肖 飛 任佳秀 莊星星 江彬彬 李 萌 倪受東 苗仁華

伏立康唑是新型的二代三唑類抗真菌藥物，具有抗菌效力強，口服吸收好等特點，是臨床用于侵襲性真菌重癥感染的一線藥物。伏立康唑治療效果受遺傳因素和非遺傳因素的影響，遺傳因素主要是CYP2C19基因多態(tài)性對其肝臟CYP450代謝酶活性的的影響，進而影響伏立康唑的藥代動力學；臨床非遺傳因素包括患者肝腎功能、病理生理狀態(tài)、飲食和聯(lián)合用藥等的影響。穩(wěn)態(tài)谷濃度是評價伏立康唑體內暴露劑量的常用指標，與臨床療效及不良反應密切相關；但是伏立康唑呈現(xiàn)非線性藥代動力學特征，具有治療窗窄、個體差異大以及不良反應頻繁的特征。因此，探討伏立康唑個體差異的影響因素，對于伏立康唑的個體化指導具有十分重要的臨床意義。本研究在文獻研究和前期實驗的基礎上建立了熒光原位雜交技術檢測CYP2C19基因多態(tài)性以及酶聯(lián)免疫放大法測定伏立康唑血藥濃度，為伏立康唑臨床個體化用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器 Fluotec 48E微量熒光檢測儀(西安天隆科技有限公司)；Viva-E全自動生化分析儀(德國西門子公司)；熒光檢測儀V2.0.711工作站；BT25S電子天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司]；TGL16E高速離心機(長沙英泰儀器有限公司)。

1.2 實驗試劑 核酸純化試劑(10 mL/瓶，北京華夏時代基因科技發(fā)展有限公司，批號：202011006)；測序反應通用試劑盒(北京華夏時代基因科技發(fā)展有限公司，批號：20210218)伏立康唑測定試劑盒(珠海麗珠試劑股份有限公司，批號：20190401)；伏立康唑校準品(珠海麗珠試劑股份有限公司，批號：20190401)；伏立康唑質控品(珠海麗珠試劑股份有限公司，批號：20190401)。伏立康唑對照品(中國食品藥品檢定研究院，每支100 mg，純度：99.8%，批號：100862-201903)空白血清(上海斯信生物科技有限公司，批號為MR16118)。

1.3 研究對象 選擇2020年6月至2021年6月在安徽醫(yī)科大學附屬巢湖醫(yī)院血液內科接受伏立康唑治療或預防侵襲性真菌感染的血液相關疾病患者。患者在使用伏立康唑前或者伏立康唑后檢測CYP2C19基因多態(tài)性；口服伏立康唑3 d或者注射劑5劑給藥后視為血藥濃度達到穩(wěn)態(tài)，測量血清初始穩(wěn)態(tài)血藥濃度。排除嚴重肝功能異?；颊?ALT、AST≥正常值上限3倍或嚴重腎功能損害患者(Ccr≤30 mL/min)。

1.4 伏立康唑藥物基因檢測方法 熒光原位雜交技術檢測

CYP

2

C

19*2、

CYP

2

C

19*3以及

CYP

2

C

19*17基因多態(tài)性。血樣處理方法：氯化銨溶液(10×NHCl)與滅菌水按 1∶9比例稀釋為工作液；在1.5 mL離心管中先后加入1.0 mL NHCl工作液和100 μL抗凝血，顛倒混勻，室溫靜置5 min后，3 000 r/min離心5 min；棄掉上清，離心管的底部可觀察到白色米粒大小的白細胞沉淀；加入1.0 mL NHCl工作液，輕輕吹打白細胞使之懸浮，3 000 r/min離心5 min，棄上清；沉淀加入50 μL核酸純化試劑，吹打混勻，室溫靜置30 min；取2 μL處理后的白細胞樣本加入測序反應通用試劑，震蕩混勻，上機檢測。每個測序反應通用試劑盒初次使用時，需檢測試劑盒內3種基因型的軟件參數(shù)設定液，用以修正參數(shù)，確保結果準確。

1.5 伏立康唑血藥濃度監(jiān)測方法 酶聯(lián)免疫放大法測定伏立康唑血藥濃度，接收的血液樣本，3 000 r/min離心10 min，按照Viva-E全自動生化分析儀操作規(guī)范、伏立康唑測定試劑盒和伏立康唑質控品說明書，測定血藥濃度。

