朱海龍 朱旭友

1.上海市閔行區(qū)腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，上海 200240；2.上海市同濟(jì)醫(yī)院病理科，上海 200065

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界范圍內(nèi)的常見惡性腫瘤之一。 據(jù)統(tǒng)計，全球每年CRC 新發(fā)病例約120 萬[1]。我國CRC 的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升之態(tài)勢，已成為國民健康的主要威脅之一[2]。 Fearon和Vogelstein 提出的正常黏膜-腺瘤-癌通路被視作CRC 的經(jīng)典遺傳模型[3]。 近年來，隨著鋸齒狀腺癌（serrated adenocarcinoma，SAC） 概念的提出， 尤其是SAC 正式列為CRC 的獨立亞型以來， 一種被稱作鋸齒狀通路的全新遺傳模式進(jìn)入人們的視野[4]。然而，無論是傳統(tǒng)的腺瘤-癌通路，還是新近的鋸齒狀通路，都認(rèn)為CRC 來自于腺瘤的惡性演變[5]。但到目前為止，推動CRA 癌變的分子機(jī)制尚未完全闡明。其中APC、p53、KRAS、BRAF 等基因的突變，以及染色體不穩(wěn)定性 （chromosomal instability，CIN）、CpG 島甲基化表型（CpG island methylator phenotype，CIMP） 和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）等表觀遺傳改變被證實為腺瘤癌變的原動力[6]。 最近多項研究顯示[7-11]，miR-218 在CRC、腺瘤和正常組織中存在差異化表達(dá)，并證實miR-218 具有抑癌作用，提示miR-218是潛在的CRC 調(diào)控靶點。 但miR-218 在結(jié)直腸腺瘤（colorectal adenoma，CRA） 中的研究卻鮮有報道。 因此，本研究在檢測miR-218 成熟體miR-218-5p 表達(dá)的基礎(chǔ)上，分析不同病理參數(shù)下的miR-218-5p 表達(dá)差異，為CRA 癌變機(jī)制的闡明提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2011 年1 月至2013 年12 月上海市同濟(jì)醫(yī)院的16 例結(jié)直腸腺瘤CRA 及8 例非腺瘤（non-adenoma，NA）石蠟組織作為研究對象，16 例 CRA 中，8例為傳統(tǒng)腺瘤（conventional adenoma，CA），8 例為鋸齒狀腺瘤（serrated adenoma，SA）。 依據(jù) 2010 年版WHO 標(biāo)準(zhǔn)[12]將 CA 分為管狀腺瘤（tubular adenoma，TA）、絨毛狀腺瘤（villous adenoma，VA）和管狀絨毛狀腺瘤（tubulovillous adenoma，TVA）；SA 分為無蒂鋸齒狀腺瘤（sessile serrated adenoma，SSA）和傳統(tǒng)鋸齒狀腺瘤（traditional serrated adenoma，TSA）。 本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 試劑設(shè)備

石蠟包埋組織RNA 提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司、SYBRTMPremix Ex TaqTM及 Prime-ScriptTMRT reagent Kit 購自寶生物工程（大連）有限公司 、U6 snRNA qPCR Primer 及 hsa-miR-218-5p qRT-PCR Primer 購自廣州市銳博生物科技有限公司；輪轉(zhuǎn)切片機(jī)RM-2235 型（德國 Leica 公司）、顯微鏡及拍照 Eclipse TI-s 系統(tǒng)（日本 Nikon 公司）、PCR儀GeneAmpR9700 型（美國 Applied Biosystems 公司）、Real time PCR 儀 LightCycler 1.5 型（瑞士 Roche 公司）、低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）。

1.3 miR-218-5p 表達(dá)檢測

參考TIANGENRRNAprep Pure FFPE Kit 說明書，經(jīng)組織脫蠟、洗滌二甲苯、裂解蛋白、去除DNA 及蛋白、溶解收集等步驟提取石蠟組織RNA。隨后以RNA為模板， 參照 PrimeScriptTMRT reagent Kit 及 Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCT Primer 說明書，利用 PCR儀，調(diào)整反應(yīng)參數(shù)為42℃ 60 min，70℃ 10 min 進(jìn)行miR-218-5p 及內(nèi)參 U6 snRNA 的逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription，RT）。 最后以 RT 產(chǎn)物為模板， 參照 SYBRRPremix Ex TaqTM及Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCT Primer 說明書， 利用Real time PCR 儀進(jìn)行實時定量PCR 反應(yīng)（Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR，qRT-PCR）， 檢測 miR-218-5p 的相對表達(dá)量。

1.4 miR-218-5p 表達(dá)分析

qRT-PCR 結(jié)束后記錄各樣本的Ct 值。 參考文獻(xiàn)報道[13]的方法：以人 U6 snRNA 為內(nèi)參，ΔCt =miR-218-5p Ct 值-U6 snRNA Ct 值， 同一樣本各復(fù)孔的－ΔCt 平均值即為miR-218-5p 的相對表達(dá)量。

1.5 觀察指標(biāo)及評價標(biāo)準(zhǔn)

