從光雷 肖蘊祺 張倩雲(yún) 張 雪 張倚劍 邵 丹 張 安 施壽榮*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所，揚州 225125；2.揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225009)

近年來，肉雞行業(yè)快速發(fā)展，集約化養(yǎng)殖水平得到提高，但現(xiàn)代養(yǎng)殖模式也有肉雞飼養(yǎng)密度過高、免疫力較弱和生長性能降低等弊端，從而催生肉雞養(yǎng)殖行業(yè)大量使用抗生素，但抗生素會造成畜禽體內殘留和蓄積毒素、細菌耐藥譜增多等問題。同時，隨著我國抗生素禁用的政策實施，會促使家禽生產(chǎn)成本提高。因此，開發(fā)天然、低廉、無毒副殘留的抗生素替代物已刻不容緩。化香果(PlotytaryastrohilaceaSieb. et Zuce)又稱化香樹果，是胡桃科植物化香樹的果序，在我國民間的應用較廣且歷史悠久，分布廣泛，多以葉、果序入藥[1]。化香果序中含有較豐富的植物單寧，其單寧屬于鞣花單寧(水解單寧)，經(jīng)過水解可以得到鞣花酸?；愎哂刑厥獾乃幚韺W和生物學活性，是其藥用價值的基礎。國內外對化香果提取的鞣花單寧的研究多集中在抑制細胞毒性、抑制腸道內有害菌、抗氧化、預防癌癥、抗衰老[2-3]及其作為復方中藥治療急性、慢性鼻炎和鼻竇炎等方面上[4]。由此可見，化香果單寧具有替代抗生素的潛力，但作為家禽飼料添加劑的研究尚未見報道。因此，本試驗旨在研究飼糧添加化香果單寧對肉雞免疫器官指數(shù)、血漿抗氧化和生化指標及盲腸微生物區(qū)系的影響，為化香果單寧在家禽生產(chǎn)應用中提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

選擇288羽1日齡雄性愛拔益加(AA)肉雞，隨機分為4組，每組6個重復，每個重復12羽。對照組(PT0組)飼喂基礎飼糧，試驗組分別在基礎飼糧中添加100(PT100組)、500(PT500組)和1 000 mg/kg(PT1 000組)化香果單寧(棕褐色，單寧含量≥65%，由中國林業(yè)科學研究院林產(chǎn)化學工業(yè)研究所植物單寧化學利用課題組提供)。試驗期42 d。

1.2 基礎飼糧及飼養(yǎng)管理

基礎飼糧按照NRC(1994)肉雞營養(yǎng)需求配制并制粒，其組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗采用網(wǎng)床平養(yǎng)，網(wǎng)床規(guī)格125 cm×95 cm×65 cm。在飼喂期的前3 d，溫度控制在34 ℃左右，隨后每2 d降低1 ℃，直至溫度降至23 ℃左右。所有試驗動物均自由采食和飲水。每天采用24 h的光照方法。通風和免疫均按照飼養(yǎng)管理手冊標準來執(zhí)行。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) %

1.3 檢測指標

1.3.1 免疫器官指數(shù)

分別在肉雞21和42日齡時，每個重復隨機選取1羽進行屠宰，解剖取出胸腺、脾臟和法氏囊稱重，按照公式計算免疫器官指數(shù)：

免疫器官指數(shù)(%)=[免疫器官鮮重(g)/
宰前活重(g)]×100。

1.3.2 血漿抗氧化指標

分別在肉雞21和42日齡時，從每重復隨機選取1羽，使用肝素鈉抗凝采血管，翅靜脈采血，4 000 r/min離心10 min，分離得到血漿。測定血漿中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性及總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量。以上指標均使用南京建成生物工程研究所試劑盒測定。