隨樣本監(jiān)測伏立康唑高、中、低濃度質控品的結果，根據(jù)Westgard室內質控規(guī)則，以連續(xù)3或1判定系統(tǒng)是否失控；如失控重新建立標準曲線。

2 結果

2.1 線性關系考察 按照Viva-E全自動生化分析儀操作規(guī)范、伏立康唑測定試劑盒和伏立康唑質控品說明書，將伏立康唑校準品(校準濃度 0、0.5、1.5、4.0、8.0、16.0 μg/mL)分別測定1次，建立標準曲線：

其中

R

=2.621 9；

K

=2.069 13；a=-8.928 6；b=6.190 42。測量范圍0.5～16.0 μg/mL。

2.2 精密度試驗 精密稱取伏立康唑對照品適量，用空白血清制備濃度分別為1.0 、5.0和10.0 μg/mL的質控樣品6份。按“2.2項”方法進行上機檢測。按照《中華人民共和國藥典(2020版)》關于生物樣品分析方法的要求對實驗樣本進行日內精密度和日間精密度考察，結果顯示，日內精密度和日間相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)均低于10%，符合要求。

2.3 穩(wěn)定性試驗 精密稱取伏立康唑對照品適量，用空白血清制備濃度分別為1.0 、5.0和10.0 μg/mL的質控樣品6份。室溫放置12 h，按“2.2項”方法進行上機檢測。結果顯示，6次檢測結果的RSD值均<10%，提示樣品在室溫條件下12 h內穩(wěn)定性良好。

2.4 回收率試驗 精密稱取伏立康唑對照品適量，用空白血清制備濃度分別為1.0 、5.0和10.0 μg/mL的質控樣品6份。按“2.2項”方法進行上機檢測，監(jiān)測濃度除以標識濃度乘以100%，計算提取回收率。見表1。

表1 方法學考察結果(n=6)

2.5 個體化用藥分析 伏立康唑主要經肝臟CYP2C19代謝。CYP2C19基因存在多態(tài)性，其酶有4種不同的代謝類型：快代謝型(RM，*1

/

*1)，超快代謝型(UM，*1

/

*17，*17

/

*17)，中間代謝型(IM，*1

/

*2，*1

/

*3，*17

/

*2，*17

/

*3)，慢代謝型(PM，*2

/

*2，*2

/

*3，*3

/

*3)。本研究的10例患者的CYP2C19基因多態(tài)性檢測結果為快代謝型3例、中間代謝型5例和慢代謝型2例；根據(jù)患者代謝型制定或調整給藥劑量，本研究10例患者有7例患者的血藥濃度在有效范圍內，另外3例患者的血藥濃度值也接近有效范圍，且無不良反應出現(xiàn)，臨床醫(yī)生會實時調整劑量，并持續(xù)檢測血藥濃度，使得血藥濃度均在推薦范圍內(0.5～5.0 μg/mL)。見表2。

表2 10例患者的伏立康唑藥物基因檢測與血藥濃度監(jiān)測結果

3 討論

3.1 基因型檢測方法和結果分析 本實驗采用的熒光原位雜交技術是一種重要的非放射性原位雜交技術，利用報告分子與熒光素標記的特異親和素之間的免疫化學反應，經熒光檢測體系在鏡下對待DNA進行定性、定量或相對定位分析。熒光原位雜交技術開發(fā)于30 多年前，是細胞遺傳學研究中最具范式改變的技術，具有快速、準確、原位等諸多優(yōu)點，故目前已成為藥學、遺傳學、微生物生態(tài)學各個領域研究中強有力的工具。本實驗采用的方法技術成熟可靠，儀器設備和試劑均合格，出具檢測報告真實且及時，美中不足的是實驗程序單次運行時間較長，為保證實驗的正常運作，需要操作人員實時監(jiān)管。

