蔡穎峰，張家偉，鐘曉剛

1 右江民族醫(yī)學院研究生學院，廣西百色533000；2 廣西醫(yī)科大學研究生院；3 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院結直腸肛門外科

結直腸癌是全球第三大常見惡性腫瘤，也是惡性腫瘤相關死亡的第二大原因[1]。早診斷、早治療是改善結直腸癌患者預后、減輕人群疾病負擔的關鍵所在。TNM分期是目前評估結直腸癌患者預后最常用的手段，也是選擇治療方案的基礎。然而，TNM分期相同的結直腸癌患者經歷相同或相似的治療方案后，臨床結局卻存在顯著差別[2]。如大多數(shù)處于TNM分期Ⅱ期的結直腸癌患者在不使用輔助治療的情況下，手術切除即可獲得長期無病生存，但約20%患者需要輔助治療才能獲益，甚至部分晚期患者預后好于早期患者[3]。提示TNM分期在預測結直腸癌預后方面存在局限性，其原因是TNM分期只關注腫瘤細胞的特征，而忽略腫瘤微環(huán)境和免疫成分的影響，不能全面精確地預測結直腸癌患者預后。有研究報道，腫瘤微環(huán)境內宿主細胞的相互作用，如免疫細胞浸潤，在腫瘤進展過程中具有至關重要的作用，與患者預后密切相關[4]。近年來，有學者提出了一種名為“免疫評分(IS)”的腫瘤預后評估新方法，通過免疫組化技術將腫瘤微環(huán)境中浸潤的免疫細胞進行定量，以此來預測腫瘤患者生存期，并被證實對結直腸癌患者預后的預測效能優(yōu)于TNM分期[5]。本文結合文獻就IS在結直腸癌預后評估中應用的研究進展作一綜述。

1 IS概述

腫瘤微環(huán)境是腫瘤細胞賴以生存的內環(huán)境，由腫瘤細胞、免疫細胞、血管內皮細胞、成纖維細胞、細胞因子、趨化因子和細胞代謝產物等構成。免疫細胞是腫瘤病變局部主要的細胞成分，在機體對抗腫瘤過程中發(fā)揮重要作用[6]。免疫細胞中的腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)主要存在于腫瘤間質內，是腫瘤免疫反應的主要參與者。TILs是腫瘤微環(huán)境中最主要的免疫細胞，在免疫監(jiān)視和免疫耐受中具有重要作用。有學者通過分析獲得性免疫細胞在不同腫瘤區(qū)域的類型、功能、密度和位置，發(fā)現(xiàn)其與腫瘤預后密切相關，于是提出了“免疫結構”這一概念，用來描述腫瘤微環(huán)境。免疫結構包括腫瘤中心(CT)和侵襲邊緣(IM)的細胞毒性T淋巴細胞(CD8+)、記憶性T淋巴細胞(CD45RO+)，三級淋巴結構(TLS)以及一些功能分子，如Th1型細胞因子、趨化因子、黏附分子和細胞毒性因子[7]。隨后GALON等[8]通過免疫組化技術觀察了415例結腸癌患者CT和IM的原位適應性免疫反應，然后采用病理圖像分析儀器對免疫細胞CD3+、CD8+、GZMB+、CD45RO+的免疫染色進行定量，發(fā)現(xiàn)未復發(fā)患者CT和IM的免疫細胞密度(CD3+、CD8+、GZMB+和CD45RO+)均高于復發(fā)患者，并且CD3+、CD8+、CD45RO+T淋巴細胞高密度與較長的無病生存期(DFS)和總生存期(OS)密切相關。

