艾曉莉，馮艷林，劉達玉，顏軍*，劉剛，王毅

(1.成都大學 四川抗菌素工業(yè)研究所，成都 610052; 2.四川省食品藥品檢驗檢測院，成都 611731)

花色苷，是花青素與糖通過糖苷鍵結合的多酚類黃酮化合物[1]，廣泛存在于黑色、藍色、紫色等有色作物中，黑色谷物主要呈色物質(zhì)為矢車菊素[2-6]，即矢車菊素-3-O-葡萄糖苷。研究證明，花色苷具有抗氧化、抗衰老、抗癌等作用[7-8]，因此常被加入食品、保健品中[9]，而花色苷定量檢測作為評估產(chǎn)品價值的首要方法顯得尤為重要?；ㄉ諟蚀_定量的前提是最大限度提取作物花色苷，目前花色苷的提取試劑主要是甲醇、乙醇、水，由于花色苷在酸性條件下以比較穩(wěn)定的紅色黃烊鹽陽離子形式存在，而在堿性條件下以結構不穩(wěn)定的藍色醌式堿形式存在[10]，因此常在提取試劑中加入鹽酸以提高花色苷的穩(wěn)定性，但由于鹽酸屬于國家易制毒試劑，具有難購買、安全性差及易揮發(fā)性等缺點，因此尋找安全、高效的酸試劑勢在必行[11]。

氨基磺酸是一種固體酸試劑，具有不揮發(fā)、毒性低、購買方便等優(yōu)點，利用自動電位滴定儀對其0.1%水溶液進行測定，pH值約有1.710，與0.1%鹽酸pH值接近，說明其低濃度水溶液仍具有較強酸性。本試驗在前期復合米酒釀造工藝的基礎上[12]，以有色作物黑糯米、血糯米、黑糯玉米為復合谷物原料，采用氨基磺酸乙醇振蕩提取法，探索復合谷物花色苷最佳提取工藝，并對黑糯米、血糯米、黑糯玉米花色苷總量與矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量進行綜合分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

復合谷物黑糯米∶血糯米∶黑糯玉米為37 g∶40 g∶23 g[12]；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(HPLC，≥98%)：北京世紀奧科生物技術有限公司；氯化鉀、乙酸鈉(均為分析純)：天津科密歐化學試劑有限公司；氨基磺酸、甲酸、草酸、三氟乙酸、鹽酸、95%乙醇(均為分析純)：成都市科隆化學品有限公司；甲醇(HPLC，≥99.9%)：西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設備

800Y型粉碎機 永康市鉑歐五金制品有限公司；JYL-C16V型料理機 九陽股份有限公司；Elma TI-H5超聲波清洗儀 德國Elma公司；Thermo Multifuge X4R Pro離心機 美國賽默飛世爾科技公司；XS105DU電子天平、ME204電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司；Heidolph Multi Reax振蕩器 德國Heidolph公司；Lambda 35紫外可見分光光度計 美國鉑金埃爾默公司；855型自動電位滴定儀 瑞士萬通公司；島津LC-20AT液相色譜儀(配PDA檢測器) 日本島津公司；ZORBAX SB-C18色譜柱 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 花色苷提取及檢測方法

稱量1.5 g復合谷物，分兩次共加入50 mL提取試劑，振蕩(2000 r/min，15 min)提取2次，4 ℃下4000 r/min離心5 min，合并提取液，加提取試劑定容至50 mL，取1 mL提取試劑分別加入pH 1.0鹽酸-氯化鉀緩沖溶液和pH 4.5醋酸-醋酸鈉緩沖溶液定容至10 mL，避光、常溫處靜置60 min[13]，測定波長513 nm和700 nm處的吸光度，參照李曉嬌等[14]的方法計算花色苷含量。花色苷計算公式：

(1)

A=(A513-A700)pH 1.0-(A513-A700)pH 4.5。

(2)

式中：MW=449.2(為矢車菊素葡萄糖苷分子量)；DF為稀釋倍數(shù)；V為提取液定容體積(mL)；ε=26900(ε為摩爾消光系數(shù))；m為復合谷物樣品質(zhì)量(g)；l為比色皿厚度(cm)。

