任朝興，朱志銘，顧春陽，鄧哲文，胡文俊，謝王栩，陳佳怡，馬 博

(南京工業(yè)大學藥學院，江蘇南京211800)

雷公藤甲素(triptolide, TP)作為中藥雷公藤(TWHF)的主要活性成分[1]，具有抗風濕、抗腫瘤、消腫止痛以及治療狼瘡性腎炎等免疫性疾病的藥理學作用[2]。雖然TP在臨床上對眾多疾病具有良好的療效，但長期使用后容易對機體產生嚴重的毒副作用，如：肝臟毒性、腸道毒性以及生殖毒性等[3-4]，尤其會造成男性不育，是限制其臨床應用的重要原因。因此，研究TP對男性生殖系統(tǒng)的毒性作用及其機制，將有助于推動TP及其衍生物的進一步開發(fā)和規(guī)范其臨床使用。

Wang等[5]研究發(fā)現(xiàn)：TP可以有效抑制Ras相似物GTP酶(Rho GTPases)，導致睪丸支持細胞骨架發(fā)生異常改變，破壞細胞與細胞之間的連接，是導致生精異常的主要原因。Wang等[6]的前期研究結果顯示：TP可以干擾睪丸組織的能量代謝行為，產生大量活性氧，抑制體內抗氧化的轉錄因子，即核因子E2相關因子(Nrf 2)的激活，誘導c-Jun氨基末端激酶(JNK)依賴的凋亡通路，導致睪丸支持細胞損傷，從而造成生精功能障礙。睪丸間質細胞凋亡及睪酮分泌水平的降低也是導致生精功能障礙的主要原因之一，由此可見睪丸組織可能是TP誘發(fā)生精子功能障礙的主要靶組織。除此之外，TP誘導的精原細胞凋亡也是導致精子異常的原因[7]。而對于作為輸送、貯存和促進精子成熟的附睪組織，TP對其的毒性作用則鮮有報道。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(PGC-1α)是一種參與代謝和應激反應的轉錄輔激活因子[8]。PGC-1α在正常條件下表達，并根據(jù)代謝需要或氧化應激反應而發(fā)生明顯改變[9]。PGC-1α參與大量基因的調控，包括PPAR，核呼吸因子1(NRF1)，核呼吸因子2(NRF2)，線粒體轉錄因子A(TFAM)，解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)和雌激素相關受體(ERRs)等，并能夠調節(jié)線粒體的活性氧(ROS)生成[10]，是影響線粒體動力學和線粒體質量的重要轉錄因子[11]。PGC-1α的抑制是導致機體組織功能喪失和損傷的主要原因。

因此，本課題采用TP誘導睪丸和附睪損傷模型，通過從精子形態(tài)，睪丸和附睪的組織形態(tài)學，氧化應激反應及PGC-1α的表達等方面，全面系統(tǒng)地闡述TP對睪丸和附睪的毒性作用和可能的分子作用機制，以期為進一步闡明該化合物對雄性生殖毒性的藥理學作用提供數(shù)據(jù)支持，并為其今后的臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

TP(純度≥98%)，上海源葉生物公司；精子快速染液，南京建成生物工程研究所；免疫組化試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司；一抗PGC-1α， 上海Affinity公司；一抗8-羥脫氧鳥苷(8-OHdG)，北京Bioss公司；β-actin，美國Cell Signaling Technology(CST)公司；二抗生物素化山羊抗兔(IgG)、三抗鏈霉親和素-生物素復合物(SABC),氧化二氨聯(lián)苯胺(DAB)、蘇木素，上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型建立

ICR雄性小鼠16只，體質量(20±2)g，將小鼠隨機分成2組，即正常對照組、TP模型組，每組8只。各組的具體給藥方式為正常對照組：腹腔注射生理鹽水0.1 mL/10 g；模型組：腹腔注射TP給藥劑量為120 μg/kg，給藥體積為0.1 mL/10 g；以上兩組分別連續(xù)給藥14 d。結束后，將小鼠稱質量，處死并收集血液，取睪丸、附睪以備用。

