李 媛，傅玉穎，李澤亞，張 超，李貞鵬，蘇歡歡

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 杭州 310018）

β-胡蘿卜素（beta-carotene，BC）是一種常見的類胡蘿卜素，具有多種功能，如抗氧化作用，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)，防癌作用，合成維生素A 等[1-2]。由于BC 含有多個(gè)共軛雙鍵，使得其對(duì)光、熱、氧極其敏感[3-4]；同時(shí)BC 水溶性極低，僅微溶于油和部分有機(jī)溶劑[5]，這極大地限制了其在食品中的應(yīng)用。為解決以上問題，人們做了大量研究，如制備微膠囊、固體脂質(zhì)納米顆粒、納米乳液、β-環(huán)糊精包合物等運(yùn)載體系來提高BC 的穩(wěn)定性和溶解度。近年來，有研究利用與蛋白（如酪蛋白[6]、β-乳球蛋白[7]）的絡(luò)合作用來提高BC 在水溶液中的溶解度、穩(wěn)定性以及生物利用率。這種包埋體系不需要添加油相，制備簡(jiǎn)單，無需添加合成乳化劑，具有添加到無脂飲料中的潛力。

乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）是奶酪生產(chǎn)過程中重要的副產(chǎn)品，因其較高的營養(yǎng)價(jià)值、低廉的價(jià)格以及多種功能特性（如乳化、增稠、凝膠），故可作為生物活性物質(zhì)的載體[8]。WPI在pH 2 條件下加熱（80 ℃）數(shù)小時(shí)，可以自組裝形成淀粉樣蛋白原纖維。乳清分離蛋白纖維（whey protein nanofibrils，WPN） 具有約10 nm 的直徑，幾微米的長度，這種較高長度直徑比值的纖維結(jié)構(gòu)賦予了蛋白原纖維獨(dú)特的流變特性，較強(qiáng)的膠凝能力、乳化性和起泡性[9]。與天然的WPI 相比，WPN 具有更好的兩親性、發(fā)泡性能以及更高的耐熱性[10]。有研究表明WPN 可作為微膠囊的壁材和乳化劑，對(duì)一些活性物質(zhì)封裝和保護(hù)。Mehdi等[11]將WPN 用作包埋姜黃素的載體，使得姜黃素的水溶性大大增加，與WPI 相比，姜黃素從WPN中釋放的更慢，從而具有緩釋作用。Zhang 等[12]通過微波加熱WPI 形成WPN，WPN 作為乳化劑制備的乳液具有更好的穩(wěn)定性。

為進(jìn)一步增強(qiáng)蛋白包埋體系的穩(wěn)定性，可在蛋白外面附加一層多糖，多糖通過靜電作用與蛋白復(fù)合，進(jìn)而增加復(fù)合物間的空間位阻和靜電排斥力[13]。菊粉是一種線性直鏈陰離子多糖[14]，作為一種功能性多糖，不僅具有益生元功效，還可作為脂肪代替物與糖類代替物應(yīng)用于食品中[15]。有研究以菊粉和大豆分離蛋白作為壁材，可提高魚油的包封率[16]。透明質(zhì)酸是一種線性糖胺聚糖的天然聚合物，屬于陰離子多糖，對(duì)蛋白質(zhì)的空間構(gòu)型和功能具有一定調(diào)節(jié)作用，例如：HA 可附著到蛋白纖維網(wǎng)中，填充空隙[17]。本文將WPI 溶液在酸性條件下加熱（pH=2，80 ℃）24 h 獲得WPN，基于反溶劑沉淀法將這些WPN 與BC 在pH=3.2 下復(fù)合制備WPN/BC 復(fù)合粒子，進(jìn)一步添加Inu 和HA獲得WPN/Inu/BC 和WPN/HA/BC 復(fù)合粒子。通過熒光猝滅和傅里葉紅外光譜確定WPN 多糖復(fù)合物與BC 之間相互作用和結(jié)構(gòu)特征。使用多種技術(shù)確定分散體系的穩(wěn)定性，并測(cè)定BC 包封效率。此外，根據(jù)復(fù)合粒子的抗氧化活性（DPPH 清除活性） 和BC 的體外釋放行為對(duì)其復(fù)合粒子的功能特性進(jìn)行評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清分離蛋白（＞95%），美國DAVISCO 公司；β-胡蘿卜素（≥96%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；透明質(zhì)酸（食品級(jí)），嘉興恒杰生物制藥股份有限公司；天然菊粉（PD 2-60），維樂夫集團(tuán)有限公司等。

