張妙心，周琦

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科，武漢430030

Epstein-Barr病毒(EBV)是第一個被發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)的DNA病毒。據(jù)估計，EBV相關(guān)腫瘤每年新發(fā)病例約200 000例，每年死亡病例約占全部惡性腫瘤死亡病例的1.8%[1]。EBV可導(dǎo)致多種細(xì)胞來源的腫瘤，包括B細(xì)胞來源的Burkitt淋巴瘤、經(jīng)典霍奇金淋巴瘤、B細(xì)胞淋巴瘤等，NK/T細(xì)胞來源的鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤，上皮細(xì)胞來源的鼻咽癌、胃腺癌以及間葉細(xì)胞來源的平滑肌肉瘤[2]。EBV相關(guān)胃癌(EBVaGC)約占所有胃癌總數(shù)的8.7%[3]。自1990年有學(xué)者首次在胃癌組織中檢測到EBV后，EBV在胃癌發(fā)病機(jī)制中的作用逐漸受到重視。EBVaGC是一種具有獨特臨床病理特征的胃癌亞型，好發(fā)于男性，近端胃或殘胃多見，但其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較低，預(yù)后相對較好[4-5]。近年來，越來越多研究關(guān)注到EBVaGC的發(fā)病機(jī)制。本文結(jié)合文獻(xiàn)就EBVaGC發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展作一綜述。

1 EBVaGC發(fā)生的始動因素

EBV感染在全球范圍內(nèi)普遍存在，90%以上的成人EBV相關(guān)抗體呈陽性[2]。EBV主要通過唾液傳播，首次感染后在口咽部上皮細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制，隨著脫落的上皮細(xì)胞釋放病毒顆粒，感染B細(xì)胞及其他細(xì)胞，誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答，激活NK細(xì)胞，產(chǎn)生EBV特異性CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞，抑制EBV感染的B細(xì)胞增殖，最終清除EBV感染的B細(xì)胞，僅于部分記憶B細(xì)胞內(nèi)持續(xù)存在甚至終身潛伏感染[4]。

EBV感染B細(xì)胞的過程十分高效，而在CD21陰性的胃黏膜上皮細(xì)胞中直接感染的概率很低。因此，EBV感染胃黏膜上皮細(xì)胞主要依賴胃內(nèi)感染EBV的記憶B細(xì)胞與胃黏膜上皮細(xì)胞的直接接觸，其過程大體可分為三個階段：首先，CD21介導(dǎo)的EBV與B細(xì)胞整聯(lián)蛋白的共成帽反應(yīng)激活黏連蛋白；其次，EBV感染的記憶B細(xì)胞通過黏連蛋白與上皮細(xì)胞形成偶聯(lián)；最后，細(xì)胞融合以及病毒顆粒攝入[6]。

盡管90%以上的成年人為EBV攜帶者，但EBV感染極少見于非腫瘤胃黏膜上皮細(xì)胞，而幾乎所有腫瘤細(xì)胞中可檢測到單克隆EBV，提示EBV感染建立于胃癌發(fā)生的早期階段[2]。因此，EBVaGC可能是在伴有癌前狀態(tài)基因變異的上皮細(xì)胞中建立異常EBV潛伏感染導(dǎo)致的。

EBV感染后基因表達(dá)模式包括Latency Ⅰ～Ⅲ。Latency Ⅰ主要表達(dá)核抗原EBNA1、非編碼RNA EBERs及miRNAs(以miR-BARTs為主)；Latency Ⅱ主要表達(dá)EBNA1、LMP1、LMP2A/2B、EBERs及miR-BARTs；LatencyⅢ表達(dá)所有潛伏基因。EBV是第一個被發(fā)現(xiàn)可編碼miRNAs的人類病毒[2]。在EBVaGC中，EBV潛伏感染模式為Latency Ⅰ或介于Latency Ⅰ與Latency Ⅱ，其潛伏基因產(chǎn)物包括EBERs、EBNA1、miR-BARTs，不表達(dá)或低表達(dá)LMP1、LMP2B[7]。此外，EBV還可引起宿主細(xì)胞DNA甲基化，導(dǎo)致宿主細(xì)胞基因異常表達(dá)和細(xì)胞信號通路失衡，從而誘導(dǎo)EBVaGC的發(fā)生[8]。

