李 璐 陳靜靜

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是消化道惡性腫瘤之一,作為原發(fā)性肝癌最常見的類型，具有較高的發(fā)病率及死亡率，給全球公共衛(wèi)生系統(tǒng)帶來極大負擔(dān)。在我國，HCC的主要病因包括慢性乙型肝炎病毒感染，丙型肝炎病毒感染及黃曲霉素中毒等。流行病學(xué)資料表明，我國原發(fā)性肝癌的發(fā)病率以及死亡率呈逐年增長的態(tài)勢。近年關(guān)于HCC的早期診斷與治療已取得極大進展，但其總體預(yù)后仍較差。高侵蝕性與遠處轉(zhuǎn)移是HCC的主要特征，亦是導(dǎo)致HCC不良預(yù)后的首要原因。以往研究表明，癌細胞的遷移與定植均與腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironments, TME)相關(guān)。在HCC中，腫瘤細胞與炎癥細胞均會產(chǎn)生大量的CXCL8。CXCL8可作用于CXCR1/2信號軸，上調(diào)趨化因子受體CXCR1與CXCR2的表達，后者將會導(dǎo)致PI3K/AKT、MAPK/ERK的磷酸化蛋白與非磷酸化蛋白比例發(fā)生改變，進而促進HCC腫瘤細胞的增殖、活化、侵襲等事件的發(fā)生。因此，抑制CXCL8與其受體CXCR1/2的結(jié)合是一種潛在的HCC免疫治療手段。G31P是一種由人白細胞介素-8(interleukin-8,IL-8)通過特定位點定向突變所產(chǎn)生的重組化合物，相較于CXCL8，前者對于CXCR1/2受體的選擇性結(jié)合能力更強。已有研究表明，G31P可有效延緩小鼠體內(nèi)前列腺腫瘤組織的生長速度,同時通過抑制癌細胞增殖與組織血管的生成，從而降低腫瘤轉(zhuǎn)移的概率。此外, G31P還可通過降低中性粒細胞的聚集而減輕小鼠肺部的炎癥反應(yīng)及內(nèi)毒素血癥。但關(guān)于G31P在HCC治療方面的文章鮮有報道。本研究基于原發(fā)性肝癌患者的癌組織及癌旁組織標(biāo)本，探尋CXCL8和CXCR1/2在HCC發(fā)生中的潛在機制，及其與患者臨床、病理特征之間的相關(guān)性；同時利用人肝癌細胞系Hep-G2進一步探究不同濃度的G31P對于肝癌細胞生物學(xué)特性的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年12月至2020年12月在安徽醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院普外科和腫瘤科接受部分肝切除手術(shù)的50例HCC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者在肝臟手術(shù)前均未接受化療或放療, 經(jīng)手術(shù)病理等檢查確診為HCC，入選病例病理分級均符合2015年原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南 。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除患有其他器官或組織惡性腫瘤患者，以及已接受放化療的患者。50例肝癌患者中男性35 例，女性15例，年齡32～76 歲，平均(67.25±6.12)歲。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(Union for International Cancer Control，UICC)最新版肝癌TNM臨床分期，將患者分為Ⅰ期12 例，Ⅱ期8 例，Ⅲ期16 例，Ⅳ期14 例。本研究獲得安徽醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院倫理委員會同意，且患者及家屬已對治療方案簽署知情同意書。