1.2 儀器與設(shè)備

Nicolet iS5 傅里葉變換紅外光譜，上海力晶科學(xué)儀器有限公司；F-7000 熒光分光光度計(jì)，日本HITACHI 公司；Zeta sizer Nano ZS 激光粒度分析儀，英國Malvern 公司；UV-2600 紫外可見分光光度計(jì)，日本島津儀器有限公司；H1850R 高速冷動(dòng)離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；Re-5220 真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 WPN/多糖/BC 復(fù)合物的制備

根據(jù)Akkermans 等[18]所述的方法并稍作修改，將乳清分離蛋白原纖化。在室溫下將乳清分離蛋白粉末溶解在去離子水中通過磁力攪拌2 h，然后在4 ℃下放置12 h 制備WPI 儲(chǔ)備溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%）。用6 mol/L HCl 將蛋白溶液的pH 值調(diào)節(jié)至2，然后在溫和的攪拌條件下于85 ℃加熱24 h，得到WPN 溶液之后，立即使用冰浴將WPN 溶液冷卻至室溫。將所得原纖化的WPN 溶液4 ℃儲(chǔ)存或-20 ℃冷凍干燥備用。

制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的BC 溶液：稱取BC 溶于無水乙醇加熱攪拌半小時(shí)。

用2 mol/L NaOH 和1 mol/L HCl 將質(zhì)量濃度為20 mg/mL 的WPN 溶液pH 值調(diào)整為3.2，模擬酸性食品飲料的條件，之后將BC 用注射器注入pH 3.2 的WPN 溶液中，在50 ℃的水浴中以1 000 r/min 的磁力攪拌2 h。40 ℃條件下用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙醇，然后加入相同體積的去離子水。將它們分為三等分，分別以4∶1（體積比）的比例加入去離子水，1.5%天然Inu 溶液和0.02% HA 溶液，在室溫下將它們?cè)? 000 r/min 磁力攪拌混合2 h?；旌衔镏蠦C 的終質(zhì)量濃度為0.16 mg/mL，加入一定量的0.02% NaN3，在4 ℃下保存或冷凍干燥以備后用。

1.4 Zeta 電位測(cè)量

用激光粒度分析儀測(cè)定pH 值為3.2 的WPN，WPN/Inu，WPN/HA 及其與BC 的配合物等不同樣品溶液的Zeta 電位。樣品用蒸餾水（pH 3.2）稀釋，所有樣品均在（25±1）℃下進(jìn)行測(cè)量，一式3 份。

1.5 熒光光譜測(cè)定

通過Sun 等[19]的方法，設(shè)定激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射光譜在300 和450 nm 之間收集，掃描速度為100 nm/min。在將樣品稀釋幾倍后，測(cè)量蛋白質(zhì)的固有熒光。

1.6 傅里葉變換紅外光譜測(cè)定

將凍干固體樣品（BC，WPN，Inu，HA，WPN/BC，WPN/Inu，WPN/HA，WPN/HA/BC，WPN/Inu/BC）與溴化鉀以1∶100 的質(zhì)量比例加入研缽中，在紅外燈照射下研磨成粉末狀，取適量樣品用壓片機(jī)制成薄片置于衰減全反射的樣品槽中進(jìn)行測(cè)定分析，光譜分辨率為4 cm-1，掃描波長為400～4 000 cm-1，掃描32 次。

