徐成辰，呂 霞，楊淑嫻，吳 晗

(江蘇省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗測試中心，南京 210036)

甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑是近10多年來具有很強(qiáng)發(fā)展?jié)摿褪袌龌盍Φ囊活惖投?、高效、廣譜的內(nèi)吸性殺菌劑，對幾乎所有的作物真菌性病害有良好的活性，在世界殺菌劑市場中占據(jù)重要地位[1-2]。苯氧菌胺(metominostrobin)是日本鹽野義制藥公司開發(fā)的一種新穎甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，其主要通過抑制病原菌線粒體的電子傳遞而使菌體死亡，目前主要登記用于水稻、小麥、玉米、大豆、棉花、蕓豆等作物的多種病害例如水稻稻瘟病、稻紋枯病、黃瓜白粉病、瓜類灰霉病、瓜類等霜霉病的防治，尤其是對水稻稻瘟病的防治有特效[1]，表現(xiàn)出廣譜、高效、無交互抗性、低毒、低殘留等特點(diǎn)。

目前關(guān)于苯氧菌胺的研究，主要集中于其合成路線優(yōu)化[3]以及原藥與制劑國內(nèi)登記，但是尚無相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布和分析方法的研究報道。為了滿足企業(yè)生產(chǎn)質(zhì)控的需求，同時為市場監(jiān)管等工作做前期準(zhǔn)備，本文采用高效液相色譜技術(shù)建立了一種適用于苯氧菌胺原藥中有效成分定量分析的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

Agilent-1100型高效液相色譜儀配二極管陣列紫外檢測器及色譜工作站(美國安捷倫科技有限公司)；超純水制備系統(tǒng)(默克密理博公司)；AS3120B超聲清洗機(jī)(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；針筒過濾器，0.45 μm濾膜(默克密理博公司)。

1.2 試劑和溶液

乙腈，色譜純(德國Merck公司)；超純水；苯氧菌胺標(biāo)準(zhǔn)品，已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)含量≥99.9%(江蘇中旗科技股份有限公司)；苯氧菌胺原藥，已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)含量≥97.0% (江蘇中旗科技股份有限公司)。

1.3 色譜操作條件

色譜柱為Zorbax SB-C18不銹鋼色譜柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈+水=50+50 (體積比)；流動相流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為230 nm；進(jìn)樣體積為2 μL。在上述色譜條件下，苯氧菌胺的保留時間約為5.0 min。苯氧菌胺標(biāo)準(zhǔn)品、苯氧菌胺原藥的高效液相色譜圖分別見圖1、圖2。

圖1 苯氧菌胺標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖

圖2 苯氧菌胺原藥液相色譜圖

1.4 質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定步驟

1.4.1 配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液

準(zhǔn)確稱取苯氧菌胺標(biāo)準(zhǔn)品0.02 g (精確至0.000 01 g)，置于50 mL容量瓶中，添加45 mL乙腈，超聲振蕩5 min，使標(biāo)準(zhǔn)品完全溶解，冷卻恢復(fù)至室溫，用乙腈定容，搖勻。

1.4.2 配制原藥試樣溶液

準(zhǔn)確稱取含苯氧菌胺的試樣0.02 g (精確至0.000 01 g)，置于50 mL容量瓶中，添加4 5 mL乙腈，超聲振蕩5 min，使試樣完全溶解，冷卻恢復(fù)至室溫，用乙腈定容，搖勻并用0.45 μm過濾器過濾。

1.4.3 進(jìn)樣測定

按照以上操作條件，在儀器基線穩(wěn)定后，連續(xù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣，直至連續(xù)2針峰面積的變化小于1.2%后，以標(biāo)準(zhǔn)品溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的次序進(jìn)樣并分析計算。

1.4.4 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的計算

分別將連續(xù)測定2針試樣溶液及試樣前后標(biāo)準(zhǔn)品溶液的峰面積算平均值，并按以下算式計算苯氧菌胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X)。

式中：m1為苯氧菌胺標(biāo)準(zhǔn)品的稱樣質(zhì)量，g；m2為試樣的稱樣質(zhì)量，g；F1為標(biāo)準(zhǔn)品溶液的苯氧菌胺峰面積平均值；F2為試樣溶液的苯氧菌胺峰面積平均值；r為標(biāo)準(zhǔn)品中苯氧菌胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測波長的選擇

按1.4.1節(jié)配制苯氧菌胺標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，利用高效液相色譜儀的二極管陣列檢測器進(jìn)行紫外光譜掃描(190~400 nm)，所得苯氧菌胺的紫外吸收光譜圖見圖3。可見，苯氧菌胺在195 nm、230 nm處分別有紫外吸收峰值?？紤]檢測波長越大，容易產(chǎn)生紫外吸收的雜峰越少，故選擇230 nm作為檢測波長。