1.3.2 酸試劑、提取試劑及提取方式的篩選

準確稱量復合谷物，分別加入0.1%、0.5%的鹽酸(HCl)、氨基磺酸(SA)、三氟乙酸(TFA)、草酸(OA)水溶液，振蕩提取，測定花色苷含量，見圖1中a。

準確稱量復合谷物，分別加入0.1% SA水溶液，20%、60%乙醇(含0.1% SA)溶液(簡寫20% EA、60% EA)，20%、60%甲醇(含0.1% SA)溶液(簡寫20% MT、60% MT)振蕩提取，測定花色苷含量，見圖1中b。

準確稱量復合谷物，分別加入60%乙醇(含0.1% SA)溶液靜置、振蕩、超聲、振蕩協(xié)同超聲提取15 min，測定花色苷含量，見圖1中c。

圖1 不同酸試劑(a)、提取試劑(b)及提取方式(c)對花色苷含量的影響

1.3.3 單因素試驗

參照1.3.1的方法，分別對氨基磺酸濃度(0.01%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.3%、0.5%、1.0%)、料液比(1∶50、1.5∶50、2∶50、2.5∶50、3∶50)、提取時間(5，10，15，20，25，30 min)、乙醇含量(30%、40%、50%、60%、70%)、提取次數(shù)(1，2，3，4，5次)進行提取工藝優(yōu)化單因素試驗考察，以花色苷含量為提取量的評價指標，利用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8.0.2進行顯著性和作圖分析，研究各因素對花色苷提取量的影響。

1.3.4 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果，以花色苷含量為指標，選取氨基磺酸濃度(A)、料液比(B)、提取次數(shù)(C)、乙醇含量(D)4個單因素進行正交優(yōu)化試驗，研究復合谷物花色苷最佳提取工藝。采用L9(34)正交表進行四因素三水平正交試驗設計，見表1。每組試驗進行3組重復試驗，記錄試驗結果，利用SPSS 22.0進行方差分析。

表1 正交試驗因素水平表

1.3.5 檢測方法

花色苷含量：pH示差法，參照上述試驗獲得的提取工藝和1.3.1的方法對谷物進行提取及花色苷含量測定。

2 結果與分析

2.1 酸試劑、提取試劑及提取方式篩選的結果

由圖1中a可知，不同酸試劑的水溶液在不同濃度下對花色苷的提取有較大影響，鹽酸與氨基磺酸水溶液在同一濃度時對花色苷的提取作用相似，并大于三氟乙酸與草酸，但由于鹽酸與三氟乙酸均具有一定的揮發(fā)性，對試驗結果和人員均會造成影響，因此選擇安全性較高的氨基磺酸作為花色苷提取的酸試劑。

由圖1中b可知，在含有0.1%氨基磺酸的甲醇、乙醇、水中，花色苷均有不同程度溶出，表現(xiàn)出易溶于極性溶劑的性質(zhì)，可能是因為花色苷易被極性側鏈糖苷化，但花色苷在高濃度醇溶液中溶解性遠大于水溶液，可能是由于花色苷在親水性有機溶劑中有更好的溶解，因此乙醇作為花色苷最佳提取溶劑，具有較高的安全性。

由圖1中c可知，振蕩、超聲和振蕩協(xié)同超聲處理復合谷物，其提取量相差甚微且均大于靜置提取，但由于超聲處理過程中會產(chǎn)生一定熱量，易導致花色苷降解速率加快[15],因此試驗以振蕩作為花色苷最佳提取方式。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 不同氨基磺酸濃度對花色苷提取的影響