CYP2C19的基因多態(tài)性是導致伏立康唑體內代謝個體間差異的主要影響因素。在本研究中的10例患者，其中快代謝型3例，中間代謝型5例和慢代謝型2例。在亞洲人群中CYP2C19弱代謝者發(fā)生率則高達15%～20%，而弱代謝者伏立康唑的血藥濃度比較強代謝者高約4倍。根據(jù)臨床藥物基因組學實施聯(lián)盟發(fā)布的指南，CYP2C19基因檢測可以避免伏立康唑高濃度所致的不良反應，該指南不推薦慢代謝型的患者使用伏立康唑；若必須使用，應當?shù)陀谂R床治療的標準劑量進行治療，同時嚴密監(jiān)測血藥濃度，以減少伏立康唑血藥濃度過高而引起的不良反應；對于超快代謝型患者應當選擇不依賴 CYP2C19代謝的其他抗真菌藥；對快和中代謝的患者使用標準劑量進行治療。如其中1號患者的CYP2C19基因多態(tài)性檢測顯示為慢代謝型，伏立康唑給藥劑量為0.2 g，每天1次時，血藥濃度為0.01 μg/mL，低于推薦治療范圍；后期調整治療方案0.2 g，每天2次時，血藥濃度升高至0.85 μg/mL，臨床療效明顯提高。4號患者的CYP2C19基因多態(tài)性檢測顯示為慢代謝型，伏立康唑給藥劑量為0.2 g，每12小時1次時，血藥濃度為14.51 μg/mL，高于臨床推薦的治療范圍，患者出現(xiàn)階段性的視力障礙不良反應；后調整治療劑量0.2 g，每天1次，不良反應消失，血藥濃度下降至3.04 μg/mL。鑒于該因素對伏立康唑血藥濃度的重要性，開展 CYP2C19基因型的檢測對伏立康唑臨床合理使用具有指導意義。

3.2 伏立康唑血藥濃度分析 根據(jù)《伏立康唑個體化用藥指南》，推薦伏立康唑血藥濃度維持在0.5～5.0 μg/mL(1B，強推薦，中等質量證據(jù))。該推薦在本研究中得到認可，血藥濃度在0.5～5.0 μg/mL范圍內時，其臨床療效顯著優(yōu)于血藥濃度<0.5 μg/mL的患者；且隨著血藥濃度超過5.0 μg/mL，其臨床療效并不能進一步增加。當伏立康唑血藥濃度>5.0 μg/mL其視覺障礙、皮疹等不良反應的發(fā)生率顯著升高。其中CYP2C19慢和中間代謝型伏立康唑血藥濃度比快代謝型高3倍，抗真菌療效好，但不良反應的風險較高。本研究的10例患者，有7例患者的血藥濃度在有效范圍內，另外3例患者的血藥濃度值也接近有效范圍，并且在后續(xù)檢測中，臨床醫(yī)師會實時調整劑量，臨床藥理學研究亦證明，血藥濃度與視覺障礙更具有相關性，血藥濃度越高，視覺障礙發(fā)生的可能性越大。因此，深層次的了解伏立康唑的藥代動力學特征以及個體化影響因素對臨床科學合理的使用該藥尤為關鍵。因此，伏立康唑血藥濃度監(jiān)測結果是臨床調整藥物治療方案的重要依據(jù)。

3.3 臨床用藥建議 對于快代謝型患者，使用常規(guī)劑量的伏立康唑由于肝臟代謝能力較強可能無法達到治療效果，治療失敗風險大，可適當增加藥物劑量或替換其他藥物。對于中間代謝型型患者，使用常規(guī)劑量的伏立康唑由于肝臟細胞色素氧化酶P450代謝能力較弱可能會引起藥時曲線下面積血藥濃度升高，較易發(fā)生不良反應，但風險較低，建議按照標準劑量但應關注不良反應。而慢代謝型患者使用常規(guī)劑量后，體內血藥濃度大，清除率下降，不良反應發(fā)生風險高，但治療效果較好，需要權衡之后給藥。伏立康唑血藥濃度除了與CYP2C19基因多態(tài)性相關之外，還與患者肝腎功能、病理生理狀態(tài)、飲食和聯(lián)合用藥等其他因素的相關。因此，單純的檢測CYP2C19基因多態(tài)性不足以調整患者伏立康唑的個體化治療方案，還需要結合血藥濃度監(jiān)測判斷患者治療方案的合理性。

綜上所述，個體化用藥實踐過程中發(fā)現(xiàn)，CYP2C19基因檢測雖然可以預測藥物在體內的部分藥動學過程，但是無法準確指導藥物的治療劑量。當藥物的體內代謝過程往往受到多個藥物代謝酶參與或者藥物代謝存在多個通路和途徑時，代謝酶基因型難以與血藥濃度進行直接相關。單一血藥濃度監(jiān)測又無法解釋特殊代謝型患者血藥濃度的異常結果，以及無法預測藥物在體內的藥動學過程。因此，上述問題的出現(xiàn)促進了CYP2C19基因檢測與血藥濃度監(jiān)測在指導臨床個體化合理用藥過程中的有效結合。