1.7 粒子包封率測(cè)定

將1 mL WPN/BC，WPN/Inu/BC 和WPN/HA/BC 復(fù)合物以及3 mL 正己烷的樣品放入離心管中進(jìn)行混合。渦旋振蕩60 s 后，將樣品放入離心機(jī)中。在10 000 r/min 條件下離心20 min，取上清液定容于10 mL 棕色容量瓶中，根據(jù)下式（1）計(jì)算包封率：

1.8 DPPH 自由基清除活性測(cè)定

參照Guan 等[20]方法，對(duì)其稍作修改，使用穩(wěn)定的自由基DPPH 測(cè)試包封BC 復(fù)合物的自由基清除活性。配制0.1 mmol/L DPPH 乙醇溶液，將3 mL DPPH 溶液與1 mL 含/不含BC 的樣品溶液（即WPN，WPN/Inu，WPN/HA，WPN/BC，WPN/Inu/BC 和WPN/HA/BC）混合，置于室溫（25 ℃）下于黑暗中孵育30 min，然后使用分光光度計(jì)測(cè)量517 nm 處的吸光度。用去離子水（pH 3.2）作為空白對(duì)照。DPPH 自由基清除活性的計(jì)算如下[21]（2）或（3）：

式中：Ai——BC 與DPPH 溶液混合的樣品溶液的吸光度值；Aj——BC 與乙醇溶液混合后的樣品溶液的吸光度值；Ac——蛋白質(zhì)溶液與DPPH溶液的吸光度值；A0——空白的吸光度值。

1.9 BC 穩(wěn)定性測(cè)定

將WPN/BC，WPN/Inu/BC，WPN/HA/BC 復(fù) 合物在室溫輕微攪拌下孵育15 d，確定其化學(xué)穩(wěn)定性。通過在整個(gè)存儲(chǔ)期內(nèi)定期分析其濃度來確定BC 降解的程度，使用溶劑萃取從納米復(fù)合物中分離出BC，然后使用UV-可見光譜法對(duì)其進(jìn)行定量[22]。加入每個(gè)樣品（0.2 mL）后，在10 s 的渦旋下加入含有乙醇和正己烷（體積比為2∶3）的溶劑。將混合物靜置幾分鐘直到發(fā)生完全的相分離，然后將上面的黃色上清液（己烷相）轉(zhuǎn)移到10 mL 容量瓶中。用1 mL 正己烷重復(fù)萃取幾次，直到乙醇相變?yōu)闊o色。對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行3 次重復(fù)分析，并使用分光光度計(jì)在452 nm 處測(cè)量吸光度。純正己烷溶液用作空白，通過參考在相同條件下制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得BC 濃度。保留率表示為BC 質(zhì)量濃度百分比：Ct/C0（%），其中Ct是儲(chǔ)存一段時(shí)間后的BC 質(zhì)量濃度，C0是初始BC 質(zhì)量濃度。BC 的降解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型[23]，可由方程（4）計(jì)算降解率k，再由公式（5）計(jì)算BC 半衰期IC50即BC 降解50%所需的時(shí)間[24-25]。

式中：t——保存時(shí)間，d；k——降解速率常數(shù)，d-1；A0——適應(yīng)常數(shù)。

1.10 體外模擬消化試驗(yàn)

試驗(yàn)根據(jù)Chen 等[26]的方法進(jìn)行了一些修改，將30 mL 樣品與30 mL 含3.2 mg/mL 胃蛋白酶的模擬胃液（SGF）混合，用鹽酸將pH 調(diào)節(jié)至3，然后置于37 ℃的水浴中連續(xù)攪拌2 h 模擬胃消化。將從上述模擬胃相中獲得的20 mL 樣品與20 mL包含1.6 mg/mL 胰腺的模擬腸液（SIF）混合，將pH值調(diào)節(jié)至7.0，置于37 ℃水浴連續(xù)攪拌2 h 模擬小腸消化。分別在第10，30，60，90，120，150，180，210，240 min 吸取3 mL（分為3 個(gè)平行試驗(yàn)）溶液離心后測(cè)BC 濃度。模擬消化液成分表如下[27]：