分析比較 NA 與 CRA、NA 與 CA、NA 與 SA 中的miR-218-5p 表達(dá)。 評估不同年齡、性別，尺寸、位置、數(shù)量、病理類型，以及是否伴發(fā)同時性CRC（synchronous colorectal carcinoma，sCRC）等亞組腺瘤中的miR-218-5p 表達(dá)差異。 其中息肉尺寸依據(jù)結(jié)腸鏡下的觀察記錄，取最大直徑作為息肉尺寸；息肉的位置同樣依據(jù)結(jié)腸鏡下的觀察記錄，分為近端（包括盲腸、升結(jié)腸、橫結(jié)腸）和遠(yuǎn)端（降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸、直腸）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Prism 6.0 軟件制圖，采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-218-5p 在 CRA 與 NA 中的表達(dá)比較

24 例石蠟組織中，有 8 例 CRA（SA 與 CA 各 4例）和7 例NA 能提取出符合純度要求的RNA，且成功完成 qRT-PCR 檢測。 結(jié)果顯示：CRA 與 NA 兩 組的miR-218-5p 表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖 1A）。 亞組分析顯示：CA 與 NA 兩組的 miR-218-5p 表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖 1B）；而SA 組中的miR-218-5p 表達(dá)低于NA 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.478，P=0.007，圖 1C）。

圖1 miR-218-5p 在CRA 與 NA 中的表達(dá)比較

2.2 不同病理特征的miR-218-5p 表達(dá)比較

不同性別、年齡、尺寸、位置、數(shù)量及病理類型情況下的miR-218-5p 表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 伴發(fā) sCRC 的 CRA 中的 miR-218-5p 表達(dá)低于不伴sCRC 的CRA，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.556，P=0.043）（表 1）。

表1 不同病理特征的miR-218-5p 表達(dá)比較（n=8）

3 討論

CRC 是世界范圍內(nèi)的主要腫瘤，其發(fā)病率位居全球惡性腫瘤第三位[4]。 研究證實[6]，CRC 是因錯配修復(fù)、原癌、抑癌等諸多基因突變所致的異質(zhì)性疾病。目前，APC、p53、KRAS、BRAF 突變， 以及 CIN、CIMP、MSI 等分子事件被證實與CRA 癌變有關(guān)[14-16]。但CRC形成的分子機(jī)制遠(yuǎn)未被完全闡明。最近Gattolliat 等[17]利用qRT-PCR 技術(shù)證實CRA 和CRC 之間存在差異表達(dá)的 miRNA。 與此同時，Slattery 等[13]以 Agilent Human miRNA Microarray V19.0 為平臺進(jìn)行差異miRNA 篩選， 結(jié)果顯示CRA、CRC 與正常黏膜之間同樣存在差異表達(dá)的miRNA，提示miRNA 可能參與正常黏膜-CRA-CRC 的惡性演變。miR-218 是位于SLIT2/3基因編碼區(qū)的內(nèi)含子miRNA。成熟的miR-218 來自兩個獨立的基因座，其中miR-218-1 位于染色體4p15.31 的 SLIT2 基因編碼區(qū)，miR-218-2 則位于染色體5q35.1 的SLIT3 基因編碼區(qū)，而 miR-218-5p 是兩者共同的成熟體[18]。 作為miRNA 的成員之一，研究證實miR-218-5p 與胃癌、 肝癌、CRC 等眾多腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移相關(guān)[5-9]。 Deng 等[8]的研究顯示，胃癌中的miR-218 存在下調(diào)表達(dá)，而且低表達(dá)的miR-218 與較晚的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，以及不良的生存預(yù)后相關(guān)； 上調(diào)miR-218 的表達(dá)不僅可以誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生G1 期阻滯、抑制胃癌細(xì)胞增殖，還能調(diào)控胃癌的生長和轉(zhuǎn)移。 Ting 等[7]對肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中的 miR-218 表達(dá)進(jìn)行了研究，結(jié)果HCC 中的miR-218 表達(dá)下調(diào)；功能獲得試驗顯示， 提高miR-218 在HCC 細(xì)胞中的表達(dá)可抑制細(xì)胞的侵襲遷移，并能逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）。 此外，Zhang 等[7]對 CRC組織和細(xì)胞的miR-218 表達(dá)進(jìn)行了檢測， 證實了miR-218 在 CRC 中同樣存在下調(diào)表達(dá)，miR-218 過表達(dá)可抑制CRC 細(xì)胞LoVo 的增殖、侵襲及遷移。 進(jìn)一步研究提示，miR-218 可能通過調(diào)控PI3K/Akt/mTOR 通路活性來實現(xiàn)其抑癌作用。 本研究結(jié)果顯示，伴發(fā)sCRC 的腺瘤組織miR-218-5p 表達(dá)量低于不伴癌的腺瘤組織（P=0.043），與上述文獻(xiàn)報道相似。 本研究結(jié)果還顯示，作為CRA 亞型之一的SA，其miR-218-5p 表達(dá)較NA 下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.007）； 而 miR-218-5p 在 CA 和 NA 中的表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示SA 是有別于CA 的獨特CRA亞型。

綜上所述，miR-218-5p 在 CRA 亞型 SA，以及伴有sCRC 的腺瘤中表達(dá)下調(diào)， 提示miR-218-5p 可能成為SA 診斷的候選指標(biāo)。 此外需要說明的是，相較新鮮組織，使用石蠟組織提取RNA 要困難的多，這是造成本研究樣本量偏少，導(dǎo)致研究結(jié)果局限的關(guān)鍵因素，也是今后深入研究中亟需改進(jìn)的問題。