1.2.2 睪丸和附睪的指數(shù)

處死小鼠后，即刻取出雙側睪丸、附睪，剝去周圍的脂肪組織，記錄其質量，并按式(1)和(2)計算睪丸指數(shù)和附睪指數(shù)[12]。

睪丸指數(shù)=睪丸質量(g)/體質量(g)

(1)

附睪指數(shù)=附睪質量(g)/體質量(g)

(2)

1.2.3 精子計數(shù)與染色

選擇一側附睪，剪碎在37 ℃的生理鹽水中，游離出精子，稀釋固定后進行精子計數(shù)。同時將游離精子進行涂片，固定后用精子染色液染色，先用核染液染色3 min，流水洗凈。再用漿染液染色1 min，立即滴加增色液混合5 s，再沖洗干凈，顯微鏡下觀察其形態(tài)。

1.2.4 睪丸和附睪組織形態(tài)學的分析

取右側睪丸和附睪組織放入質量分數(shù)為4%的多聚甲醛固定液中固定48 h，接著經石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。按照文獻[13]報道的方法進行HE染色，置于光鏡下拍照觀察組織微觀結構。

1.2.5 氧化應激生化指標的檢測

稱取睪丸和附睪，按照試劑盒說明書進行樣品的預處理，然后使用分光光度計分別測定睪丸和附睪組織中的H2O2，丙二醛(MDA)，谷胱甘肽(GSH)的吸光度值，同時將同批次樣本用二辛可寧酸(BCA)蛋白濃度試劑盒進行蛋白濃度的測定并進行含量的計算。

1.2.6 免疫組化

切片經二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，去過氧化氫酶。采用0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖溶液微波中高火修復8 min，共3次。用體積分數(shù)為0.5%trinton-100打孔，體積分數(shù)為5%封閉液封閉，一抗PGC-1α(1∶ 200稀釋)和一抗8-OHdG(1∶ 600稀釋)共同孵育，4 ℃過夜。隨后，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)液漂洗3 次，滴加二抗IgG，37 ℃孵育1 h。PBS 緩沖液漂洗3次后，滴加三抗SABC，37 ℃孵育30 min。采用DAB顯色并用蘇木素復染3min，自來水下反藍后，中性樹膠封片，置于光學顯微鏡下觀察拍照。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

各實驗組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(Mean± SD) 表示，采用系統(tǒng)統(tǒng)計軟件GraphPad Prism 7 進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，按照參考文獻[14]的方法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與討論

2.1 TP對睪丸和附睪指數(shù)的影響

取各組小鼠雙側睪丸、附睪并稱質量，考察TP對小鼠睪丸、附睪指數(shù)的影響，結果見圖1。由圖1(a)可知：與正常組相比，TP模型組睪丸指數(shù)有顯著降低(P<0.001)，表明TP會造成小鼠睪丸組織的萎縮。由圖1(b)可知：TP模型組的小鼠附睪指數(shù)相對于正常組出現(xiàn)了顯著下降(P<0.05)，表明TP造成了小鼠睪丸以及附睪組織的萎縮。

###為TP模型組與正常組相比，P<0.001;#為TP模型組與正常組相比，P<0.05圖1 TP對睪丸指數(shù)和附睪指數(shù)的影響Fig.1 Effects of TP on testicular index and epididymal index