表1 模擬消化液原液的制備成分表Table 1 Preparation of simulated digestive stock solution

1.11 統(tǒng)計(jì)分析

使用單向方差分析（ANOVA）進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，并使用SPSS 軟件（第20 版，IBM 軟件，紐約州，美國）通過鄧肯多范圍分析程序確定樣品之間的顯著差異（P＜0.05）。每個(gè)試驗(yàn)至少重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 Zeta 電位

測(cè)量ζ 電位以反映在水溶性遞送系統(tǒng)中分散體的穩(wěn)定性。如圖1所示，在pH 3.2 下，純Inu 的Zeta 電位為（-7.68±1）mV，HA 為（-5.9±1.28）mV。與WPN（+40.27 mV±2.01 mV）相比，WPN 復(fù)合材料Inu 和HA 的電勢(shì)分別為 （+38.23±2.83）mV 和（+34.43±1.45）mV，所帶電荷略微下降。

當(dāng)添加BC 時(shí)，WPN/BC，WPN/HA/BC 和WPN/Inu/BC 的Zeta 電位分別為（+52.1±0.52）mV，（+44.83±0.8）mV 和（+48.27±0.65）mV。在蛋白和多糖復(fù)合物的形成的過程中靜電相互作用對(duì)體系的穩(wěn)定起著重要作用，在pH=3.2 環(huán)境下WPN 帶正電，而多糖帶負(fù)電，因此，ζ 電位值的變化表明WPN 和陰離子多糖通過靜電吸引導(dǎo)致陰離子多糖在乳清蛋白表面被覆，從而屏蔽了表面電荷。此外，HA 具有很大的空間位阻作用[28]，賦予WPN/HA/BC 良好的穩(wěn)定性。

由圖1可以看出膠體分散體系仍帶正電荷，這表明WPN 在復(fù)合納米顆粒外層的主要部分。然而外層的總ζ 電位下降，表明陰離子多糖在蛋白纖維網(wǎng)的間隙中附著，這使保護(hù)BC 的外層變得更加緊密，更好地保護(hù)BC。

圖1 HA，Inu 以及復(fù)合物的Zeta 電位圖Fig.1 Zeta potential diagram of HA，Inu and complexes

2.2 熒光光譜

熒光猝滅法可以用來研究多糖Inu 和HA 對(duì)WPN 疏水氨基酸微環(huán)境的影響以及負(fù)載BC 后WPN 構(gòu)象的變化。由圖2可知激發(fā)波長為280 nm 時(shí)Trp 和Tyr 殘基被激發(fā)，這主要依賴于蛋白的折疊和展開。WPN 的Trp 和Tyr 殘基激發(fā)后在341 nm 處顯示出最大熒光發(fā)射峰，添加Inu 和HA后最大峰值沒有發(fā)生變化說明Trp 和Tyr 的微環(huán)境沒有發(fā)生改變，但WPN 熒光強(qiáng)度略有增加，說明WPN 暴露出更多的疏水氨基酸，這可能是由于多糖與WPN 親水基團(tuán)結(jié)合，進(jìn)而改變了纖維蛋白的結(jié)構(gòu)。當(dāng)WPN 和WPN 多糖負(fù)載BC 后熒光強(qiáng)度略有下降，說明WPN 發(fā)生熒光猝滅反應(yīng)（主要是復(fù)合物形成引起的靜態(tài)淬滅[31]），可能是由于BC 與WPN 的疏水氨基酸相互作用，使得暴露在外的疏水基團(tuán)減少。

圖2 WPN，WPN/多糖以及WPN/多糖/BC 的熒光圖譜Fig.2 Fluorescence diagram of WPN，WPN/polysaccharide and WPN/polysaccharide/BC