1.2 相關(guān)試劑及主要實驗設(shè)備 RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco BRL公司)；胎牛血清(中國四季青有限公司)；細胞外基質(zhì)(extracellular matrix ，ECM)黏附實驗；細胞增殖實驗(CCK-8)試劑盒(美國Sigma有限公司)；8-μm孔徑Transwell 試劑盒(美國Coster公司)；HCC細胞株Hep-G2(上海福祥公司)；鼠源單克隆抗體CXCR1、CXCR2、CXCL8、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK、Cyclin D1、Bcl-2、VEGF與MMP-9(圣克魯斯生物技術(shù)公司)；山羊抗鼠IgG二抗體(美國 Pierce公司)；石蠟切片機(北京軒泰儀公司)；酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司)；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(德國Thermo公司)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化染色及結(jié)果分析 收集患者新鮮腫瘤組織及其相應(yīng)正常癌旁組織，用4%的多聚甲醛固定后石蠟包埋，切片，厚度3～4 μm。采用免疫組化SP法檢測切片組織中CXCR1、CXCR2、CXCL8、p-AKT、p-ERK、Cyclin D1、Bcl-2、VEGF與MMP-9的表達，具體操作方法按照試劑說明書進行。在倒置相差顯微鏡下觀察染色切片，每個切片隨機選擇5個高倍鏡視野(×400)，每個視野下計數(shù)100個腫瘤細胞或癌旁細胞， 根據(jù)陽性細胞在全部組織細胞中所占比例以及陽性細胞染色強度判定實驗結(jié)果。A：按顯色細胞數(shù)記分，陽性細胞數(shù)<1/3為1分，陽性細胞數(shù)1/3～2/3為2分，陽性細胞數(shù)≥2/3為3分。 B：按細胞顯色深淺記分，無陽性反應(yīng)細胞為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。積分?jǐn)?shù)=A×B。免疫組化實驗結(jié)果的判定方法：積分?jǐn)?shù)0～1分視為陰性(-)，2～4分為弱陽性(+)，≥5分為強陽性(++)。其中(-)定義為蛋白陰性，(+～++)定義蛋白陽性。

1.3.2 CCK-8實驗 取處于對數(shù)生長期的Hep-G2細胞，接種于96孔板(5×10/孔)中。同時為了防止介質(zhì)蒸發(fā)，在樣品孔周圍每孔加入100 μL PBS 。隨后分別加入0、10、50 ng/mL的 G31P，每個濃度重復(fù)5孔，于37℃、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后再加入10 μL的 CCK-8繼續(xù)培養(yǎng)3 h，其中0 ng/mL組設(shè)為對照組。最后將96孔板置于酶標(biāo)儀中于波長450 nm處測吸光度值(A)，并計算細胞生長抑制率(cellular proliferation inhibition rate，CPIR)。 CPIR的計算公式如下: CPIR=(1-G31p 組平均吸光度值 /對照組平均吸光度值)×100%。

1.3.3 ECM黏附實驗 取20 μL濃度為250 μg/mL 的ECM和30 μL的RPMI-1640細胞培養(yǎng)液加入96孔板中，充分混勻，風(fēng)干過夜，在每孔中再加入100 μL1%BSA,在37℃、5%CO培養(yǎng)箱中放置1 h后，用PBS輕輕清洗每孔3次，待用。 分別將0、10、50 ng/mL 濃度的 G31P預(yù)處理的Hep-G2細胞加入到96孔板中，37℃、5%CO培養(yǎng)箱中放置1 h后，用0.01 mmol/L的PBS輕輕清洗每孔3次，每孔再加入RPMI-1640細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4 h。最后用酶標(biāo)儀檢測吸光度值，計算細胞相對黏附率(%)。公式為：細胞相對黏附率= G31p組平均a值/對照組平均a值×100%。

1.3.4 Transwell侵襲實驗 將不同濃度(0、10、50 ng/mL)G31P預(yù)處理后的，處于對數(shù)生長期的Hep-G2細胞放置于37℃，5% CO培養(yǎng)箱中24 h后，用0.05%的胰蛋白酶消化，收集細胞。將含有2×10細胞個數(shù)的30 μL懸液置于Transwell小室內(nèi)，并在24 孔板中加入含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基600 μL，最后將Transwell小室放入 24 孔板中，靜置 5 min。常規(guī)培養(yǎng)12 h，取出小室用棉簽擦去上室內(nèi)面未穿膜的細胞，并用95%的酒精固定15 min，PBS沖洗兩次后晾干。隨后曙紅染色20 min，PBS沖洗兩次，倒扣于濾紙上晾干。在低倍顯微鏡下觀察(×40倍)5個隨機視野中計數(shù)入侵細胞。