2 潛伏基因產(chǎn)物在EBVaGC發(fā)生中的作用

2.1 EBERs EBERs屬于EBV轉(zhuǎn)錄的非編碼RNA，包括EBER1、EBER2。盡管在EBVaGC中EBERs表達(dá)豐富，但目前其在腫瘤發(fā)生中的作用仍不明確。IWAKIRI等[9]研究發(fā)現(xiàn)，EBERs能夠上調(diào)胰島素樣生長因子1表達(dá)，促進(jìn)EBV陰性胃癌細(xì)胞增殖。EBERs還可激活I(lǐng)L-6/STAT3信號通路，使腫瘤細(xì)胞更易發(fā)生耐藥和遷移[10]。

2.2 EBNA1 EBNA1對于EBV潛伏感染的建立具有重要作用。在宿主細(xì)胞中，EBNA1與EBV DNA結(jié)合，可穩(wěn)定EBV基因組，使EBV基因組以游離環(huán)狀DNA分子的形式持續(xù)存在，從而維持EBV潛伏感染狀態(tài)。在胃癌細(xì)胞中，EBNA1可引起活性氧自由基累積，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞活性[11]；EBNA1還可通過DNA甲基化抑制胃癌特異性抑制基因GKN1、GKN2表達(dá)[12]。因此，通過抑制EBNA1表達(dá)，避免EBV穩(wěn)定感染建立，有可能成為EBVaGC的治療策略之一。

2.3 LMP2A LMP2A在EBVaGC特征性DNA甲基化過程中具有重要作用。胞嘧啶甲基化反應(yīng)由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶完成。LMP2A可通過引起STAT3磷酸化誘導(dǎo)DNMT1過表達(dá)，繼而引起抑癌基因PTEN啟動子甲基化[13]。LMP2A還可誘導(dǎo)ERK磷酸化，激活DNMT3a轉(zhuǎn)錄，引起AQP3啟動子甲基化并下調(diào)AQP3表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[14]。此外，LMP2A還能抑制TET2表達(dá)，削弱其對DNA甲基化的防御作用[15]。

miR-200表達(dá)下調(diào)是EBVaGC發(fā)生的重要機(jī)制之一。LMP2A可抑制miR-200表達(dá)，使其靶點CDH1的轉(zhuǎn)錄抑制物ZEB1、ZEB2表達(dá)增加，CDH1表達(dá)丟失，其所編碼的E-cadherin表達(dá)下調(diào)，繼而引起腫瘤轉(zhuǎn)移。此外，BRAF0、EBNA1、EBERs對miR-200表達(dá)亦具有一定抑制作用[16]。但EBV感染能否導(dǎo)致宿主miRNAs表達(dá)下調(diào)仍需更多證據(jù)。

YASUI等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在EBVaGC細(xì)胞系中，LMP2A可激活NF-κB-Survivin信號通路，上調(diào)Survivin表達(dá)從而起到抗細(xì)胞凋亡作用。胃癌細(xì)胞核內(nèi)NF-κB信號激活還可提高miR-155-5p表達(dá)，從而下調(diào)Smad2、p-Smad2表達(dá)，后者在轉(zhuǎn)化生長因子β轉(zhuǎn)錄中具有重要作用[18]。QI等[19]研究發(fā)現(xiàn)，LMP2A、LMP1過表達(dá)可使TRAF2水平降低，從而抑制COX-2表達(dá)，而p-ERK可協(xié)助LMP1發(fā)揮抑制COX-2表達(dá)的作用。此外，LMP2A還能影響其他腫瘤相關(guān)基因表達(dá)，如抑制HLA表達(dá)和上調(diào)FOXO1、FOXO3表達(dá)[20]。由此可見，LMP2A能夠通過影響多個信號通路，激活甲基化反應(yīng)，導(dǎo)致癌基因或抑癌基因異常表達(dá)，從而促進(jìn)EBVaGC的發(fā)生、發(fā)展。