2.3 FTIR

圖3所示為多糖，WPN 以及負(fù)載BC 納米粒子的紅外光譜圖。菊粉骨架特征吸收峰位于933，1 030，3 411 cm-1處[29]。透明質(zhì)酸的特定峰處于3 420～3 280 cm-1，該峰屬于-COOH 和-OH 的拉伸振動(dòng)，在2 916 cm-1處的峰屬于-CH 拉伸振動(dòng)。此外，在1 621 和1 415 cm-1處的峰是歸因于COO-基團(tuán)對(duì)稱和不對(duì)稱振動(dòng)的拉伸振動(dòng)，而在1 322 cm-1處的峰是由HA 的N-H 拉伸振動(dòng)引起[30]。WPN 中1 638 cm-1和1 630 cm-1是主要的吸收帶表示β-折疊的特征結(jié)構(gòu)單元[31]。WPN 與菊粉復(fù)合后，菊粉3 411 cm-1處的特征峰消失，-OH 伸縮振動(dòng)峰逐漸向低波數(shù)方向發(fā)生位移，說明菊粉與WPN 分子間的氫鍵作用增強(qiáng)。WPN 與透明質(zhì)酸復(fù)合后與單一的透明質(zhì)酸具有類似的情況。WPN 與陰離子多糖氫鍵作用是穩(wěn)定分散體系的重要因素。紅外譜圖顯示除了游離羥基和締合羥基吸收峰位移有變化外，其余吸收峰沒有明顯的位移變化趨勢(shì)，說明菊粉和透明質(zhì)酸與WPN 之間沒有新的基團(tuán)生成，僅發(fā)生了氫鍵作用。

圖3 多糖，WPN，BC（a）及復(fù)合物（b）的傅里葉變換紅外圖譜Fig.3 FTIR spectra of polysaccharide，WPN，BC （a） and complexes （b）

2.4 包封率

表2為3 種復(fù)合物的包封率。由表2可以看出WPN 復(fù)合HA 包埋BC 的包埋率最高為99.02%，與另外兩種復(fù)合物的包埋率具有顯著差異（P＜0.05），說明WPN 復(fù)合HA 對(duì)BC 具有更好的包埋和保護(hù)作用。這可能是由于透明質(zhì)酸黏度大，分子鏈具有一定剛性使其呈現(xiàn)螺旋結(jié)構(gòu)，進(jìn)而在溶液中形成一定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使得WPN 纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更加緊密。

表2 復(fù)合物的包封率Table 2 Encapsulation efficiency of complexes

2.5 DPPH 自由基清除活性

通過測(cè)量DPPH 自由基清除活性來評(píng)估每個(gè)樣品的抗氧化活性。WPN 的抗氧化活性主要?dú)w因于其表面的巰基和其它氨基酸殘基（Tyr，Trp，Met和Lys）[32]。β-胡蘿卜素主要通過氫原子轉(zhuǎn)移機(jī)制和單電子轉(zhuǎn)移機(jī)制來清除自由基，共軛雙鍵的特殊結(jié)構(gòu)是它具有自由基清除能力的重要原因，其通過疏水作用與纖維蛋白絡(luò)合，提高了自由基清除能力[33]。與單獨(dú)的β-胡蘿卜素相比添加或不添加多糖的纖維蛋白和β-胡蘿卜素復(fù)合物具有更高的DPPH 自由基清除活性（P＜0.05）。多糖的添加進(jìn)一步提高了復(fù)合物的DPPH 清除活性 （P＜0.05），其中添加HA 復(fù)合物的DPPH 清除活性比添加Inu 更強(qiáng)（P＜0.05）。