1.3.3 血漿生化指標

分別在肉雞21和42日齡時，采用UniCel DxC 800 Synchron全自動生化分析儀(Beckman Coulter，美國)測定血漿中總膽固醇(T-CHO)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、肌酐(CREA)、甘油三酯(TG)、尿素氮(UN)和尿酸(UA)含量，由揚州市疾病預防控制中心測定。

1.3.4 盲腸微生物區(qū)系

無菌采集各組雞盲腸內容物，液氮速凍后-80 ℃保存待送樣檢測。結合本試驗肉雞的免疫器官指數(shù)、血漿抗氧化和生化指標結果，決定送檢PT0和PT100組肉雞盲腸內容物樣品。由諾禾致源生物信息科技有限公司進行16S rDNA測序。基于Illumina NovaSeq測序平臺對V3～V4高變區(qū)進行雙末端測序，以分析盲腸菌群豐富度和多樣性。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

使用Excel 2010對試驗數(shù)據(jù)初步處理，各組之間使用SPSS 26.0進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和線性分析，組間采用Duncan氏法多重比較檢驗。2組之間使用獨立樣本t檢驗進行分析。結果用平均值和均值標準誤表示，P<0.05表示顯著差異，0.05

2 結 果

2.1 飼糧添加化香果單寧對肉雞免疫器官指數(shù)的影響

由表2可知，PT500和PT1 000組21日齡肉雞的法氏囊指數(shù)顯著高于PT0和PT100組(P<0.05)。飼糧添加化香果單寧具有提高21日齡肉雞的胸腺指數(shù)的趨勢(P=0.076)。飼糧添加化香果單寧對21和42日齡肉雞的脾臟指數(shù)無顯著影響(P>0.05)。

表2 飼糧添加化香果單寧對肉雞免疫器官指數(shù)的影響Table 2 Effects of dietary Plotytarya strohilacea Sieb. et Zuce tannin on immune organ indexes of broilers %

2.2 飼糧添加化香果單寧對肉雞血漿抗氧化指標的影響

由表3可知，PT100組42日齡肉雞的血漿CAT活性顯著高于PT0、PT500和PT1 000組(P<0.05)，且血漿CAT活性與化香果單寧添加量呈顯著二次曲線相關(P<0.05)。PT0、PT100和PT500組42日齡肉雞的血漿GSH-Px活性顯著高于PT1 000組(P<0.05)，且血漿GSH-Px活性與化香果單寧添加量呈顯著二次曲線相關(P<0.05)。PT100組42日齡肉雞的血漿T-AOC顯著高于PT0組(P<0.05)，且血漿T-AOC與化香果單寧添加量呈顯著線性和二次曲線相關(P<0.05)。飼糧添加化香果單寧對21和42日齡肉雞的血漿T-SOD活性和MDA含量無顯著影響(P>0.05)。

表3 飼糧添加化香果單寧對肉雞血漿抗氧化指標的影響Table 3 Effects of dietary Plotytarya strohilacea Sieb. et Zuce tannin on plasma antioxidant indexes of broilers

2.3 飼糧添加化香果單寧對肉雞血漿生化指標的影響

由表4可知，PT100、PT500和PT1 000組42日齡肉雞的血漿CREA含量顯著低于PT0組(P<0.05)，且血漿CREA含量與化香果單寧添加量呈顯著線性和二次曲線相關(P<0.05)。PT100和PT500組21日齡肉雞的血漿HDL含量顯著高于PT0組(P<0.05)。飼糧添加化香果單寧具有降低42日齡肉雞的血漿UN(P=0.096)和UA含量(P=0.070)的趨勢。飼糧添加化香果單寧對肉雞血漿T-CHO、LDL和TG含量無顯著影響(P>0.05)。

2.4 飼糧添加化香果單寧對肉雞響盲腸微生物區(qū)系的影響

2.4.1 盲腸微生物多樣性指數(shù)

