謝春紅 黃連江 廈門醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 （福建 廈門 361000）

內(nèi)容提要： 目的：探討隱球菌莢膜多糖抗原膠體金免疫層析法（CrAg-LFA）檢測(cè)在非人類免疫缺陷病毒（HIV）患者肺隱球菌病（PC）的診斷價(jià)值，比較進(jìn)口與國(guó)產(chǎn)CrAg-LFA試劑在非HIV患者PC患者不同樣本中的敏感性。方法：回顧性研究2018年1月1日～2020年12月31日本院呼吸中心收治的518例非HIV疑似PC患者。用兩種不同廠家的CrAg-LFA試劑盒檢測(cè)篩查患者血清和肺泡灌洗液（或防污染保護(hù)性毛刷樣本、肺穿組織）中的隱球菌莢膜多糖抗原（CrAg），對(duì)比兩種試劑盒在診斷PC時(shí)的敏感性和特異性。結(jié)果：確診的78例PC患者血清進(jìn)口試劑檢測(cè)60例陽(yáng)性，18例陰性；其中進(jìn)口試劑血清CrAg-LFA檢測(cè)的敏感性為76.92%，特異性為100%。國(guó)產(chǎn)試劑血清CrAg-LFA檢測(cè)的敏感性為79.49%，特異性為100%。1.兩種試劑的敏感性和特異性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.150，P＞0.05）2.血清標(biāo)本的敏感性大于肺泡灌洗液標(biāo)本。結(jié)論：CrAg-LFA具有準(zhǔn)確率高、快速簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，為PC的快速、早期診斷提供重要依據(jù)。國(guó)內(nèi)試劑盒和進(jìn)口試劑盒在非HIV肺隱球菌患者中不同標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異。

肺隱球菌病（Pulmonary Cryptococcosis，PC）是一種由隱球菌感染引起的肺部真菌病，隱球菌易播散至中樞神經(jīng)系統(tǒng)而導(dǎo)致隱球菌性腦膜炎，病死率，致殘率高。近年來(lái)多研究顯示，非HIV人群中PC的發(fā)病率呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)[1]。CrAg-LFA簡(jiǎn)單、快速、特異性高、靈敏度高，血清CrAg-LFA檢測(cè)已廣泛運(yùn)用于臨床以輔助隱球菌病的感染。原來(lái)國(guó)內(nèi)臨床實(shí)驗(yàn)室采用都是進(jìn)口試劑，近年來(lái)多家國(guó)產(chǎn)試劑不斷運(yùn)用在臨床中。本研究回顧性分析過(guò)去本院三年來(lái)疑似PC患者的資料，探討CrAg-LFA檢測(cè)不同標(biāo)本在非HIV患者PC的診斷價(jià)值，比較兩種不同試劑盒在非HIV肺隱球菌患者不同標(biāo)本的敏感性和特異性。

1.資料與方法

1.1 臨床資料

收集2018年1月1日～2020年12月31日本院研究最終確診的PC患者78例，患病年齡為23～76歲，平均（44±15.2）歲，其中男性52例（66.7%），平均年齡（47±12.4）歲，女性26例（33.3%），平均年齡（39±11.5）歲，男女患病年齡沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，此次回顧性研究顯示，PC的發(fā)病率，男性高于女性，因數(shù)據(jù)基數(shù)小不具有代表性?；颊咧杏谢A(chǔ)疾病的占36例（46.2%），包括慢性阻塞性肺病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、糖尿病、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、高血壓病、慢性乙型病毒性肝炎、肺結(jié)核、腦梗死、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、鼻咽癌放療后，無(wú)基礎(chǔ)疾病42例（53.8%）。追問(wèn)病史半年內(nèi)有鴿子接觸史5例。

儀器與試劑：美國(guó)Immuno-Mycologies有限公司生產(chǎn)及浙江溫州康泰生物有限公司生產(chǎn)的CrAg-LFA試劑；法國(guó)生物梅里埃有限公司生產(chǎn)的真菌YST鑒定卡；美國(guó)賽默飛公司生產(chǎn)的Versa TREK全自動(dòng)血培養(yǎng)儀；鄭州安圖生物有限公司生產(chǎn)的平板。

1.2 方法

1.2.1 IMMYCrAg-LFA檢測(cè)。常規(guī)無(wú)菌操作方法收集全血無(wú)菌樣本，3000r/min離心10min，分離血清，小試管內(nèi)加入一滴樣本稀釋液，再加入40μL血清，充分混勻，插入試紙條，放置10min，讀取結(jié)果。出現(xiàn)一條質(zhì)控線為陰性，質(zhì)控線與檢測(cè)線同時(shí)出現(xiàn)為陽(yáng)性，只出現(xiàn)檢測(cè)線而無(wú)質(zhì)控線則檢測(cè)失敗。肺泡灌洗液（BALF液）、防污染保護(hù)性毛刷樣本（PSB樣本）、肺穿組織（經(jīng)研磨后）的檢測(cè)操作參照血清標(biāo)本進(jìn)行操作。

