肖池，何彩紅，王安鴿，譚中菊，趙新秀，廖俏云，李金優(yōu)，歸崎峰

1 杭州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，杭州310003；2 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科

舌苔是指覆蓋在舌背面上的一層苔狀物，主要由脫落的角化上皮、唾液、食物碎屑、細(xì)菌等組成。舌苔是中醫(yī)舌診的重要內(nèi)容，也是中醫(yī)臨床辨證不可缺少的客觀依據(jù)，能夠反映機(jī)體內(nèi)部的正邪斗爭、氣血盛衰、寒熱虛實(shí)[1]?，F(xiàn)階段，舌苔形成的機(jī)制是中醫(yī)現(xiàn)代化基礎(chǔ)研究的一個(gè)重要方向。舌苔微生態(tài)作為一個(gè)相對(duì)完整且獨(dú)立的微生態(tài)系統(tǒng)，因其在舌苔形成過程中具有重要作用而受到眾多學(xué)者關(guān)注[2-5]。研究證實(shí)，多種疾病可導(dǎo)致舌苔微生態(tài)發(fā)生顯著變化，而舌苔菌群變化能夠?yàn)橹嗅t(yī)病證診斷提供依據(jù)[1，6]。但目前在健康人群中舌苔與舌苔微生態(tài)關(guān)系的研究較少。本研究以健康成年人為研究對(duì)象，運(yùn)用高通量測序技術(shù)，觀察了不同舌苔類型舌苔微生態(tài)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，旨在從微生態(tài)學(xué)角度闡釋健康成年人不同舌苔類型的形成機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2019年6月—2020年10月在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院、紹興市越城區(qū)斗門鎮(zhèn)衛(wèi)生院和浙江古纖道綠色纖維有限公司體檢健康的成年志愿者79例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①身體狀態(tài)良好，無任何不適癥狀或體征；②年齡18～59歲；③取樣前1周保持正常飲食習(xí)慣；④人口學(xué)資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并高血壓、糖尿病、高脂血癥等基礎(chǔ)疾病者；②合并HBV、HCV、HIV等病毒感染者；③有胃腸道手術(shù)史者；④合并精神疾病者；⑤取樣前8周內(nèi)行口腔正畸手術(shù)者，或使用益生菌、益生元、合生元及抗生素者；⑥取樣前4周內(nèi)做過腸道準(zhǔn)備者。參照《中醫(yī)診斷學(xué)》、《中醫(yī)舌診圖譜》中舌苔分類標(biāo)準(zhǔn)，由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院一位經(jīng)驗(yàn)豐富的中醫(yī)師診查舌苔。根據(jù)舌苔質(zhì)地將研究對(duì)象分為膩苔組43例、薄苔組36例。其中，膩苔組男25例、女18例，平均年齡42歲，BMI(23.5±2.7)kg/m2，城鎮(zhèn)人口27例、農(nóng)村人口16例，有吸煙史12例，有飲酒史6例，黃膩苔22例、白膩苔21例；薄苔組男14例、女22例，平均年齡36歲，BMI(22.7±3.4)kg/m2，城鎮(zhèn)人口28例、農(nóng)村人口8例，有吸煙史7例，有飲酒史2例，薄白苔28例、薄黃苔8例。兩組性別、年齡、BMI、人口來源比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而有吸煙史和飲酒史比例比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院設(shè)計(jì)與實(shí)施，符合《赫爾辛基宣言(2013年版)》，并經(jīng)醫(yī)院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[批件號(hào)：(2019)科研快審第(1026)號(hào)]，所有研究對(duì)象知情同意并簽署書面知情同意書。

1.2 舌苔樣本收集與處理 留樣當(dāng)日，所有研究對(duì)象于清晨空腹、不刷牙狀態(tài)下，用兩根無菌棉簽在舌苔表面輕輕擦拭3次，將棉簽頭端折斷后置于2 mL凍存管中，1 h內(nèi)轉(zhuǎn)存于-80 ℃冰箱保存。舌苔樣本成批后送至北京諾禾致源科技股份有限公司檢測和分析。

1.3 基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增純化和文庫構(gòu)建 采用CTAB法提取樣本基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，提取的基因組DNA純度和濃度合格。取適量基因組DNA置于離心管中，用無菌水稀釋至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶barcode的特異引物，擴(kuò)增區(qū)域?yàn)?6sv34。引物序列：①341F：5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′；②806R：5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′。按Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：98 ℃ 1 min，98 ℃ 10 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離，目的條帶采用GeneJET凝膠回收試劑盒回收。采用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit構(gòu)建文庫，經(jīng)過Qubit和qPCR定量合格后，NovaSeq 6000測序系統(tǒng)測序。