基于上述理論，GALON等[9]提出了“IS”這一概念，通過量化腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的密度來預測患者預后，并最先在結直腸癌患者中展開研究。一個國際共識小組就IS的預測效能進行研究發(fā)現(xiàn)，由CD3+、CD8+、CD45RO+、GZMB+T淋巴細胞密度等組成的IS是評估患者預后最好的方法。由于CD45RO背景染色和GZMB顆粒染色技術困難，故而采用最簡單的膜染色(CD3+和CD8+)，并且這兩個標記物在CT和IM區(qū)域的應用已在臨床實踐中得到驗證[10]。IS的具體方法：首先對同時包含CT和IM區(qū)域的腫瘤組織進行切片，分別對切片進行CD3、CD8免疫組化染色；然后通過IS分析系統(tǒng)進行圖像分析，精確定量CT和IM區(qū)域的CD3+、CD8+TILs密度，確定最佳臨界值并劃分為高密度和低密度，高密度為1分、低密度為0分；最后將CD3+、CD8+TILs密度在CT和IM區(qū)域的評分相加，即得到IS(總分0～4分)。IS除了在結直腸癌患者預后預測中具有重要的應用價值外，在預測治療效果方面亦同樣具有重要價值。

2 IS在結直腸癌預后評估中的應用

2.1 IS在非轉移性結直腸癌中的應用 為了促進IS在非轉移性結直腸癌中的應用，一項由癌癥免疫治療協(xié)會牽頭的，由13個國家14個中心合作完成的，主要評估IS對TNM分期Ⅰ～Ⅲ期結腸癌患者復發(fā)時間(TTR)的預測價值。該研究2 681例結腸癌患者被隨機分配到訓練集700例、內部驗證集636例和外部驗證集1 345例，對每例患者CT和IM區(qū)域石蠟切片進行免疫組化處理后，定量檢測CD3+、CD8+TILs密度。結果發(fā)現(xiàn)，在訓練集中，高、中、低IS的結腸癌患者5年復發(fā)率分別為8%、19%、32%，高IS的結腸癌患者5年復發(fā)風險最低，并且這一結論在內、外部驗證集中均得到驗證[11]。這一結果表明，在評估結腸癌患者TTR、DFS和OS的準確性方面，IS顯著優(yōu)于TNM分期。一項關于IS在TNM分期Ⅲ期結腸癌患者預后預測價值的隊列研究，評估了來自隊列1(加拿大、美國)和隊列2(歐洲、亞洲)的763例TNM分期Ⅲ期結腸癌患者的IS，主要觀察終點是TTR，次要觀察終點為OS、DFS、微衛(wèi)星穩(wěn)定狀態(tài)(MSS)患者預后以及對化療效果的預測價值。結果發(fā)現(xiàn)，低、中、高IS的結腸癌患者3年無復發(fā)率分別為56.9%、65.9%、76.4%，高IS與結腸癌患者較長的TTR、OS和DFS顯著相關，在MSS患者中亦發(fā)現(xiàn)高IS與較長的TTR顯著相關；接受化療的結腸癌患者5年復發(fā)率為32.3%，未接受化療患者為50.6%，并且無論是低?；颊哌€是高?；颊?，化療與高IS的結腸癌患者存活率顯著相關，就復發(fā)風險而言，高IS的結腸癌患者在化療中獲益最大[12]。上述研究結果表明，IS不僅可預測結腸癌患者預后，還能預測患者對化療的反應。此外，一項對TNM分期Ⅲ期結腸癌患者進行為期3、6個月的mFOLFOX(氟尿嘧啶/亞葉酸鈣+奧沙利鉑)輔助化療發(fā)現(xiàn)，6個月療程的mFOLFOX化療方案效果要優(yōu)于3個月療程的該化療方案[13]。在此基礎上，PAGES等[14]對1 322例TNM分期Ⅲ期結腸癌患者進行IS，結果發(fā)現(xiàn)中、高IS的結腸癌患者在6個月療程的mFOLFOX化療方案中獲益明顯，包括低危和高危的結腸癌患者；而低IS的結腸癌患者在3、6個月療程的mFOLFOX化療方案中均未明顯獲益。由此可見，IS可用于優(yōu)化TNM分期Ⅲ期結腸癌患者的輔助治療決策。

