殷玉娟 耿 惠 冀林華 崔 森 馬 婕

高原紅細(xì)胞增多癥(high altitude polycythemia,HAPC)主要表現(xiàn)為紅細(xì)胞過度增殖并最終出現(xiàn)心肺疾病,包括肺動脈高壓和心肺功能衰竭。隨著對HAPC的不斷深入了解，認(rèn)為高原人血液具有“濃、粘、聚、凝”的特點，其機(jī)制較復(fù)雜。研究表明缺血、缺氧可以上調(diào)某些基因的表達(dá)其中包括紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血栓素A2(thromboxane A2,TXA2)、轉(zhuǎn)錄因子、糖酵解酶和某些原癌基因等。本文就慢性缺氧性疾病HAPC患者中PDGF 、TXA2基因表達(dá)及其與血小板參數(shù)、凝血指標(biāo)的關(guān)系進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年12月至2019年12月青海大學(xué)附屬醫(yī)院確診為HAPC患者22例為觀察組，同期另選取長期居住于高海拔地區(qū)25例作為對照組。兩組研究對象均為男性，均有5年以上吸煙史，年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (

P

>0.05)。見表1。

表 1 兩組研究對象一般資料比較

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：HAPC標(biāo)準(zhǔn)符合 2004 年慢性高原病青海標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：骨髓增殖性疾病及腫瘤性疾病繼發(fā)者，繼發(fā)于心肺等疾病的其他繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥者，其他不符合研究的患者，及不愿配合者。本研究經(jīng)青海大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審查同意，所有患者及志愿者均已簽署書面同意書。

1.3 方法

1.3.1 血小板參數(shù)及凝血指標(biāo)的檢測 所有研究對象空腹抽取靜脈血2 mL置于乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)管中，應(yīng)用全自動血細(xì)胞分析儀(YZB/JAP,XN-10) 測定血常規(guī)，同期抽靜脈血2 mL 置于檸檬酸鈉管中，用全自動凝血功能儀(QuAHL-ox-060,CS-5100)測定凝血功能。

1.3.2 酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測PDGF 、TXA2 所有受檢者未治療前空腹抽取靜脈血4 mL于EDTA抗凝管中，離心 (716 g，30 min)，分別用PDGF、TXA2試劑盒(江蘇晶美生物科技有限公司)按說明書進(jìn)行測定標(biāo)本。

1.3.3 實時熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(quantitative real-time polynucleotide chain reactio,qPCR)PDGF、TXA2水平 所有受檢者未治療前采集靜脈血4 mL于EDTA抗凝管中，按TRIzol說明書，提取單個核細(xì)胞，按TRIzol試劑盒的說明書裂解培養(yǎng)后的細(xì)胞，提取總的核糖核酸。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸，用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系為，XYBR Green Master MixPCR條件為: 25 ℃ 5 min，50 ℃15 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min，共40個循環(huán)。引物：Homo PDGFB Forward CTTCCTGTCTCTCTGCTGCT Reverse CATGTTCAGGTCCAACTCGG PCR Products 172 bp；Homo TBXA2R ForwardCTGTCCTTCCTGCTGAACAC Reverse CACTGTCTGGGCGATGAAGA 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物為 180 bp，將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行掃描，并分析擴(kuò)增曲線。

1.4 觀察指標(biāo) 收集兩組研究對象一般資料，包括血常規(guī)、凝血指標(biāo)、PDGF、TXA2的數(shù)值。①比較兩組血小板指數(shù)和凝血指標(biāo)的變化；②比較兩組患者外周血PDGF、TXA2在基因及蛋白水平的表達(dá)；③分析PDGF、TXA2與凝血指標(biāo)、血小板參數(shù)的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對象血小板參數(shù)比較 HAPC組患者平均血小板體積(mean platelet volume,MPV)值、血紅蛋白(hemoglobin,HGB)高于對照組，血小板計數(shù)(platelet count,PLT)、血小板壓積(platelet hematocrit,PCT)值低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。見表2。

表2 兩組研究對象血小板參數(shù)比較

2.2 兩組研究對象凝血指標(biāo)比較 HAPC組患者纖維蛋白降解產(chǎn)物(fibrinogen degradation produc,FDP)較對照組延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)，凝血酶原時間(prothrombin time,PT)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time,APTT)、D-二聚體(D - dimer,DD)、纖維蛋白原(fibrinogen,FIB)、凝血酶時間(thrombin time,TT)與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

>0.05)。見表3。2.3 兩組研究對象外周血單個核細(xì)胞及血漿PDGF、TXA2水平比較 Elisa法檢測HAPC組患者中PDGF、TXA2的表達(dá)高于對照組(

P

<0.05)；qPCR法檢測HAPC組患者中PDGF、TXA2的表達(dá)也高于對照組(

P

<0.05)。見表4。

表3 兩組研究對象凝血指數(shù)比較

表4 兩組研究對象FDGF、TXA2 水平比較

2.4 HAPC組患者血漿PDGF、TXA2水平和血小板參數(shù)、凝血指標(biāo)的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，PDGF水平與PLT、MPV、PT、APTT、FDP、DD之間無相關(guān)性(