1.4 觀察指標(biāo) ①觀察并比較肝癌組織及癌旁組織中CXCR1、CXCR2及CXCL8的陽性表達率。②記錄并分析CXCR1、CXCR2及CXCL8在肝癌不同臨床病理特征中的表達情況。③采用Spearman相關(guān)分析探討CXCR1,CXCR2,CXCL8與pAKT，pERK，CyclinD1，Bcl-2，VEGF及MMP-9表達相關(guān)性。④觀察并比較采用0、10、50 ng/mL G31P處理肝癌細胞Hep-G2，CCK-8法、ECM實驗以及Transwell小室侵襲實驗結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織及癌旁組織中CXCR1、CXCR2及CXCL8的表達比較 50例肝癌組織免疫組化結(jié)果顯示，CXCR1陽性表達率為76.0% (38/50) ，CXCR2陽性表達率為82.0% (41/50) ，CXCL8陽性表達率為50.0% (25/50)。肝癌組織相應(yīng)正常癌旁組織中 CXCR1、 CXCR2和 CXCL8的陽性表達率分別為14.0%(7/50)、18.0%(9/50)和20.0%(10/50)。肝癌組織中CXCR1,CXCR2和CXCL8的陽性表達率高于相應(yīng)正常癌旁組織(

χ

=10.158、12.374、16.115，

P

均<0.05)。見圖1。

注：A至C圖分別表示CXCR1、CXCR2 及CXCL8蛋白在癌旁組織中的表達; D至F圖分別表示CXCR1、CXCR2 及 CXCL8蛋白在肝癌組織中的表達。

2.2 CXCR1、CXCR2及CXCL8在肝癌不同臨床病理特征中的表達情況 不同肝癌TNM分期，CXCR1、CXCR2及CXCL8表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

< 0.05)；不同性別、年齡和癌細胞分化程度間CXCR1、CXCR2及CXCL8表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

>0.05)。見表1。2.3 CXCR1、CXCR2、CXCL8與pAKT、pERK，CyclinD1、Bcl-2、VEGF及MMP-9表達的相關(guān)性 通過Spearman相關(guān)分析，分析CXCR1,CXCR2,CXCL8與磷酸化(pAKT、pERK)、生長和凋亡(CyclinD1、Bcl-2)、血管生成(VEGF)、侵襲和轉(zhuǎn)移(MMP-9)指標(biāo)間的相關(guān)性。結(jié)果表明，CXCR1、CXCR2及CXCL8與 pAKT、 pERK 、 CyclinD1、 Bcl-2、 MMP-9的表達呈正相關(guān)(

P

< 0.05)，但其與VEGF的表達無相關(guān)性(

P

>0.05)。見表2。

表1 CXCR1、CXCR2及CXCL8在肝癌不同臨床病理特征的表達情況(例)

表2 CXCR1、CXCR2、CXCL8與pAKT，pERK，CyclinD1，Bcl-2，VEGF及MMP-9表達相關(guān)性分析

2.4 不同濃度G31P作用下Hep-G2肝癌細胞增殖情況比較 與0 ng/mL組以及10 ng/mL組相比，50 ng/mL組吸光度值和細胞數(shù)量明顯減少(

P

< 0.05)。見表3。

表3 不同濃度G31P作用下Hep-G2肝癌細胞增殖情況比較(OD值，

2.5 不同濃度G31P作用下Hep-G2肝癌細胞黏附能力情況比較 ECM黏附實驗結(jié)果顯示，0 ng/mLG31P組的細胞黏附率為(100.00±4.98)%，10 ng/mL和50 ng/mL 組的細胞黏附率分別為(71.08±2.64)%和(30.45±4.54)%。與0 ng/mL組相比，10 ng/mL組和50 ng/mL組細胞黏附率明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