由圖2可知，花色苷含量在不同濃度氨基磺酸溶液中呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，當氨基磺酸含量從0.01%～0.05%時，花色苷含量明顯上升，這可能是因為含0.01%氨基磺酸的溶液呈微酸性，花色苷以紫色或淺紫色中性的醌式堿形式存在，而羥基或甲基等供電子基團的存在會降低花色苷的穩(wěn)定性，因此pH值較低的溶劑適合花色苷的提取和保存；而0.05%～0.15%時，花色苷含量上升不明顯并接近最大值，可能是因為pH<3的酸性溶液具有破壞細胞膜，溶解和穩(wěn)定水溶性色素的作用[16-17]；繼續(xù)增加氨基磺酸濃度，花色苷含量降低，可能是酸濃度較高時淀粉水解，糖類與花色苷的溶解形成競爭，選取0.05%、0.10%、0.15%作為正交試驗的3個水平值。

圖2 不同氨基磺酸濃度對花色苷含量的影響

2.2.2 不同料液比對花色苷提取的影響

由圖3可知，花色苷含量隨著料液比的增大呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢，當料液比(g/mL)為1∶50～1.5∶50時，花色苷含量由163.37 mg/100 g下降至162.93 mg/100 g，P=0.886(P>0.05)說明1∶50～1.5∶50之間無顯著性差異；當料液比(g/mL)為1∶50～1.5∶50時達到最大，可能是此時濃度梯度具有花色苷由內(nèi)向外溶出的最大驅動力導致的[18]；但物料繼續(xù)增加，花色苷含量逐漸減少，可能是因為花色苷溶出總量超過飽和狀態(tài)導致花色苷分子間的作用力減弱，穩(wěn)定性降低，花色苷容易被分解[19]，同時雜質(zhì)溶出也會隨谷物含量的增加而增加，導致花色苷含量減少，選取料液比1∶50、1∶50、2∶50 (g/mL)作為正交試驗的3個水平值。

圖3 不同料液比對花色苷含量的影響

2.2.3 不同提取時間對花色苷提取的影響

由圖4可知，提取時間對花色苷含量的影響較小，提取時間在5～10 min時，花色苷含量從170.37 mg/100 g上升至170.80 mg /100 g，經(jīng)SPSS 22.0顯著性分析，提取時間5，15，20，25 min與10 min進行顯著性分析，其P值分別為0.928，0.576，0.051，0.286(P>0.05)，說明提取時間5～25 min之間無顯著性差異，造成這種變化可能是因為谷物原料經(jīng)充分破碎和高速振蕩提取后，花色苷能快速溶出，但當提取時間延長至30 min時，花色苷含量降為158.46 mg/100 g，可能是延長提取時間，光照會導致花色苷碳骨架在C2位斷開，破壞其結構和穩(wěn)定性，逐步水解和降解[20]，導致花色苷含量降低，因此10 min作為花色苷的最佳提取時間。

圖4 不同提取時間對花色苷含量的影響

2.2.4 不同乙醇含量對花色苷提取的影響

由圖5可知，乙醇含量對花色苷提取量的影響具有顯著性差異，乙醇含量在30%～60%之間，乙醇含量的增加可能提升了溶液的滲透力和花色苷的溶出率。當乙醇含量在60%時，花色苷含量達到最大值172.32 mg/100 g，當乙醇含量繼續(xù)增加，花色苷含量減少，可能是因為乙醇含量在70%時，親水性花色苷溶解度隨溶液極性降低而降低，同時乙醇含量增加導致與花色苷形成競爭的一些醇溶性雜質(zhì)以及親脂類物質(zhì)的溶出量增加[21]，影響花色苷的溶出，選取乙醇含量50%、60%、70%作為正交試驗的3個水平值。

圖5 不同乙醇含量對花色苷含量的影響

2.2.5 不同提取次數(shù)對花色苷提取的影響

由圖6可知，花色苷含量隨提取次數(shù)的增加先增加后減少，當花色苷提取次數(shù)由1次上升至2次時，花色苷提取量增加最快并達到168.18 mg/100 g，由2次上升至3次，花色苷為167.93 mg/100 g，但P值為0.952(P>0.05)，說明2次與3次顯著性差異不明顯。當提取次數(shù)繼續(xù)增加，花色苷含量減少，這可能是因為提取次數(shù)增加，花色苷與谷物中雜質(zhì)溶出均增加，并且提取次數(shù)增加導致花色苷光照時間延長，花色苷吸收光能后由激發(fā)態(tài)的花色苷通過C4位水解成C4加合物，其C2 位發(fā)生水解開環(huán)降解生成酚酸和醛類[22]，選取提取次數(shù)2，3，4次作為正交試驗的3個水平值。