由表5可知，PT100組和PT0組之間Chao1和Simpson指數(shù)無顯著差異(P>0.05)。

表5 盲腸微生物多樣性指數(shù)Table 5 Cecal microbial diversity indexes

2.4.2 盲腸微生物相對豐度

由圖1和表6可知，科水平下的優(yōu)勢菌群(相對豐度>2%)包括：瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、坦納菌科(Tannerellaceae)、阿克曼菌科(Akkermansiaceae)、毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、擬桿菌科(Bacteroidaceae)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，分別占34.88%、10.86%、4.87%、12.42%、9.48%、5.63%和2.45%。PT100組的盲腸Tannerellaceae相對豐度顯著高于PT0組(P<0.05)。

Ruminococcaceae：瘤胃菌科；Tannerellaceae：坦納菌科；Akkermansiaceae：阿克曼菌科；Bacteroidaceae：擬桿菌科；Lachnospiraceae：毛螺旋菌科；Rikenellaceae：理研菌科；Enterobacteriaceae：腸桿菌科；Marinifilaceae：海百合科；unidentified_Clostridiales：未分類梭菌科；Others：其他。Parabacteroides：副擬桿菌屬；Akkermansia：阿克曼菌屬；Bacteroides：擬桿菌屬；Alistipes：另枝菌屬；Faecalibacterium：糞桿菌屬；unidentified_Enterobacteriaceae：未分類腸桿菌科；Butyricimonas：丁酸弧菌；unidentified_Lachnospiraceae：未分類毛螺菌科；unidentified_Ruminococcaceae：未分類瘤胃菌科；unidentified_Clostridiales：未分類梭菌科；Bilophila：嗜膽菌屬；Lactobacillus：乳酸桿菌屬；Bacillus：芽孢桿菌屬；Ruminiclostridium：瘤胃梭菌屬；Butyricicoccus：丁酸球菌屬；unidentified_Christensenellaceae：未分類克里斯滕森氏科；Flavonifractor：黃桿菌屬；Subdoligranulum：罕見小球菌屬；Oscillospira：顫螺菌；Blautia：勞特氏菌屬；Hydrogenoanaerobacterium：產(chǎn)氫厭氧桿菌屬；unidentified_Erysipelotrichaceae：未分類韋榮球菌科；Acinetobacter：不動桿菌屬。圖1 盲腸微生物相對豐度(A：科水平；B：屬水平)Fig.1 Relative abundance of cecal microbes (A: family level; B: genus level)

表6 科水平和屬水平上的優(yōu)勢菌群Table 6 Dominant flora at family level and genus level

屬水平下的優(yōu)勢菌群(相對豐度>2%)包括：副擬桿菌屬(Parabacteroides)、阿克曼菌屬(Akkermansia)、另枝菌屬(Alistipes)、擬桿菌屬(Bacteroides)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)，分別占7.95%、4.59%、9.49%、4.37%和4.64%。PT100組的盲腸副擬桿菌屬(Parabacteroides)相對豐度顯著高于PT0組(P<0.05)。

2.4.3 組間差異性腸道菌群

本試驗用線性判別分析(LDA)實現(xiàn)降維和評估差異顯著物種的影響大小，LDA閾值設定為3。由圖2可知，PT100組差異優(yōu)勢菌是副擬桿菌，其相對豐度顯著高于PT0組(P<0.05)。

Tannerellaceae：坦納菌科；Parabacteroides：副擬桿菌屬；Parabacteroides_distasonis：狄氏副擬桿菌；Subdoligranulum：罕見小球菌屬；Bacterium_ic1277：桿菌ic1277；Bacterium_ic1391：桿菌ic1391；Oscillibacter：顫桿菌；unidentified_Peptococcaceae：未分類消化球菌科；Butyricicoccus：丁酸球菌屬；Anaerolinea：厭氧繩菌屬；Desulfotomaculum_ruminis：瘤胃脫硫腸狀菌；Desulfotomaculum：脫硫腸狀菌屬；Micrococcales：微球菌目；unidentified_Lachnospiraceae：未分類毛螺菌科；Bacilli：桿菌綱；unidentified_Ruminococcaceae：未分類瘤胃菌科。圖2 組間差異性腸道菌群Fig.2 Differential intestinal flora between groups