TP對睪丸和附睪形狀和大小的影響見圖2。由圖2(a)可知：小鼠睪丸的TP模型組與正常組在形狀上沒有出現(xiàn)顯著性差異，依舊形如卵圓形。但是在TP的毒性作用下，模型組的睪丸體積相較于正常組出現(xiàn)了明顯的縮小，趨向于干扁狀，同時表面也不似正常組那樣光滑呈淺粉紅色，表明TP會導致嚴重的睪丸萎縮。由圖2(b)可知：小鼠的附睪在TP的毒性作用下，形狀上與正常組相比也沒有顯著性差異，但是模型組的附睪頭，附睪尾和附睪長度相較于正常組都出現(xiàn)了明顯縮短。同時模型組的附睪頭和附睪尾體積相較于正常組顯著減小，這表明TP會導致附睪萎縮。在李凡等[15]的研究中，當給予大鼠TP 100 μg/kg時，檢測到大鼠睪丸變化不明顯，反而是附睪出現(xiàn)了顯著萎縮，于是判斷TP對于生殖系毒性作用的靶器官主要為附睪。通過本次實驗在120 μg/kg藥物劑量干預下的實驗結果表明：TP對于生殖系統(tǒng)毒性作用是通過同時損傷睪丸和附睪來實現(xiàn)的。

圖2 TP對睪丸和附睪整體形狀和大小的影響Fig.2 Effects of TP on the overall shape and size of testis and epididymis

2.2 TP對精子數(shù)量與形態(tài)的影響

通過對正常組與TP模型組的精子進行計數(shù)和染色，TP對精子數(shù)量與形態(tài)的影響見圖3。如圖3(a)所示：給藥14 d后，與正常組相比，TP模型組小鼠精子數(shù)量顯著降低(P<0.001)，提示TP造成了小鼠的生精功能異常。同時，如圖3(b)所示：正常組視野里精子數(shù)量較多，且精子形態(tài)完整，頭尾完整，沒有或極少出現(xiàn)畸形精子。但是TP模型組中視野里的精子數(shù)量極少，且普遍為形態(tài)結構異常的，還出現(xiàn)了斷頭或者無尾等畸形精子。

圖3 TP對精子數(shù)量和精子形態(tài)的影響Fig.3 Effects of TP on sperm count and morphology

2.3 TP對睪丸和附睪組織形態(tài)學的影響

睪丸和附睪是雄性的主要生殖器官，睪丸具有精子發(fā)生和合成雄性激素的生理功能，并且影響精子的獲能和受精過程[16]。附睪提供的微環(huán)境是精子成熟的必要條件，同時精子質量和運動能力也會受其影響[17]。故而，睪丸和附睪的結構和功能的正常，是雄性正常生育的必要條件。

通過HE染色觀察TP對睪丸和附睪組織形態(tài)學的影響見圖4，其中藍色為細胞核。由圖4(a)可知：正常組小鼠的睪丸組織結構清楚，細胞層次豐富，大部分生精小管內各級生精細胞排列規(guī)則，基底面至腔面可見精原細胞、初級精母細胞、精子細胞等各個發(fā)育階段細胞，腔內可見成熟精子。TP模型組中小鼠睪丸組織結構混亂，細胞層次被破壞，生精上皮明顯變薄，生精小管發(fā)生萎縮，腔內出現(xiàn)大面積空洞，未見各級生精細胞和成熟精子，睪丸支持細胞損傷嚴重。這表明TP導致了睪丸組織損傷和生精過程異常。由圖4(b)可知：正常組中附睪管排列有序，附睪管內被大量精子填滿管腔；而TP給藥14 d后，模型組附睪結構萎縮，附睪管管腔縮小，管間間隙明顯，異常脫落的精子聚集成團，部分附睪上皮細胞水腫，呈空泡狀，附睪管內基本上看不到精子的存在。這表明TP對附睪儲存精子和提供精子微環(huán)境的功能造成了嚴重破壞。以上結果均表明，TP對睪丸和附睪同時造成了生殖毒性。

圖4 TP對睪丸和附睪組織形態(tài)學的影響Fig.4 Effects of TP on morphology of testis and epididymis

2.4 TP對睪丸和附睪組織中氧化應激生化指標的影響

在之前的研究中已經證明了TP對生殖器官睪丸和附睪的毒性作用可能與激素水平和相關標志酶等有關[18]，并且通路中以氧化應激反應與炎癥為主要的研究方向，筆者則立足于氧化應激反應來探究TP產生生殖毒性可能的分子作用機制。