1.4 生物信息學(xué)分析 測序數(shù)據(jù)經(jīng)Reads拼接得到原始Tags數(shù)據(jù)，嚴(yán)格過濾處理獲得高質(zhì)量Clean Tags數(shù)據(jù)，然后與物種注釋數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，最終得到有效的Tags數(shù)據(jù)。利用Uparse算法對(duì)有效的Tags數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，以97%的一致性將序列聚類成為操作分類單位(OTUs)，然后對(duì)OTUs序列進(jìn)行物種注釋，獲得分類學(xué)信息并分別在各個(gè)分類水平上統(tǒng)計(jì)各樣本的菌群組成，通過R軟件(Version 2.15.3)構(gòu)建Veen圖。采用Qiime軟件(Version 1.9.1)計(jì)算Chao1、ACE、Shannon、Simpson、Goods coverage和Observed species指數(shù)，然后用R軟件分析α多樣性指數(shù)的組間差異。采用Qiime軟件計(jì)算Weighted UniFrac距離，通過R軟件繪制主成分分析(PCA)圖和主坐標(biāo)分析(PCoA)圖并評(píng)估組間的β多樣性。采用線性判別分析效應(yīng)值(LEfSe)軟件分析LEfSe，設(shè)置線性判別分析(LDA)的篩選值為4。

2 結(jié)果

2.1 兩組舌苔微生物α、β多樣性分析 經(jīng)高通量測序分析，79例健康成年志愿者舌苔標(biāo)本中共檢出2 099個(gè)OTUs。其中，膩苔組和薄苔組共享的OTUs共1 233個(gè)，膩苔組和薄苔組獨(dú)有的OTUs分別為458、408個(gè)，兩組OTUs比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

α多樣性分析發(fā)現(xiàn)，膩苔組與薄苔組Chao1指數(shù)分別為345.13±82.15、349.02±88.44，ACE指數(shù)分別為348.96±82.46、352.35±91.45，Shannon指數(shù)分別為4.93±0.36、4.87±0.44，Simpson指數(shù)分別為0.93±0.02、0.92±0.04，Goods coverage指數(shù)分別為1.00±0.00、1.00±0.00，Observed species指數(shù)分別為287.33±60.02、286.58±69.80，兩組上述指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖1。

注：TF為薄苔組，GF為膩苔組；a為Chao1指數(shù)，b為ACE指數(shù)，c為Shannon指數(shù)，d為Simpson指數(shù)，e為Goods coverage指數(shù)，f為Observed species指數(shù)。

β多樣性分析發(fā)現(xiàn)，膩苔組與薄苔組菌群均傾向于聚集，提示兩組菌群結(jié)構(gòu)相似度較高。見插頁Ⅰ圖1。

2.2 兩組差異物種分析 LEfSe分布柱狀圖展示了LDA>4的差異物種，其中膩苔組放線菌綱、乳桿菌目、微球菌目和鏈球菌科是差異物種，而薄苔組紫單胞菌科是差異物種。見插頁Ⅰ圖2。

進(jìn)化分支圖同樣顯示了兩組間的差異物種，并且在由門至屬的分類級(jí)別上揭示了差異物種的所屬關(guān)系。見插頁Ⅰ圖3。

3 討論

舌苔作為口腔微生物的主要定植部位，其口腔微生物的數(shù)量和種類遠(yuǎn)高于口腔其他部位。因此，舌苔微生態(tài)成為口腔微生態(tài)研究的主要對(duì)象。此外，舌苔微生態(tài)還與中醫(yī)辨證施治密切相關(guān)[1]。根據(jù)張伯禮院士對(duì)6 708例健康人群舌苔類型的研究發(fā)現(xiàn)，健康人群舌苔類型以黃膩苔、白膩苔、薄白苔、薄黃苔最為常見，占95%以上[7]。本研究健康成年志愿者舌苔類型均為上述四種類型，與張伯禮等[7]研究結(jié)果吻合。本研究根據(jù)舌苔質(zhì)地將研究對(duì)象分為膩苔組和薄苔組，然后提取舌苔樣本基因組DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增純化和文庫構(gòu)建后進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組共享的OTUs共1 233個(gè)，膩苔組和薄苔組獨(dú)有的OTUs分別為458、408個(gè)，兩組OTUs比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；α多樣性分析發(fā)現(xiàn)，兩組Chao1、ACE、Shannon、Simpson、Goods coverage、Observed species指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；β多樣性分析亦顯示，兩組菌群均傾向于聚集，提示兩組菌群結(jié)構(gòu)相似度較高。結(jié)果表明健康人群的舌苔微生態(tài)相對(duì)穩(wěn)定，究其原因可能與舌具有一定的自潔作用有關(guān)[8]。但本研究通過LEfSe分析發(fā)現(xiàn)，兩組存在差異物種，其中膩苔組放線菌綱、乳桿菌目、微球菌目和鏈球菌科是差異物種，而薄苔組紫單胞菌科是差異物種，與既往文獻(xiàn)[9]報(bào)道基本一致。結(jié)果表明，不同舌苔類型的菌群結(jié)構(gòu)存在差異，而這些差異菌群可能在相應(yīng)的舌苔類型形成過程中起重要作用。