圖3 苯氧菌胺紫外吸收光譜圖

2.1.2 流動相的選擇

選用安捷倫Zorbax SB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱進(jìn)行分析，經(jīng)初步摸索比較常用流動相用有機(jī)溶劑，發(fā)現(xiàn)選擇乙腈/水體系，1.0 mL/min流速時，苯氧菌胺可以得到比較好的分離效果。以此為基礎(chǔ)，將不同比例的乙腈/水混合并分別試驗，當(dāng)有機(jī)相占比過大時，保留時間短，導(dǎo)致苯氧菌胺和雜質(zhì)峰分離不好；而當(dāng)有機(jī)相占比過小時，保留時間太長，影響峰形和檢測效率。根據(jù)苯氧菌胺和雜質(zhì)峰的出峰時間、分離效果、峰形以及峰純度進(jìn)行綜合考慮，當(dāng)使用乙腈+水=50+50 (體積比)時，苯氧菌胺色譜峰峰形及峰純度較好，且能兼顧雜質(zhì)分離度與分離效率，保留時間在5.0 min (圖1)。

2.2 特異性試驗

本試驗采用HPLC-DAD峰純度分析法來鑒別苯氧菌胺。分別配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液和試樣溶液按1.3節(jié)操作條件進(jìn)行峰純度測試。測定結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)品和原藥兩者中的有效成分峰純度均高于99%，無其他雜質(zhì)成分干擾，滿足定量分析的要求。峰純度色譜圖見圖4~圖5。

圖4 苯氧菌胺標(biāo)準(zhǔn)品HPLC-DAD峰純度色譜圖

圖5 苯氧菌胺原藥HPLC-DAD峰純度色譜圖

2.3 方法線性關(guān)系的測定

按照標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制方法制備5個不同濃度的苯氧菌胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并進(jìn)行線性測定。按1.3節(jié)操作條件，分別測定每個標(biāo)準(zhǔn)品溶液的苯氧菌胺峰面積，2次測定取平均值。以有效成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積平均值為縱坐標(biāo)繪制線性關(guān)系圖，見圖6。

圖6 苯氧菌胺的線性關(guān)系圖

從圖6可以發(fā)現(xiàn)，在191.81~1654.34 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，苯氧菌胺的質(zhì)量濃度與對應(yīng)的峰面積線性關(guān)系良好，其線性回歸方程為y=6.613 6x+180.14，相關(guān)系數(shù)為0.999 8，可以滿足定量分析的要求。

2.4 方法精密度的測定

按照試樣溶液的配制方法制備5個苯氧菌胺原藥的樣品溶液，在1.3節(jié)操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，按照標(biāo)準(zhǔn)品溶液、精密度溶液、精密度溶液、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的順序進(jìn)行精密度測定，結(jié)果見表1。

表1 苯氧菌胺原藥中苯氧菌胺精密度試驗結(jié)果

從表1可以看出，苯氧菌胺原藥中苯氧菌胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果的RSD為0.24%，而修改的Horwitz公式2(1-0.51ogC)×0.67=1.34，RSD測定結(jié)果遠(yuǎn)小于公式計算值，表明此分析方法的精密度測定結(jié)果能夠滿足定量分析的要求。

2.5 方法準(zhǔn)確度的測定

為了驗證方法的準(zhǔn)確度，進(jìn)行了有效成分的回收率試驗。稱取含0.01 g (精確至0.000 01 g)苯氧菌胺的苯氧菌胺原藥于50 mL容量瓶中，再加入苯氧菌胺標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g (精確至0.000 01 g)，按照試樣溶液的配制方法制備了5個有效成分準(zhǔn)確度溶液。在1.3節(jié)操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，按照標(biāo)準(zhǔn)品溶液、準(zhǔn)確度溶液、準(zhǔn)確度溶液、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的順序進(jìn)行測定，準(zhǔn)確度測定結(jié)果見表2。

表2 苯氧菌胺原藥的準(zhǔn)確度試驗結(jié)果

從表2可以看出，苯氧菌胺原藥中苯氧菌胺平均回收率為99.29%，說明有效成分分析方法準(zhǔn)確度較好，測定結(jié)果符合定量分析的要求。

3 結(jié) 論

本文采用高效液相色譜儀和紫外檢測器建立了一種測定苯氧菌胺含量的分析方法，采用Zorbax SB-C18色譜柱、流速為1.0 mL/min的乙腈/水等體積混合溶液為流動相，在檢測波長為230 nm下進(jìn)行分離測定。該方法具有操作簡便快速，線性關(guān)系良好，特異性、精密度、準(zhǔn)確度較高、有效成分分離效果良好等特點(diǎn)，可用于苯氧菌胺原藥常規(guī)分析和質(zhì)量控制。