活性氧自由基(ROS)是一類具有很強氧化作用的化學活性物質，廣泛參與機體的生理與病理過程[19]，且已被證明多種因素如紫外線、藥物、糖尿病等均會導致體內ROS水平的升高。睪丸和附睪是男性身體重要的生殖器官，其中富含多種能量代謝的酶和眾多的線粒體數(shù)目，其維持正常的生殖系統(tǒng)功能都需要ROS的參與，但大量ROS的累積則容易導致線粒體的損傷和隨之誘發(fā)的細胞凋亡。一般氧化應激標志物MDA、H2O2和GSH異常，即表明氧化應激水平異常。有害刺激引起的異常氧化應激反應還會破壞機體的細胞大分子，比如蛋白質、脂質和DNA等[20]，導致細胞功能損害并進一步損傷細胞[21]。

睪丸組織中，與正常組相比，TP導致了TP模型組中H2O2和MDA含量的顯著性升高(P<0.001)，詳情見圖5。由圖5可知：與正常組相比，TP模型組附睪組織中H2O2和MDA含量也同樣顯著性升高(P<0.05)。以上結果表明，TP模型組中睪丸和附睪的氧化應激水平是顯著性升高的。與此同時，為了進一步檢驗組織中GSH含量，如圖5(c)所示：睪丸組織TP模型組中GSH含量相較于正常組顯著性降低(P<0.01)，同時附睪組織中的結果，也表現(xiàn)出和睪丸一樣的趨勢。以上實驗結果均表明，TP誘導的氧化應激反應可能是導致生殖功能障礙的重要原因。

##為TP模型組與正常組相比較，P<0.01圖5 TP對睪丸和附睪組織中氧化應激指標的影響Fig.5 Effects of TP on oxidative stress in testis and epididymis

2.5 TP對睪丸組織和附睪組織中PGC-1α的影響

PGC-1α在體內正常水平的表達，會促進體內產生許多與氧化應激反應有關的酶，從而保護機體不被過高的ROS所損傷，同時PGC-1α也是促進線粒體合成的關鍵轉錄因子，在維持線粒體動態(tài)平衡過程中發(fā)揮著至關重要的作用。有研究顯示：上調PGC-1α的表達可以誘導線粒體NAD依賴性脫乙?；窼IRT3的轉錄，這是PGC-1α抑制ROS和線粒體生物發(fā)生作用所必需的[22]。PGC-1α是細胞應激反應的關鍵調節(jié)因子，它可以由缺乏營養(yǎng)，能量缺失和氧化等原因所誘導，并在調節(jié)線粒體動力學，清除ROS和調控脂質代謝等方面發(fā)揮著舉足輕重的作用。PGC-1α相關通路在癌細胞中被激活，從而使它們獲得對抗治療的能力[23]，通常通過抑制PGC-1α會導致組織的損傷。

通過免疫組化檢測組織中PGC-1α的含量，結果見圖6，藍色為細胞核，棕色為PGC-1α蛋白染色。由圖6(a)可知：TP模型組睪丸組織中的PGC-1α表達量相較于正常組呈顯著性降低(P<0.001)，在正常組精母細胞附近PGC-1α的表達是最高的，其他細胞附近也有相對較高的表達。但是在TP模型組中，細胞結構發(fā)生了破壞，且在組織細胞中PGC-1α表達呈顯著性降低。該結果表明TP造成了PGC-1α的表達量下降，導致睪丸細胞暴露在過度氧化應激的反應條件下。由圖6(b)可知：TP模型組附睪組織中PGC-1α的表達量相較于正常組呈顯著性降低(P<0.001)，這表明TP不僅會降低睪丸中PGC-1α的表達量，還會降低附睪中PGC-1α的表達。綜上所述：TP的生殖毒性可能是通過抑制小鼠睪丸、附睪內的PGC-1α蛋白的表達，導致氧化還原失衡，從而導致睪丸細胞凋亡，附睪內的精子大面積喪失而造成的。