3 討 論

3.1 飼糧添加化香果單寧對肉雞免疫器官指數(shù)的影響

前期試驗表明，飼糧添加化香果單寧具有提高肉雞生長性能的趨勢[5]，但化香果單寧對肉雞免疫器官的影響還未見有報道。免疫器官指數(shù)是評價動物機體免疫水平的指標之一[6]。禽類的免疫器官主要包括脾臟、胸腺和法氏囊。胸腺是細胞免疫的中樞器官，法氏囊是禽類特有的體液免疫器官，在動物健康狀態(tài)下胸腺和法氏囊指數(shù)增大，代表機體的免疫機能增強。本試驗結果表明，飼糧添加化香果單寧能夠促進肉雞前期胸腺和法氏囊發(fā)育，這與前人研究結果相似。Srikhun等[2]研究表明，植物單寧能夠降低肉雞的法氏囊損傷，有利于免疫器官發(fā)育。也有研究表明，飼糧添加橡椀單寧能夠提高肉雞法氏囊和脾臟指數(shù)[6]。由此可見，化香果單寧在肉雞免疫器官發(fā)育方面具有一定促進作用。

3.2 飼糧添加化香果單寧對肉雞血漿抗氧化指標的影響

單寧能夠有效清除動物體的氧自由基(ROS)，且能夠提高動物機體的抗氧化酶活性，從而降低機體的氧化應激[7]。CAT是動物機體主要抗氧化酶之一，其具有清除機體的ROS和一氧化氮(NO)，保護機體免受氧化應激損傷[8]。GSH-Px在體內能夠催化分解過氧化氫，也是機體主要抗氧化酶之一，其有利于保持細胞膜的功能和結構完整性。T-AOC則是反映機體抗氧化系統(tǒng)的綜合指標。本試驗發(fā)現(xiàn)，飼糧添加化香果單寧能夠顯著提高肉雞的血漿CAT活性和T-AOC，且血漿CAT活性和T-AOC與化香果單寧添加量呈劑量依賴關系。另外，化香果單寧添加量還與血漿GSH-Px活性呈二次曲線相關，飼糧添加100 mg/kg化香果單寧時血漿GSH-Px活性最高。這與前人研究結果相似，如有研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加植物單寧有利于肉雞抗氧化功能的增強，從而保護脂質的過度氧化[9]。López-Andrés等[10]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加單寧能夠提高機體的抗氧化功能。Liu等[11]研究表明，在熱應激條件下添加單寧能夠顯著提高肉兔的血漿T-AOC，降低熱應激對機體的影響。Farahat等[12]在肉雞飼糧中添加植物單寧能夠降低其肌肉中MDA含量。Ye等[13]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加單寧具有提高田鼠肝臟中CAT活性的趨勢。綜上所述，化香果單寧具備較強抗氧化能力，且飼糧添加100 mg/kg化香果單寧時抗氧化效果最佳。