2.2 IS在轉移性結直腸癌中的應用 約50%結直腸癌患者在就診時已發(fā)生肝轉移,并且肝切除術后超過一半患者在兩年內復發(fā)，這些復發(fā)患者的5年存活率只有37%～58%[15]。目前，臨床風險評分(CRS)、IS等評分系統(tǒng)已被廣泛用于預測結直腸癌肝轉移(CRLM)患者預后。在可切除的CRLM患者中，腫瘤細胞與周圍肝實質交界面的組織病理學生長模式(HGP)主要有3種：促結締組織增生型HGP(dHGP)、替換型HGP(rHGP)、推進型HGP(pHGP)。其中，dHGP在促結締組織增生邊緣和正常肝臟的交界處通?？捎^察到密集的淋巴細胞浸潤，肝切除術后患者預后良好[16]。LIANG等[17]對166例CRLM患者HE染色切片中的HGP進行評估后發(fā)現(xiàn)，dHGP患者CT和IM區(qū)域中浸潤的CD3+、CD8+TILs密度高于非dHGP，并且dHGP患者無復發(fā)生存期(RFS)、OS較非dHGP患者明顯延長，dHGP是獨立于IS和CRS的CRLM患者有利預后因素。聯(lián)合HGP、IS和CRS的風險評分能夠對肝切除術后CRLM患者的生存狀況進行分層，可作為一種預測CRLM患者預后的指標。BALDIN等[18]對221例不同術前治療的CRLM患者臨床病理特征和IS進行評估，在多變量分析中發(fā)現(xiàn)，IS和淋巴結轉移數(shù)目、手術切緣、HGP和脂肪性肝炎等臨床病理特征與患者術后復發(fā)有關。低病理學評分(PS)和高IS的CRLM患者復發(fā)風險最低，而高PS和低IS的CRLM患者預后最差。無論PS如何，高IS的CRLM患者較低IS的CRLM患者生存期明顯延長。結合PS和IS可以對TNM分期Ⅳ期結直腸癌患者預后進行分層，并識別復發(fā)風險較高的患者。WANG等[19]對249例CRLM患者進行IS，結果發(fā)現(xiàn)IS>2分的CRLM患者RFS和OS較IS≤2分的CRLM患者明顯延長。利用ROC曲線評估CRS和IS對預后預測的價值，結果發(fā)現(xiàn)IS在預測OS方面較CRS顯示出更高的價值。IS可作為CRS的補充，用于預測肝切除術后CRLM患者預后。VAN DEN EYNDE等[20]對轉移瘤和原發(fā)性結直腸腫瘤的免疫細胞類型進行量化發(fā)現(xiàn)，小的轉移瘤通常IS較低，而IS高的患者淋巴結轉移數(shù)量較少；較高的IS與患者較長的生存期和較低的復發(fā)率顯著相關。

腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)是腫瘤浸潤性免疫細胞的另一個組成部分，對腫瘤微環(huán)境形成具有重要作用[21]。當巨噬細胞在腫瘤微環(huán)境中被激活時，被極化成M1、M2型。M2型巨噬細胞可產生血管生成因子和細胞生長因子，形成有利于腫瘤生長的環(huán)境[22]。KWAK等[23]采用免疫組化技術和數(shù)字圖像分析儀對196例晚期結直腸癌患者石蠟包埋組織的原發(fā)灶CT、IM和遠處轉移灶(DM)進行檢測，通過量化結直腸癌原發(fā)灶CT和IM中CD3+、CD8+TILs密度獲得IS，分別在IS中加入DM的CD3+、CD8+TILs評分以及原發(fā)灶CT和IM的M2型巨噬細胞標志物CD163評分，得到IS-轉移性模型(IS-M)和IS-巨噬細胞—附加性IS模型(IS-ma)。結果發(fā)現(xiàn)，IS、IS-M和IS-ma評分越高，晚期結直腸癌患者生存率越高，預后越好；多因素分析顯示，只有IS-M是結直腸癌預后的獨立預測指標。包含DM CD3+、CD8+TILs密度的IS-M預測晚期結直腸癌患者預后的效能要優(yōu)于IS或IS-ma。對于轉移性結直腸癌患者，RAS突變通常被用作抗EGFR治療效果的重要預測因子。LIU等[24]檢測了60例接受姑息性手術的轉移性結直腸癌患者的RAS突變、IS和PD-L1表達，結果發(fā)現(xiàn)在高IS患者中，RAS野生型患者預后相對較好；Kaplan-Meier生存分析顯示，RAS野生型患者OS長于RAS突變型患者，PD-L1高表達的RAS野生型患者預后更好。對于接受姑息性手術且PD-L1陰性表達的轉移性結直腸癌患者，RAS突變是預后不良的一個重要因素。聯(lián)合IS、PD-L1表達和RAS突變狀態(tài)可作為接受姑息性手術后轉移性結直腸癌患者預后的預測指標。因此，IS可作為預測轉移性結直腸癌患者預后的生物標志物。