2.6 BC 降解動(dòng)力學(xué)

圖4為3 種復(fù)合物不避光室溫下儲(chǔ)存15 d的降解保留率。從圖中可以看出15 d 后WPN/BC降解量最大，與復(fù)合多糖具有顯著差異（P＜0.05）。WPN/BC 在儲(chǔ)存期間BC 損失了 （93.08±0.13）%，復(fù)合多糖的BC 復(fù)合物僅損失50%左右，其中添加菊粉體系中BC 損失了（50.31±1.29）%，添加透明質(zhì)酸體系中BC 損失了（53.75±0.17）%。由此可見多糖的添加所形成的體系對(duì)BC 有很好的保護(hù)作用，可有效延緩BC 的降解，延長BC 貨架期。根據(jù)一級(jí)動(dòng)力模型可以計(jì)算出3 種復(fù)合物中BC 的半衰期，WPN/HA/BC 和WPN/Inu/BC 半衰期分別為16 d 和15 d，WPN/BC 半衰期最短為4 d，再次證明了多糖的添加對(duì)復(fù)合物中的BC 有更好的保護(hù)作用，多糖復(fù)合顆粒的界面層更厚、更致密，整體顆粒密度更高，空間排斥更高。

圖4 WPN/BC、WPN/Inu/BC 和WPN/HA/BC 保留率Fig.4 The retention rate of freeze-dried powder for WPN/BC，WPN/Inu/BC and WPN/HA/BC

表3 原材料和復(fù)合物的DPPH 清除活性Table 3 DPPH scavenging activity of raw materials and compounds

2.7 模擬體外胃腸釋放

如圖5所示，在SGF 中消化2 h 后，BC 從WPN/Inu/BC 和WPN/HA/BC 中分別釋放約19%和21%，這為BC 在結(jié)腸中釋放提供機(jī)會(huì)。2 h 后在SIF 中釋放量平緩增加，該結(jié)果表明多糖復(fù)合的BC 在SIF 或SGF 中是連續(xù)而不是突然性釋放的。這一方面可能因?yàn)閃PN、多糖和BC 之間的疏水作用性和靜電相互作用而緊密結(jié)合，另一方面菊粉不會(huì)被人體代謝消化，只能被腸道菌群代謝利用，因此包封在菊粉中的BC 可以在結(jié)腸中特異性地釋放[40]，此外由于HA 在水溶液中結(jié)構(gòu)膨脹，易包裹小分子BC，阻止BC 釋放。因此纖維蛋白復(fù)合多糖的運(yùn)載體系有機(jī)會(huì)實(shí)現(xiàn)BC 在結(jié)腸中靶向釋放。

圖5 體外模擬消化下BC 從復(fù)合物中的累積釋放曲線Fig.5 Cumulative release profiles of BC from the complex during simulated in vitro digestion conditions

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用反溶劑法，制備兩種乳清分離蛋白纖維復(fù)合多糖負(fù)載β-胡蘿卜素的復(fù)合納米顆粒。WPN/Inu/BC 和WPN/HA/BC 電位為（+48.27±0.65）mV 和（+44.83±0.8）mV，包封率為（94.34±1.35）%和（99.02±0.17）%，DPPH 自由基清除活性為（61.20±2.08）%和（68.85±1.84）%。儲(chǔ)存穩(wěn)定性試驗(yàn)表明15 d 后多糖復(fù)合的體系中BC 降解量約50%，WPN/Inu/BC 和WPN/HA/BC 復(fù)合粒子中BC 半衰期為15 d 和16 d。熒光光譜結(jié)果顯示W(wǎng)PN 與多糖復(fù)合后暴露出更多的疏水基團(tuán)從而與BC 更好的復(fù)合。紅外光譜結(jié)果顯示多糖和BC一些吸收峰發(fā)生偏移，說明它們與乳清分離蛋白纖維發(fā)生較強(qiáng)的氫鍵作用和疏水相互作用。體外模擬消化試驗(yàn)表明兩種復(fù)合多糖的粒子都具有較好的控釋能力。最終結(jié)果表明WPN/Inu/BC 和WPN/HA/BC 都表現(xiàn)出優(yōu)于WPN/BC 的抗氧化性（DPPH 自由基清除活性）、包封率和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，并且在抗氧化性、包封率和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性這3 個(gè)方面復(fù)合HA 的體系比復(fù)合Inu 的體系更優(yōu)越。因此，WPN-多糖復(fù)合納米顆?？梢宰鳛橐环N有效的包埋體系來改善酸性飲料中β-胡蘿卜素的物理和化學(xué)穩(wěn)定性。