3.3 飼糧添加化香果單寧對肉雞血漿生化指標的影響

血漿生化指標可用于評價動物體的生理和病理狀態(tài)。T-CHO、HDL、TG和LDL含量均與動物的脂代謝相關[6]，TG、HDL和T-CHO均在肝臟內合成。TG是體內廣泛存在的脂類，其在肝臟中異常沉積會誘導肝臟巨噬細胞釋放炎癥因子，導致脂肪肝及肝硬化的發(fā)生，若血液中TG含量增多則表明機體發(fā)生了代謝性疾病[14]。T-CHO是所有含膽固醇的脂蛋白總和，其與動脈粥樣硬化疾病具有相關性[15]。HDL能夠抑制LDL的作用，從而減輕心血管疾病的發(fā)生[16]。LDL與患心血管疾病率呈正相關[17]。梁萌[18]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加藤茶提取物(富含多酚)能夠降低肉雞血液LDL和TC含量，能夠調節(jié)肉雞脂質代謝，利于肉雞機體健康。Li等[19]研究表明，飼糧添加多酚能夠降低肉雞血液T-CHO和LDL含量。Zeng等[20]研究發(fā)現(xiàn)，單寧能夠與血脂水平相關的生物分子結合，從而降低血脂水平。本試驗發(fā)現(xiàn)，在21日齡時，飼糧添加100和500 mg/kg化香果單寧能夠顯著提高肉雞血漿HDL含量，表明化香果單寧能夠改善肉雞前期血漿生化指標，但對肉雞后期血漿T-CHO、TG和LDL含量均無顯著影響。這與前人研究結果[6,19,21]并不完全一致，可能是因為試驗動物和單寧提取來源等不同所導致的差異，具體原因還需進一步研究。

CREA、UN和UA是動物機體代謝的產(chǎn)物[22]。CREA和UN含量變化與腎小球濾過率相關[23]。腎功能不全時，CREA和UN在體內蓄積，導致血液中兩者含量升高，會對組織器官造成毒害[24]。UA是衡量氨基酸利用率和蛋白質分解程度的指標，其含量升高提示機體患有相關疾病(原發(fā)性和繼發(fā)性)[25]。本試驗發(fā)現(xiàn)，飼糧添加化香果單寧能夠降低肉雞血漿CREA含量，其中以PT100組血漿CREA含量最低，且血漿CREA含量與化香果單寧添加量存在劑量依賴關系。另外，飼糧添加化香果單寧還具有降低血漿UN和UA含量的趨勢，提示飼糧條件化香果單寧可能能夠提高肉雞的蛋白質合成和沉積效率，從而有利于動物生產(chǎn)[26]。在結合本試驗血漿抗氧化指標結果，推測化香果單寧能夠清除機體自由基，維持細胞膜功能和結構完整性，降低組織器官內氧化脂質含量，降低自由基對腎臟和肝臟的損傷，從而降低血漿CREA和UN含量。

3.4 飼糧添加化香果單寧對肉雞響盲腸微生物區(qū)系的影響

本試驗采用第3代高通量測序技術，3代全長擴增子測序主要通過對16S RNA全長進行擴增，構建SMRT Bell文庫，通過分析得到不同樣品和分組的群落結構差異，在通過主坐標分析(PCoA)、非加權組平均法(UPGMA)和LefSe等降維圖和樣品聚類樹進行展示。根據(jù)本試驗免疫器官指數(shù)以及血漿抗氧化和生化指標結果，進一步研究了PT0組和PT100組肉雞盲腸微生物區(qū)系的差異。結果發(fā)現(xiàn)，飼糧添加100 mg/kg化香果單寧能夠顯著增加盲腸Parabacteroides相對豐度，其還是肉雞的優(yōu)勢菌屬。目前研究表明，Parabacteroides具有抗炎、調節(jié)免疫和代謝功能，有利于機體的健康[27]。Kverka等[28]研究表明，Parabacteroides能夠顯著降低急性和慢性結腸炎模型小鼠的腸道炎癥的嚴重程度。Koh等[29]研究發(fā)現(xiàn)，Parabacteroides能夠增加腸道緊密連接蛋白表達，保持腸道屏障的完整性，有利于腸道健康。根據(jù)本試驗免疫器官指數(shù)、血漿抗氧化和生化指標以及前期生長性能[5]的結果，推測化香果單寧是通過增加腸道Parabacteroides相對豐度保持腸道屏障完整性，改善血漿生化指標，從而提高抗氧化功能，促進肉雞的生長性能。

4 結 論

飼糧添加化香果單寧能夠增加肉雞盲腸差異優(yōu)勢菌屬Parabacteroides相對豐度，提高抗氧化功能，改善血漿生化指標，并且有利于肉雞免疫器官發(fā)育。