2.3 IS在結直腸癌生物標記物中的應用 伴微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI)的結直腸癌有較高的免疫細胞浸潤，可預示患者預后較好。有研究發(fā)現(xiàn)，IS在預測結直腸癌復發(fā)和生存方面要優(yōu)于MSI。通過IS對免疫狀態(tài)的評估提供了一個超越MSI預測腫瘤復發(fā)的有效指標，這可能對免疫治療選擇具有重要的指導意義[5]。MSI通常是由一組微衛(wèi)星標記決定，其本質一般是單核苷酸，而在四核苷酸的微衛(wèi)星中發(fā)現(xiàn)了另一種MSI形式，并命名為EMAST[25]。EMAST在體外與錯配修復(MMR)特異性成員MSH3表達下調有關，而MSH3能夠參與MMR中長內陷的修復[26]。WATSON等[27]篩選了149例接受手術治療的TNM分期Ⅰ～Ⅲ期結直腸癌患者，通過免疫組化技術和PCR技術分析這些患者PD-L1、EMAST表達并結合IS進行分析，結果發(fā)現(xiàn)EMAST陽性患者擁有較高的IS和PD-L1表達，并且EMAST陽性患者DFS、疾病特異性生存期(DSS)、OS明顯延長。IS和PD-L1表達均較低的腫瘤在腫瘤微環(huán)境中缺乏免疫反應，并且復發(fā)率更高，復發(fā)時間更早。在MSI中結合IS能夠更好地預測結直腸癌患者生存期。Claudins是參與緊密連接形成的完整膜蛋白，具有調節(jié)上皮細胞增殖、分化和遷移等作用，其在各種惡性上皮性腫瘤中表達上調[28]。有研究發(fā)現(xiàn)，高IS的結直腸癌患者Claudin-1表達缺失率明顯降低，Claudin-1表達缺失的結直腸癌患者比存在Claudin-1表達的結直腸癌患者預后更差，故Claudin-1表達缺失可用于預測結直腸癌患者預后[29]。腫瘤微環(huán)境能夠影響腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移。腫瘤進展位點2(TPL2)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，能夠通過激活細胞外信號調節(jié)激酶/絲裂原活化蛋白激酶通路來調節(jié)細胞增殖、侵襲和遷移等[30]。TPL2可能通過與腫瘤相關的炎癥反應參與腫瘤侵襲和轉移。PYO等[31]對262例結直腸癌患者構建組織芯片，檢測TPL2表達并評估IS，結果發(fā)現(xiàn)TPL2高表達者比TPL2低表達者更易發(fā)生遠處轉移，TPL2高表達與結直腸癌患者較差的生存期和低IS有關。結果表明，TPL2表達可作為判斷結直腸癌患者預后的指標之一，并有可能成為免疫治療的一個重要靶點。一項分析程序性死亡蛋白配體2(PD-L2)在結直腸癌組織表達和預后作用中的研究，通過IS來評估TILs對PD-L2表達的影響，結果發(fā)現(xiàn)在免疫細胞中PD-L2表達與良好的腫瘤生物學行為和較高的生存率顯著相關；免疫細胞PD-L2表達和PD-L1表達呈正相關關系；高IS的結直腸癌患者免疫細胞PD-L2表達明顯高于低IS的結直腸癌患者，但高IS的結直腸癌患者腫瘤細胞PD-L2表達并不高于低IS的結直腸癌患者[32]。免疫細胞存在PD-L2表達的結直腸癌患者，無論是低pTNM分期還是高pTNM分期，預后均較好。免疫細胞PD-L2表達是結直腸癌患者預后較好的獨立預測因子，是一個潛在的治療靶點。以上研究表明，評估免疫狀態(tài)的IS能夠協(xié)助發(fā)現(xiàn)與結直腸癌預后相關的生物標記物以及挖掘潛在的治療靶點。