2.4 miR-BARTs 所有EBV感染的宿主細(xì)胞存在miR-BARTs表達(dá)。在EBVaGC組織中，已明確有40種成熟miR-BARTs表達(dá)。既往研究著重于miRNAs在鼻咽癌中的作用，近年來探索miR-BARTs在EBVaGC發(fā)生中作用的研究逐漸增多。SHINOZAKI-USHIKU等[21]研究發(fā)現(xiàn)，miR-BART4-5p可下調(diào)EBV陽性胃癌細(xì)胞Bid表達(dá)，從而起到抗細(xì)胞凋亡作用。ZHENG等[22]研究表明，miR-BART5-3p可直接靶向抑制抑癌基因TP53，下調(diào)細(xì)胞周期抑制物p21表達(dá)，從而使宿主細(xì)胞不易凋亡，繼而促進(jìn)腫瘤發(fā)生。miR-BART3-3p具有相似的作用，可通過調(diào)節(jié)SASP表達(dá)抑制腫瘤組織NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤，協(xié)助胃癌細(xì)胞免疫逃逸[23]。miR-BART11可抑制FOXP1表達(dá)，促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[24]。miR-BART10-3p和miR-BART22可激活Wnt信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移[25]。miR-BART17-5p能夠通過調(diào)節(jié)KLF2表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞非貼壁生長和遷移。在鼻咽癌細(xì)胞中，miR-BART7-3p可抑制SMAD7表達(dá)，而SMAD7表達(dá)變化與腫瘤細(xì)胞遷移和耐藥性密切相關(guān)[26]，但在EBVaGC細(xì)胞中鮮見此類報道。部分miR-BARTs可下調(diào)凋亡前蛋白表達(dá)，從而起到抑制細(xì)胞凋亡作用[8]。

BARF1通常在溶解性感染中表達(dá)，但在EBVaGC中亦可檢測到表達(dá)。在胃癌細(xì)胞中，BARF1可上調(diào)Bcl-2表達(dá)、抑制Bax表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞可以抵抗化療藥物引起的細(xì)胞凋亡；BARF1可激活NF-κB-Cyclin D1信號通路，促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖并抑制p21表達(dá)[27]。

在EBVaGC細(xì)胞系中，部分外泌體中富含miR-BARTs，但僅部分釋放至細(xì)胞內(nèi)，以miR-BART15-5p為主。miR-BART15-5p能夠通過調(diào)節(jié)NLRP3表達(dá)而抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤生長；同時，miR-BART15-5p能夠靶向抑制抗凋亡蛋白BRUCE、TAX1BP1表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[28]。因此，miR-BART15-5p可通過外泌體釋放，引起腫瘤細(xì)胞和周圍免疫細(xì)胞凋亡。但外泌體在EBVaGC發(fā)生中的作用仍需進(jìn)一步研究。

EBV miRNAs不僅能夠影響宿主基因表達(dá)，還能下調(diào)自身潛伏基因表達(dá)，干擾抗原提呈和免疫細(xì)胞激活，從而實現(xiàn)免疫逃逸[29]。

3 DNA甲基化在EBVaGC發(fā)生中的作用

EBVaGC的主要分子異常表現(xiàn)為非隨機(jī)CpG島甲基化表型[5]。KANEDA等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在低甲基化胃癌細(xì)胞系中EBV感染可在18周內(nèi)導(dǎo)致其新發(fā)甲基化，使其轉(zhuǎn)化為EBV陽性極高的甲基化細(xì)胞系并抑制多種抑癌基因表達(dá)。EBV還可影響細(xì)胞周期相關(guān)基因和細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)[31]。

