馬紅青，肖 崢，史福霞

(上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，上海 201114)

溴敵隆(bromadionlone)和溴鼠靈(brodifacoum)是我國(guó)常用的2種水溶性抗凝血?dú)⑹笏帲蚱錅缡笮Ч?，?duì)人畜毒性低，近年來(lái)在我國(guó)得到認(rèn)同并普遍使用。該類老鼠藥的生產(chǎn)企業(yè)較多，若管理不到位，會(huì)造成生產(chǎn)區(qū)域及周邊環(huán)境的污染。因此，建立快速高效的檢測(cè)方法十分必要[1]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于抗凝血?dú)⑹笏幍姆治鰷y(cè)定方法主要有紫外分光光度法、氣相色譜法、薄層色譜法[2]、液相色譜法[3]、氣相色譜-質(zhì)譜法[4-6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS-MS)[7]等，尚未見(jiàn)報(bào)道用液相色譜法同時(shí)測(cè)定農(nóng)藥中的溴敵隆順?lè)串悩?gòu)體(分別為溴敵隆A和溴敵隆B)、溴鼠靈順?lè)串悩?gòu)體(分別為溴鼠靈A和溴鼠靈B)。本文通過(guò)對(duì)前處理?xiàng)l件和高效液相色譜條件的優(yōu)化，建立了農(nóng)藥產(chǎn)品中溴敵隆A、溴敵隆B、溴鼠靈A、溴鼠靈B的高效液相色譜檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1260型高效液相色譜儀配二極管陣列檢測(cè)器(DAD)(美國(guó)安捷倫)；BSA224S-CW型電子分析天平(梅特勒-托利多)；SK8210HP型超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；Milli-Q Reference型超純水機(jī)(密理博)，0.45 μm有機(jī)濾膜(上海安譜)。

溴敵隆、溴鼠靈標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)不小于98.0%，江蘇泛華進(jìn)出口有限公司提供)；甲醇、乙腈、二氯甲烷(色譜純，F(xiàn)isher)；磷酸(分析純，滬試)；試驗(yàn)用水為超純水；配制pH=3的磷酸水溶液[8]，作為液相色譜用流動(dòng)相B。甲醇與二氯甲烷混合溶劑：甲醇∶二氯甲烷=3∶2 (體積比)[9]。

1.2 液相色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，柱溫30 ℃；流動(dòng)相A為乙腈，B為pH=3的磷酸水溶液，流量為1.0 mL/min，梯度洗脫程序：A為60%，保持20 min；20.1 min，A由60%升至80%，保持10 min；25.1 min，A由80%降至60%。檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm (0~16 min)，254 nm (16.1~30 min)。進(jìn)樣量5 μL。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(5 000 mg/L)的配制：分別稱取0.05 g (精確至0.1 mg)溴敵隆和溴鼠靈于10 mL容量瓶中，溴敵隆用甲醇溶解定容，溴鼠靈用甲醇與二氯甲烷混合溶劑溶解定容，冷卻至室溫。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：用以上標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，以甲醇作為溶劑逐級(jí)稀釋，配制成濃度為5、10、20、50、100、500 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 試驗(yàn)方法

稱取農(nóng)藥試樣1.0 g (精確至0.1 mg)置于25 mL容量瓶中，加入甲醇約20 mL，超聲提取5 min，冷卻至室溫后，搖勻。用0.45 μm有機(jī)相過(guò)濾器過(guò)濾上清液，按液相色譜條件進(jìn)行測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)溶液同時(shí)按液相色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

用外標(biāo)法計(jì)算農(nóng)藥試樣中溴敵隆A、溴敵隆B、溴鼠靈A、溴鼠靈B的含量。

若被測(cè)物響應(yīng)值超過(guò)線性范圍，則減少稱樣量或稀釋樣品溶液，保證響應(yīng)值在線性范圍內(nèi)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 流動(dòng)相的選擇

考察了甲醇-水(pH=3的磷酸水溶液)、乙腈-水(pH=3的磷酸水溶液)流動(dòng)相體系，發(fā)現(xiàn)用甲醇-水(pH=3的磷酸水溶液)流動(dòng)相體系時(shí)，溴敵隆和溴鼠靈異構(gòu)體均不能分離，而用乙腈-水(pH=3的磷酸水溶液)流動(dòng)相體系時(shí)，溴鼠靈和溴敵隆異構(gòu)體均能有效分離。

