鏡觀察白藜蘆醇后處理對BBB 的影響。結(jié)果表明，白藜蘆醇可減輕腦水腫，減少EB 外滲，改善超微結(jié)構(gòu)的破壞。白藜蘆醇可減輕大鼠腦缺血再灌注引起的血腦屏障的破壞。

ICAM-1、VCAM-1 屬于內(nèi)皮粘附蛋白，在靜止狀態(tài)下表達較低。當發(fā)生再灌注損傷時，ICAM-1、VCAM-1 通過調(diào)節(jié)白細胞和血管內(nèi)皮細胞之間的相互作用，促進白細胞浸潤到受損腦區(qū)［10］，引起微血管系統(tǒng)紊亂，導致“無血流”現(xiàn)象。研究表明［11］ICAM-1是卒中后腦損傷的重要因素，腦缺血后顱內(nèi)ICAM-1水平顯著增加，ICAM-1 敲除小鼠在腦缺血后表現(xiàn)出白細胞粘附減少、腦梗死面積減少、腦血流改善和死亡率降低［12］。本研究也顯示腦缺血再灌注后腦組織中ICAM-1 水平增加，白藜蘆醇組干預后ICAM-1、VCAM-1 水平較模型組下降，提示白藜蘆醇可以下調(diào)ICAM-1、VCAM-1 的表達。本研究也存在一定的不足，沒有進行細胞學分析，機制分析不深入，將在后續(xù)研究中進行探討。

綜上所述，白藜蘆醇可能通過下調(diào)ICAM-1 和VCAM-1，改善大鼠BBB 通透性，改善BBB 超微結(jié)構(gòu)的破壞程度，從而減輕I/R 后腦水腫程度，且具有劑量依賴性。