LIANG等[32]在EBVaGC細(xì)胞中共發(fā)現(xiàn)216種基因由于甲基化而表達(dá)受抑。ZHAO等[33]研究明確了EBV陽性AGS細(xì)胞系中886種與腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因，并且其啟動子均發(fā)生甲基化。其中，PIK3CA和ARID1A基因啟動子甲基化比例最高。約80% EBVaGC細(xì)胞可見PIK3CA基因變異，而在其他胃癌亞型中僅為3%～42%[5]。ARID1A基因變異在EBVaGC細(xì)胞中的發(fā)生率約為55%，該基因表達(dá)受抑可導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)下調(diào)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。在非瘤變的胃黏膜細(xì)胞中亦可見到ARID1A基因變異，提示此類細(xì)胞有可能是EBVaGC發(fā)生的先驅(qū)細(xì)胞[34]。EBV相關(guān)腫瘤均存在CDKN2A啟動子甲基化表達(dá)，其表達(dá)可導(dǎo)致抑癌基因p16表達(dá)缺失[30]。此外，在EBVaGC細(xì)胞中缺乏MLH1甲基化表達(dá)，這是區(qū)分EBVaGC與微衛(wèi)星不穩(wěn)定型胃癌的重要依據(jù)[5]。

除了上述代表性基因變異外，在EBVaGC中與減數(shù)分裂相關(guān)的抑癌基因Rec8啟動子甲基化水平高于其他無EBV感染的胃癌亞型，并且其啟動子甲基化水平與患者預(yù)后密切相關(guān)[35]。ZHAO等[36]研究發(fā)現(xiàn)，在EBVaGC細(xì)胞中SSTR1基因可出現(xiàn)甲基化，SSTR1基因有可能是一種潛在的抑癌基因。5-氮雜胞嘧啶具有DNA去甲基化作用。SCHINEIDER等[37]研究發(fā)現(xiàn)，化療前使用5-氮雜胞嘧啶可重新激活抑癌基因，增強(qiáng)化療效果，提示去甲基化可能在EBVaGC治療中發(fā)揮重要作用。

除了宿主細(xì)胞DNA甲基化外，EBV病毒DNA亦可發(fā)生甲基化，以逃避免疫識別和應(yīng)答，維持潛伏感染狀態(tài)。MATSUSAKA等[31]研究發(fā)現(xiàn)，病毒DNA甲基化通常于感染后17天完成，而潛伏基因表達(dá)產(chǎn)物可在感染后10天被檢測到。由此推測，病毒DNA甲基化始于潛伏基因表達(dá)之后。

4 免疫逃逸在EBVaGC發(fā)生中的作用

約15% EBVaGC可見CD274和PDCD1LG2表達(dá)增加。CD274和PDCD1LG2分別編碼PD-L1、PD-L2，二者均為免疫抑制蛋白，可抑制T細(xì)胞激活[5]。由此推測，CD274和PDCD1LG2在EBVaGC免疫逃逸中具有重要作用。目前，以PD-1/PD-L1為靶點的免疫治療已進(jìn)行了多項臨床試驗，療效顯著，可能對EBVaGC治療有效。

EBVaGC具有特征性微環(huán)境，如聚集大量CD8+T細(xì)胞、低密度CD204和M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，還存在少量具有抗腫瘤作用的CD66b+中性粒細(xì)胞。然而，EBVaGC細(xì)胞可表達(dá)大量吲哚胺2，3-雙加氧酶，可造成T細(xì)胞合成代謝所必需的色氨酸耗竭[38]。此外，EBV還可產(chǎn)生CCL22，使腫瘤部位聚集Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，抑制CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤作用。ABE等[39]研究發(fā)現(xiàn)，在固有免疫中CD47“do not eat me”信號在24% EBVaGC中表達(dá)，并伴有CD8∶Foxp3減小，提示在EBVaGC中CD47可通過封鎖適應(yīng)性免疫來發(fā)揮作用。

綜上所述，EBV在伴有癌前狀態(tài)的胃黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)建立異常潛伏感染，誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境逃避免疫清除，并通過潛伏基因產(chǎn)物引起宿主DNA甲基化，導(dǎo)致相關(guān)基因異常表達(dá)，從而引起EBVaGC發(fā)生。