同時(shí)優(yōu)化了乙腈-水(pH=3的磷酸水溶液)流動(dòng)相體系的流量和梯度洗脫程序，流動(dòng)相A為乙腈，B為pH=3的磷酸水溶液，流量為1.0 mL/min，梯度洗脫程序：A為60%，保持20 min；20.1 min，A由60%升至80%，保持10 min；25.1 min，A由80%降至60%。檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm (0~16 min)，254 nm (16.1~ 30 min)。0~16 min內(nèi)，檢測(cè)器波長(zhǎng)設(shè)為265 nm，16 min后檢測(cè)器波長(zhǎng)設(shè)為254 nm，從溴敵隆和溴鼠靈的紫外吸收光譜圖可見(jiàn)，265 nm和254 nm分別為溴敵隆和溴鼠靈的最大吸收波長(zhǎng)，確保目標(biāo)物為最大響應(yīng)。在以上洗脫條件下，目標(biāo)物均能完全有效分離，且峰形良好，溴敵隆A、溴敵隆B、溴鼠靈A、溴鼠靈B混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見(jiàn)圖1。

2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

對(duì)溴敵隆和溴鼠靈標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行紫外掃描，得到其相應(yīng)的吸收波長(zhǎng)與響應(yīng)值的紫外吸收光譜圖(圖2和圖3)。溴敵隆和溴鼠靈的最大吸收波長(zhǎng)均在265 nm處，因此檢測(cè)波長(zhǎng)選擇265 nm。

圖3 溴鼠靈紫外吸收光譜圖

2.2 方法的線性關(guān)系

分別對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.4節(jié)試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到溴敵隆A、溴敵隆B、溴鼠靈A、溴鼠靈B檢測(cè)的線性范圍均為5~500 mg/L。由于樣品前處理是將1.0 g試樣稀釋至25 mL，因此換算成樣品中各目標(biāo)物的含量應(yīng)為125~12 500 mg/kg。各有效成分質(zhì)量濃度與其響應(yīng)值之間表現(xiàn)出良好的線性相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)均大于0.999，見(jiàn)表1。

表1 分析方法的線性參數(shù)

2.3 方法的檢出限

將濃度約為5 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行重復(fù)測(cè)定10次，計(jì)算其信噪比的平均值，再根據(jù)定量限為10倍信噪音時(shí)被測(cè)物的濃度(CS/N=10)，檢出限為3倍信噪音時(shí)被測(cè)物的濃度(CS/N=3)。由于樣品前處理是將1.0 g試樣稀釋至25 mL，計(jì)算得到溴鼠靈A、溴鼠靈B、溴敵隆A、溴敵隆B的定量限和檢出限(表2)。

表2 分析方法的檢出限

2.4 方法的準(zhǔn)確度

對(duì)農(nóng)藥樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)。分別加入125、1 250、12 500 mg/kg共3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定7次，在上述色譜條件下計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表3?？梢?jiàn)，3個(gè)濃度水平下，方法的平均加標(biāo)回收率為93%~106%，說(shuō)明該方法回收率高，準(zhǔn)確度好。

表3 分析方法的回收率

2.5 方法的精密度

在上述色譜條件下對(duì)同一份農(nóng)藥樣品進(jìn)行7次獨(dú)立平行測(cè)定，以考察該方法的精密度，結(jié)果見(jiàn)表4?？梢?jiàn)，農(nóng)藥樣品中溴敵隆A、溴敵隆B、溴鼠靈A和溴鼠靈B的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.05、1.89、1.60、2.41，變異系數(shù)分別為0.08%、0.15%、0.13%、0.19%，說(shuō)明該方法的精密度良好。

表4 分析方法的重復(fù)性

3 結(jié) 論

本文采用高效液相色譜儀建立了同時(shí)測(cè)定農(nóng)藥產(chǎn)品中溴鼠靈順?lè)串悩?gòu)體，溴敵隆順?lè)串悩?gòu)體的方法。該檢測(cè)法前處理方法簡(jiǎn)便易行，線性范圍可達(dá)125~12 500 mg/kg、檢出限125 mg/kg、重復(fù)性良好，可適用于農(nóng)藥產(chǎn)品中溴鼠靈順?lè)串悩?gòu)體和溴敵隆順?lè)串悩?gòu)體的檢測(cè)分析與質(zhì)量控制。