放線菌屬是人類口腔內(nèi)的優(yōu)勢菌群之一[10]。與非吸煙者比較，吸煙者口腔放線菌門富集，相對(duì)豐度較高[11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膩苔組放線菌綱富集明顯高于薄苔組，與國內(nèi)馬廣強(qiáng)等[9]研究結(jié)果一致，其原因可能與膩苔組有吸煙史比例高于薄苔組有關(guān)。國內(nèi)李華等[5]研究發(fā)現(xiàn)，放線菌屬豐度和舌苔的苔量、苔厚、苔膩呈明顯正相關(guān)關(guān)系。由此推測，放線菌有可能是形成膩苔的主要微生物因素之一，并且從舌苔微生態(tài)角度上也能更好地解釋吸煙可使舌苔變厚這一現(xiàn)象[12]。放線菌可能和人類某些疾病有一定聯(lián)系。有研究報(bào)道，糖尿病患者口腔放線菌檢出率明顯升高，放線菌有可能增加受檢者罹患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[13]。此外，放線菌還可通過口腔或牙齦傷口侵入組織內(nèi)部，在人體免疫力下降時(shí)易誘發(fā)慢性膿腫[14]。因此，健康人群出現(xiàn)膩苔可在一定程度上預(yù)示體內(nèi)潛在疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膩苔組乳桿菌目和鏈球菌科豐度明顯高于薄苔組。乳桿菌雖然是一種有益菌，但它也有對(duì)機(jī)體不利的一面。乳桿菌能夠與口腔中的鏈球菌一起使糖類發(fā)酵產(chǎn)生乳酸或其他酸類物質(zhì)，溶解牙釉質(zhì)，導(dǎo)致齲齒、牙周炎等口腔疾病[15]。王菁等[16]對(duì)口臭患者與健康志愿者舌背微生態(tài)的菌群結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，口臭患者舌苔微生態(tài)發(fā)生了顯著改變，其特有的細(xì)菌高達(dá)17種，其中鏈球菌檢出率最高。有研究報(bào)道，口臭、牙周炎等口腔疾病與舌苔厚度呈明顯正相關(guān)關(guān)系[17-18]。提示乳桿菌和鏈球菌可能通過口腔疾病導(dǎo)致膩苔形成。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，薄苔組紫單胞菌科豐度明顯高于膩苔組，與既往文獻(xiàn)[9]報(bào)道基本一致。紫單胞菌科屬于擬桿菌目，包括卟啉單胞菌屬、巴氏菌屬等，是人和動(dòng)物口腔、胃腸道的正常菌群，在維持口腔微生態(tài)平衡中具有重要作用。其中，卟啉單胞菌是一種小型厭氧革蘭陰性非運(yùn)動(dòng)球菌，作為正常菌群的一部分存在于人類口腔內(nèi)，對(duì)維持口腔健康具有重要作用[9]。正常人的舌苔由于口腔微生態(tài)穩(wěn)定，舌上皮細(xì)胞正常生長、分化且不存在明顯炎癥，這為薄白苔舌象形成奠定了基礎(chǔ)[19]。

綜上所述，健康成年人不同舌苔表象具有不同的舌苔微生態(tài)特征，其中放線菌綱、乳桿菌目、微球菌目和鏈球菌科是膩苔的差異物種，紫單胞菌科是薄苔的差異物種，這些菌群差異可能是不同舌苔類型形成的微生態(tài)基礎(chǔ)。但本研究還存在一定局限性，如僅比較了薄苔和膩苔的微生態(tài)差異，對(duì)更加細(xì)化的舌苔類型未進(jìn)一步探討，中醫(yī)辨證和舌苔微生態(tài)的關(guān)系亦未闡明；只評(píng)估了舌苔的微生態(tài)特征，而對(duì)兩者相互作用的機(jī)制未進(jìn)一步闡明；未進(jìn)行吸煙、飲酒、運(yùn)動(dòng)、飲食等因素對(duì)舌苔及其微生態(tài)的共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。