圖6 不同提取次數(shù)對花色苷含量的影響

2.3 正交試驗結果分析

由表2極差分析可知RD>RC>RA>RB，因此花色苷提取工藝影響因素主次是乙醇含量>提取次數(shù)>氨基磺酸濃度>料液比，再由k值得出花色苷最佳提取工藝A1B1C1D2。由于極差分析法不能區(qū)分是由試驗水平的改變還是誤差導致的結果差異，因此需進行可彌補此缺陷的方差分析。

表2 正交試驗和極差分析結果

由表3方差分析結果可知，氨基磺酸濃度對復合谷物花色苷的提取影響顯著(P<0.05)，而提取次數(shù)和乙醇含量呈極顯著(P<0.01)。由于FD>FC>FA>FB，4個因素對花色苷提取量影響的大小順序為：乙醇含量>提取次數(shù)>氨基磺酸濃度>料液比，與表2中的極差分析結果一致。根據(jù)極差和方差分析得出理論最佳提取工藝為A1B1C1D2，即：氨基磺酸濃度0.05%，料液比為1∶50(g/mL)，提取次數(shù)為2次，乙醇含量為60%，根據(jù)此研究工藝進行3次驗證試驗，可得復合谷物花色苷含量為178.21 mg/100 g，黑糯米、血糯米、黑糯玉米中花色苷含量分別為139.46，278.09，6.98 mg/100 g，黑糯玉米花色苷含量極低可能與脫皮有關。

表3 方差分析結果

2.4 高效液相色譜法檢測矢車菊素-3-O葡萄糖苷

2.4.1 檢測條件

根據(jù)NY/T 3164-2017《黑米花色苷的測定高效液相色譜法》的檢測方法進行樣品前處理，對黑糯米、血糯米、黑糯玉米的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量進行測定，研究不同品種黑色谷物中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷與花色苷含量的關系。試驗條件：色譜柱：ZORBAX SB-C18 (4.6 mm×150 mm，5.0 μm)；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；運行時間：20 min；檢測波長：520 nm；流動相A：0.5%甲酸水，流動相B：0.5%甲酸甲醇，液相色譜梯度洗脫條件見表4。

表4 梯度洗脫表

2.4.2 檢測結果分析

根據(jù)OriginPro 2017對不同谷物的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷進行液相色譜繪圖分析，見圖7。

圖7 谷物中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷色譜圖

由圖7可知，不同基質(zhì)的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷在同一檢測條件下均有較好的峰形，并且目標物在520 nm與280 nm附近均為最高峰，與對照品光譜圖一致，計算可得：黑糯米中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷為116.69 mg/100 g，血糯米為212.56 mg/100 g，黑糯玉米為4.71 mg/100 g。

3 結論

在單因素試驗的基礎上用正交法對復合谷物花色苷提取工藝進行優(yōu)化，證明了氨基磺酸作為酸試劑的可靠性，并獲得最佳提取工藝為：氨基磺酸濃度為0.05%，料液比為1∶50(g/mL)，提取次數(shù)為2次，乙醇含量(體積比)為60%，提取時間為10 min，在此條件下進行試驗，測得復合谷物花色苷為178.21 mg/100 g，黑糯米為139.46 mg/100 g，血糯米為278.09 mg/100 g，黑糯玉米為6.98 mg/100 g。通過高效液相色譜法對不同谷物中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷進行分析，測得黑糯米為116.69 mg/100 g，血糯米為212.56 mg/100 g，黑糯玉米為4.71 mg/100 g，占黑糯米、血糯米、黑糯玉米花色苷的83.82%、76.44%、67.48%。該研究結果為復合基質(zhì)及衍生產(chǎn)品中天然色素的檢測提供了一種新型酸試劑及提取方案。