F

=8.119,

P

<0.05)。2.6 不同濃度G31P作用下Hep-G2肝癌細胞侵襲能力情況比較 Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示， 0 ng/mLG31P組穿膜細胞數(shù)為(48±4)個；10 ng/mL G31P組的穿膜細胞數(shù)為(47±3)個；50 ng/mL G31P組的穿膜細胞數(shù)為(22±2)個。與0 ng/mL及10 ng/mL組相比，50 ng/mL G31P組穿膜細胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

F

=10.237,

P

<0.05)。

3 討論

原發(fā)性肝癌是世界上最常見的嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一。CXCL8是一種重要的多功能趨化因子，可以誘導(dǎo)血管形成趨化、鈣離子流、細胞增殖、運動等多種作用。 CXCR1是一類重要的非受控炎癥因子。CXCR1、CXCR2和 CXCL8相互作用，CXCL8的生物學(xué)效應(yīng)通過 CXCL8與 CXCR1/2的結(jié)合而介導(dǎo)的。CXCL8被認(rèn)為是屬于CXC家族的典型趨化因子，負責(zé)將嗜中性粒細胞和粒細胞募集和激活至炎癥部位。本研究結(jié)果顯示50例HCC患者的腫瘤組織中 CXCR1、CXCR2和 CXCL8的陽性率明顯高于相應(yīng)正常癌旁組織(

P

<0.05)，且不同肝癌TNM分期，CXCR1、CXCR2及CXCL8表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

< 0.05)，相關(guān)分析顯示CXCR1、CXCR2和 CXCL8表達與 pAKT、pERK、CyclinD1、Bcl-2、MMP-9的表達正相關(guān)(

P

均<0.05)。結(jié)果表明，CXCL8及其同源受體，CXCR1和CXCR2與促進腫瘤侵襲、增殖、轉(zhuǎn)移和進展及化療藥物耐藥密切相關(guān)。

G31P是一種重組的人CXCR1/2拮抗劑，作為CXCL8衍生物不具有趨化活性。G31P可以通過基因點突變方法構(gòu)建得到，并能與IL-8競爭結(jié)合其受體CXCR1/2導(dǎo)致IL-8生物學(xué)活性喪失，從而阻斷中性粒細胞的趨化及其引起的非特異性免疫應(yīng)答。有研究證實，在肺癌原位移植小鼠模型中，G31P能夠抑制腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和血管生成。分子水平上，G31P處理導(dǎo)致VEGF和NF-κB-p65表達降低、ERK1/2和AKT磷酸化減少。G31P通過阻斷CXCR1和CXCR2可以抑制人肺癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移。G31P聯(lián)合順鉑能顯著抑制H22小鼠HCC細胞的增殖，既可增強順鉑治療腫瘤的療效，又減少其對急性腎功能衰竭的毒副作用。由于G31P與CXCR1/2受體選擇性結(jié)合能力已被證實，在此基礎(chǔ)上筆者通過體外細胞學(xué)實驗驗證G31P對肝細胞癌的潛在治療價值。本研究中，人Hep-G2細胞中單用G31P并觀察其對肝癌細胞增殖、黏附以及轉(zhuǎn)移的影響，先前的研究主要集中在G31P對炎癥信號通路激活的影響，本研究采用CCK-8法、ECM基質(zhì)黏附實驗以及Transwell小室侵襲實驗重點探討G31P對Hep-G2細胞生長和凋亡，血管生成及侵襲和轉(zhuǎn)移作用。結(jié)果顯示G31P在50 ng/mL濃度時可以明顯抑制肝癌細胞Hep-G2的增殖、黏附以及侵襲作用，進一步說明G31P在體外可能通過競爭性結(jié)合CXCR1/2抑制CXCR1/2- CXCL8通路發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上所述，HCC中CXCR1/2和CXCL8的表達明顯增加，且體外實驗表明CXCR1/2受體阻斷劑G31P可以明顯抑制Hep-G2的增殖、黏附以及侵襲。研究靶向阻斷 CXCR1/2后肝癌細胞生物學(xué)行為的變化及其機制，為肝癌的治療提供可能的靶點。