1.2.2 溫州康泰CrAg-LFA檢測(cè)。常規(guī)無(wú)菌操作方法收集全血無(wú)菌樣本，3000r/min離心10min得到待測(cè)血清后，將待測(cè)樣本及檢測(cè)試劑盒置于室溫平衡，移取40μL樣品稀釋液到試管中，然后抽取40μL樣品并與稀釋液混合，再使用移液器在稀釋后抽取60μL樣品，并將其添加到測(cè)試卡的孔中。等待20min，然后判定結(jié)果，出現(xiàn)一條質(zhì)控線為陰性，質(zhì)控線與檢測(cè)線同時(shí)出現(xiàn)為陽(yáng)性，只出現(xiàn)檢測(cè)線而無(wú)質(zhì)控線則檢測(cè)失敗。BALF液、PSB標(biāo)本、肺穿組織（經(jīng)研磨后）操作參照血清標(biāo)本進(jìn)行操作。

1.2.3 病理檢查。CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺活檢，組織固定包埋、切片，HE染色及特殊染色。

1.2.4 血培養(yǎng)。采集患者血液進(jìn)行培養(yǎng)，或CT引導(dǎo)下取肺穿刺物，經(jīng)玻璃組織研磨器研磨注入血培養(yǎng)瓶并上機(jī)培養(yǎng)，陽(yáng)性瓶立刻用血瓊脂平板和沙保羅平板轉(zhuǎn)種，生長(zhǎng)后挑取疑似隱球菌的菌落用YST卡鑒定。

1.2.5 鏡檢和真菌培養(yǎng)。由臨床醫(yī)生收集BALF液、PSB樣本及肺穿組織（經(jīng)研磨）。標(biāo)本經(jīng)3000r/min離心10min可直接涂片革蘭染色；同時(shí)用濕片進(jìn)行墨汁染色；接種血瓊脂平板和沙保氏平板，放入35°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d，生長(zhǎng)并分純后用YST卡片進(jìn)行鑒定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

檢測(cè)方法間的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＞0.05無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.實(shí)驗(yàn)室結(jié)果

2.1 BALF、PSB標(biāo)本或肺穿刺組織標(biāo)本墨汁染色結(jié)果

由臨床醫(yī)生氣管鏡下收集肺泡灌洗液（BALF）和防污染保護(hù)性樣本毛刷（PSB）樣本，CT定位下穿刺取得肺穿標(biāo)本（經(jīng)研磨），3000r/min離心10min，沉渣進(jìn)行墨汁染色，如在黑色背景鏡下可見圓形孢子，周圍有一較寬的折光性強(qiáng)的厚莢膜，判斷為陽(yáng)性如下圖1、圖2，78例確診患者中有14例墨汁染色陽(yáng)性，陽(yáng)性率23.1%。

圖1. 不同濃度墨汁染色下的隱球菌

圖2. 不同濃度墨汁染色下的隱球菌

2.2 BALF液、PSB標(biāo)本或者肺穿組織標(biāo)本真菌培養(yǎng)結(jié)果

BALF、PSB標(biāo)本及肺穿組織（經(jīng)研磨后）接種于沙保羅平板，放入35°C培養(yǎng)箱內(nèi)，生長(zhǎng)后分純，可疑菌落用梅里埃的YST卡鑒定。培養(yǎng)出20例隱球菌，通過(guò)菌株鑒定，15例為格特隱球菌，其余5例為新生隱球菌。

2.3 氣管鏡下活檢組織或者肺穿刺標(biāo)本的病理結(jié)果

在本次回顧性研究中，78例患者的病理標(biāo)本的報(bào)告中只報(bào)告12例隱球菌，肺組織標(biāo)本中，病理學(xué)大部分表現(xiàn)出慢性肉芽腫性炎，肉芽腫由泡沫細(xì)胞、上皮樣組織細(xì)胞、多核巨細(xì)胞聚集等構(gòu)成，常規(guī)切片HE染色可以見到呈明顯的圓形結(jié)構(gòu)的隱球菌，直徑大小大約2～15μm，有白色莢膜，糖原染色莢膜可呈淡紅色（見圖3）。

圖3. 肺穿組織糖原染色下的隱球菌

2.4 CrAg-LFA檢測(cè)結(jié)果

兩組患者的BALF液、PSB標(biāo)本或者肺組織標(biāo)本檢測(cè)CrAg-LFA，判斷標(biāo)準(zhǔn)參照?qǐng)D4，CrAg-LFA結(jié)果見表1，血清標(biāo)本進(jìn)口試劑CrAg-LFA檢測(cè)的敏感性為76.92%，國(guó)產(chǎn)試劑CrAg-LFA檢測(cè)的敏感性為79.49%，兩者的特異性均為100%，BALF液進(jìn)口試劑CrAg-LFA檢測(cè)的敏感性為65.38%，國(guó)產(chǎn)試劑CrAg-LFA檢測(cè)的敏感性為62.82%，兩者的特異性均為99.7%。①進(jìn)口試劑和國(guó)產(chǎn)試劑檢測(cè)CrAg結(jié)果未見明顯差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.150，P＞0.05），結(jié)果見表2。②進(jìn)口試劑血清標(biāo)本的敏感性大于肺泡灌洗液標(biāo)本的敏感性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.530，P＞0.05），結(jié)果見表3。國(guó)產(chǎn)試劑血清標(biāo)本的敏感性大于肺泡灌洗液標(biāo)本的敏感性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.278，P＜0.05），結(jié)果見表4。