P

>0.05)，TXA2水平與PLT、MPV、PT、APTT、FDP、DD之間無相關(guān)性(

P

>0.05)。見表5。

表 5 HAPC患者PDGF、TXA2與血小板參數(shù)、凝血指標(biāo)的相關(guān)性分析(n=22)

3 討論

HAPC是久居高原的少數(shù)個體對高海拔環(huán)境失去習(xí)服而發(fā)生的一種疾病，主要原因系長期低壓缺氧，缺氧可致機(jī)體的紅細(xì)胞過度增殖、血液黏稠度增大、血流阻力的增加、血管的擴(kuò)張和紅細(xì)胞的聚集，甚至形成微血栓。研究顯示缺氧性腦卒中在臨床腦血管疾病中較為常見,高海拔相關(guān)死亡后尸檢發(fā)現(xiàn)肺動脈和腦靜脈有血栓形成。血栓的形成一般是血管內(nèi)皮損傷，血液成分的改變及血流的改變，HAPC患者氧飽和度可從基線下降多達(dá)10%，增加了內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血管通透性和凝血級聯(lián)活動，出現(xiàn)高凝，導(dǎo)致血栓性疾病，進(jìn)而激活內(nèi)外源性的凝血途徑，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)病理性變化，因此，應(yīng)積極采取措施降低紅細(xì)胞和HGB水平，避免機(jī)體發(fā)生心腦血管疾病、HAPC，提前給予干預(yù)，對改善HAPC的預(yù)后具有重要的臨床意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，PDGF在HAPC組較高原健康組表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)，與顏金花等研究結(jié)果一致。PDGF主要在血小板中存儲，并在激活時釋放。研究顯示成年鼠腦缺血/缺氧模型中 PDGF受體表達(dá)上調(diào)。在多種病理狀況下，如癌癥、動脈粥樣硬化中，PDGF有一定的作用。低氧低壓是HAPC患者的病理特征之一，同腫瘤、癌癥等局部缺氧性疾病一樣，全身性缺氧性疾病也可通過缺氧誘導(dǎo)因子1促使基因高表達(dá)。大多數(shù)機(jī)體對低氧環(huán)境能代償性適應(yīng)，但長期慢性缺氧、反復(fù)感染、極度低氧(海拔≥4 500 m )這些因素會反復(fù)刺激血管內(nèi)膜，PDGF合成和分泌增加導(dǎo)致機(jī)體高凝最終出現(xiàn)血栓性疾病。本研究中，TXA2水平在HAPC組較對照組表達(dá)升高(

P

<0.05)。有報道TXA2參與了急性低壓缺氧時腦血流量的調(diào)節(jié)，TXA2的主要功能為血小板聚集和平滑肌收縮。慢性缺氧情況下，機(jī)體凝血、抗凝血及纖溶系統(tǒng)的平衡被破壞，進(jìn)一步激活血小板，釋放可溶性介質(zhì)如二磷酸腺苷、TxA2等，TXA2在調(diào)節(jié)白細(xì)胞生存、凋亡及活化等功能中具有重要作用，導(dǎo)致血管收縮，TXA2是體內(nèi)形成血栓的重要因素, 在缺氧條件下,氧自由基形成增多, 清除自由基相關(guān)酶活性降低,最終導(dǎo)致 HAPC 多器官功能損害及血栓的形成。

本研究還顯示，HAPC組PLT減少、MPV變大、PCT下降改變，F(xiàn)DP 延長，表明HAPC患者有凝血的異常，MPV是一個常用的反映血小板活性高低的生物學(xué)指標(biāo)，血小板體積越大，意味著表面積越大，表明包含的致密顆粒越多，可以釋放更高水平的P-選擇素、TXA2，表達(dá)更多的血小板膜糖蛋白，有更強(qiáng)的形成血栓的潛能。但本研究中相關(guān)性分析并未見明顯關(guān)聯(lián)，考慮在患者尚未發(fā)生明顯血栓之前無關(guān)聯(lián)，疾病是個動態(tài)過程，所以應(yīng)進(jìn)一步在追蹤研究血栓發(fā)生過程中觀察相關(guān)性。

綜上所述，高原低氧誘導(dǎo)血小板活化，而活化的血小板可以分泌一些活性物質(zhì)如PDGF、TXA2，這些物質(zhì)有可能參與HAPC患者的高凝、血栓前病變的發(fā)生和發(fā)展，為今后的治療與預(yù)防提供了新的思路。本研究中，常規(guī)的血小板參數(shù)、凝血指標(biāo)并不能反映HAPC患者血栓前的狀態(tài)，在臨床工作中應(yīng)重視HAPC患者血栓前的變化。多個指標(biāo)如PDGF、TXA2等的聯(lián)合檢測，積極尋找血栓前狀態(tài)檢測的標(biāo)志物，預(yù)測HAPC患者血栓形成的風(fēng)險，早期干預(yù) HAPC患者的血液高凝狀態(tài)。