###為TP模型組與正常組相比較，P<0.001圖6 TP對睪丸組織和附睪組織中PGC-1α蛋白表達的影響Fig.6 Effects of TP on PGC-1α protein expression in testis and epididymis

2.6 TP對睪丸組織和附睪組織中8-OHdG的影響

Hruszkewycz等[24]和徐婷等[25]的研究表明：8-OHdG 可作為 DNA 氧化應激的診斷標志，且TP產生的ROS是導致組織產生毒性的主要原因。長期的TP干預會導致肝臟細胞凋亡率增加，線粒體去極化，ROS大量產生，ATP的產生減少和線粒體片段化等[26]。而通過抑制氧化應激反應可以改善TP造成的肝、腎毒性[27-28]。

8-OHdG作為DNA氧化損傷的標志物，其在組織中的含量水平可以反映組織DNA 氧化損傷的程度，同時也可側面反映出組織的氧化應激水平和ROS活性情況，結果見圖7。由圖7可知：通過免疫組化法來考察組織中8-OHdG含量，藍色為細胞核，棕色為8-OHdG染色。由圖7(a)可知：TP模型組中睪丸組織的8-OHdG的表達量相較于正常組呈顯著性增加(P<0.001)，在TP模型組中觀察到殘留的細胞中經8-OHdG染色的棕色較深。這說明在TP的毒性作用下，睪丸組織發(fā)生了嚴重的DNA氧化損傷。由圖7(b)可知：在附睪中，TP模型組8-OHdG的表達量相較于正常組呈顯著性升高(P<0.001)，模型組中附睪細胞的棕色較深，而正常組基本上沒有棕色。這說明在TP的毒性作用下，附睪組織細胞同樣發(fā)生了嚴重的DNA氧化損傷。

###為TP模型組與正常組相比較，P<0.001圖7 TP對睪丸組織和附睪組織中8-OHdG蛋白表達的影響Fig.7 Effects of TP on 8-OHdG protein expression in testis and epididymis

本實驗證明了TP造成的生殖毒性主要與氧化應激反應有關。細胞防御系統(tǒng)控制著一系列細胞保護性基因以抵消氧化應激反應。Nrf2是最著名的核轉錄家族成員之一，其主要的細胞保護作用是通過響應氧化反應和親電子應激反應實現(xiàn)的[29]。有研究中也證明了可以通過Nrf2通路來控制氧化應激水平，從而改善睪丸損傷造成的生殖功能障礙[30-31]。以上研究均揭示了可以通過控制生殖器官的氧化應激水平來抵御TP所產生的生殖毒性。并且還有研究指出以脂質體或者納米材料作為藥物載體, 可明顯減輕TP對生殖系統(tǒng)的毒性[32]。若兩者結合運用，對于TP在臨床上的應用將會是重大的進步。

3 結論

本研究發(fā)現(xiàn)TP在一定劑量下可以同時損傷睪丸和附睪，造成了不可逆的生殖毒性，即TP產生生殖毒性的靶器官可能是睪丸和附睪，而不是單一的某一個器官。

TP產生嚴重生殖毒性的可能作用機制是通過抑制PGC-1α的表達，從而導致了DNA的氧化損傷，影響了下游H2O2、MDA和GSH在機體中作用的發(fā)揮，從而誘導睪丸和附睪產生了嚴重的氧化應激反應，繼而造成了睪丸和附睪的損傷。

系統(tǒng)研究了TP對睪丸，附睪及精子的毒性作用，首次從PGC-1α方向探究了TP產生生殖毒性的可能機制，為進一步闡明該化合物的雄性生殖毒性提供了理論依據(jù)，并為其今后的臨床應用提供了需要改進的方向和數(shù)據(jù)支持。