表1. 兩組患者兩種標(biāo)本兩種隱球菌莢膜膠體金試劑檢測(cè)結(jié)果及隱球菌培養(yǎng)結(jié)果(n)

表2. 兩種試劑血清標(biāo)本隱球菌莢膜膠體金試劑檢測(cè)結(jié)果

表3. 進(jìn)口試劑血清和BALF隱球菌莢膜膠體金試劑檢測(cè)結(jié)果

表4. 國(guó)產(chǎn)試劑血清和BALF隱球菌莢膜膠體金試劑檢測(cè)結(jié)果

圖4. 進(jìn)口和國(guó)產(chǎn)膠體金試劑陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果

3.討論

近年來(lái)PC的報(bào)道例數(shù)顯著增高，是僅次于念珠菌、曲霉菌的第三大類肺真菌病。越來(lái)越多的國(guó)內(nèi)、外研究表明近年來(lái)隱球菌病在健康人群中的發(fā)病率逐年上升，PC在非HIV人群中的發(fā)病率甚至超過(guò)免疫缺陷患者的發(fā)病率，免疫功能正常的PC患者高達(dá)62.8%[3]。在非HIV人群中PC發(fā)病隱匿，無(wú)臨床癥狀，影像學(xué)表現(xiàn)沒有特異性，血培養(yǎng)、痰培養(yǎng)真菌檢出率偏低，有時(shí)很難和肺結(jié)核、細(xì)菌性肺炎、肺癌等疾病相鑒別，誤診率高[4]。本研究對(duì)本院2018年1月1日～2020年12月31日的78例非HIV患者確診PC進(jìn)行回顧性分析。其中高達(dá)53.8%的患者無(wú)基礎(chǔ)疾病，與既往報(bào)道相符，42例無(wú)任何臨床癥狀，僅體檢時(shí)CT發(fā)現(xiàn)胸部異常入院，這就考慮隱球菌有相當(dāng)?shù)亩玖ΓR床需要加強(qiáng)對(duì)PC的認(rèn)識(shí)，在健康人群發(fā)現(xiàn)肺部疾病時(shí)也要考慮隱球菌病的可能性，爭(zhēng)取做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療。

感染性疾病主要通過(guò)病原學(xué)和病理學(xué)檢查確診，PC也是如此。PC目前主要依靠肺組織病理檢查或者通過(guò)血液、BALF液、PSB標(biāo)本或肺穿刺標(biāo)本培養(yǎng)出隱球菌，雖然特異性高，但是靈敏度低，而且需要較長(zhǎng)時(shí)間，并且多為有創(chuàng)性檢查，標(biāo)本獲取較難。有研究表明對(duì)于診斷隱球菌病，CrAg檢測(cè)敏感性遠(yuǎn)高于鏡檢或者培養(yǎng)或者病理。本研究中只有14例陽(yáng)性墨汁染色，真菌培養(yǎng)只有20例陽(yáng)性，與以往相符。這是既往PC誤診率高的主要原因。本研究中的患者常見的感染性指標(biāo)如白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比、C反應(yīng)蛋白幾乎都正常，所有患者的降鈣素原也都正常。莢膜多糖是隱球菌的主要毒力因子，它可以抑制中性粒細(xì)胞的吞噬，削弱T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。CrAg檢測(cè)主要用于檢測(cè)腦脊液標(biāo)本、血清標(biāo)本中的CrAg，它包括乳膠凝集試驗(yàn)（LA法）、酶聯(lián)免疫法，膠體金法（LFA）等，CrAg-LFA是一項(xiàng)側(cè)向?qū)游鰴z測(cè)技術(shù)，國(guó)外有研究顯示，此法對(duì)隱球菌病的敏感度和特異度高達(dá)93%～100%，敏感性比LA法高100倍，因此被FDA批準(zhǔn)用于血清標(biāo)本和腦脊液標(biāo)本的檢測(cè)。近年多項(xiàng)報(bào)道提出膠體金免疫層析法具有人員資質(zhì)要求低，室溫穩(wěn)定，便捷準(zhǔn)確，優(yōu)于其他學(xué)方法，成為檢測(cè)隱球菌抗原的首選方法[5]。隨著膠體金試劑盒的廣泛使用，使得PC的檢出率劇增。血清隱球菌莢膜多糖抗原檢測(cè)對(duì)診斷PC具有較高的敏感性和特異性。從本研究進(jìn)口試劑和國(guó)產(chǎn)試劑在78例非HIV PC患者血清標(biāo)本的結(jié)果來(lái)看，兩者的敏感性和特異性無(wú)顯著差異。