2.4 IS結合其他技術在結直腸癌中的應用 由于IS只計算CD3+、CD8+TILs密度，并不能全面反映腫瘤局部免疫狀況，需要結合其他技術來完善IS。越來越多研究者采用CIBERSORT算法來評估免疫微環(huán)境，通過從組織樣本中提取RNA測序數(shù)據(jù)來分析免疫細胞組分[33]。WANG等[34]應用CIBERSORT算法最終選取了13種免疫細胞來構建新型IS模型，將875例結直腸癌患者按7∶3分配到訓練集和測試集，結果發(fā)現(xiàn)在訓練集和測試集中高新型IS的結直腸癌患者RFS明顯低于低新型IS的結直腸癌患者；多變量Cox回歸分析顯示，新型IS是結直腸癌患者RFS的獨立預測因子。該新型IS為結直腸癌患者無復發(fā)評估和風險分層提供了新的見解。人工智能可用于分析虛擬顯微圖像，并以較高的準確性來判斷患者預后和腫瘤分子特征[35]。REICHLING等[36]研發(fā)了一個人工智能軟件，對1 018例PETACC08隊列TNM分期Ⅲ期結腸癌患者CD3、CD8染色玻片上的CT和IM區(qū)域T淋巴細胞密度和表面積自動定量，結果發(fā)現(xiàn)CT區(qū)域CD3+T淋巴細胞密度對患者預后的預測價值與經典的IS相似。將IM區(qū)域間質面積、DGMate(數(shù)字腫瘤參數(shù))和CT區(qū)域CD3+T淋巴細胞密度組合，并命名為DGMuneS，其在評估患者預后效能方面優(yōu)于IS。結果表明，在結直腸癌患者預后中，腫瘤基質和腫瘤細胞的內在變量以及與免疫細胞浸潤相關的因素均應被考慮在內。DAWSON等[37]定義了一種新的評分方法——腫瘤出芽/T淋巴細胞評分(BTS)，即腫瘤出芽數(shù)除以T淋巴細胞數(shù)量，對345例TNM分期Ⅰ～Ⅳ期結直腸癌患者腫瘤組織芯片進行全細胞角蛋白及分別與CD3、CD8、CD45RO雙重免疫組化染色，結果發(fā)現(xiàn)在預測淋巴結轉移方面，較高的BTS比腫瘤出芽或CD8/CD3單獨預測淋巴結轉移的效果更好。因此，在IS基礎上結合其他技術有望提高結直腸癌患者預后評估的準確性。

綜上所述，IS是一種方便、快捷、穩(wěn)定、經濟的結直腸癌預后預測方法，其預后預測效能優(yōu)于TNM分期。IS不僅可用于預測非轉移性或轉移性結直腸癌患者預后，還可用于預測免疫治療或輔助化療效果，指導個體化精準治療策略。此外，IS還能協(xié)助發(fā)現(xiàn)與結直腸癌預后相關的生物標記物以及挖掘潛在的治療靶點。不斷地探索IS結合其他新技術，能夠彌補IS的不足，未來期望能夠優(yōu)化出一個綜合考慮腫瘤內環(huán)境各項因素的預后評分系統(tǒng)。目前，IS已被引入歐洲腫瘤內科學會結腸癌臨床實踐指南和世界衛(wèi)生組織消化系統(tǒng)腫瘤分類，這為IS在結直腸癌中的應用鋪平了道路。