陳書媛，趙鋮

廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院風濕免疫科，南寧530021

系統(tǒng)性硬化病(SSc)是一種以局限性或彌漫性皮膚增厚和纖維化為特征的全身性自身免疫性疾病，其發(fā)病機制目前尚不完全清楚，臨床亦缺乏行之有效的治療方式。構(gòu)建理想的動物模型是探索SSc發(fā)病機制和檢測新治療策略重要的臨床前平臺。根據(jù)構(gòu)建方法不同，可將SSc動物模型分為誘導模型和基因模型兩大類。其中，誘導模型包括博來霉素(BLM)誘導小鼠模型、慢性硬皮病樣移植物抗宿主病(Scl-cGVHD)小鼠模型、活性氧離子(ROS)誘導小鼠模型、DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅰ(TopoⅠ)誘導小鼠模型、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導小鼠模型和Ⅴ型膠原(ColⅤ)誘導小鼠模型等，基因模型包括基因突變模型、轉(zhuǎn)基因模型及基因敲除模型。雖然SSc動物模型較多，但迄今為止仍無一種能夠完全模擬人類SSc疾病特征且易于推廣的動物模型。本文結(jié)合文獻就SSc動物模型的研究進展作一綜述。

1 誘導模型

在誘導模型中，應用最為廣泛、最為成熟的是BLM誘導小鼠模型和Scl-cGVHD小鼠模型。近年來，一些學者利用ROS、TopoⅠ、AngⅡ和ColⅤ等建立了新的誘導模型。誘導模型重點關(guān)注SSc的炎癥反應和組織纖維化特征，而對SSc免疫反應和血管病變的關(guān)注相對較少，但誘導模型操作簡便、成本低、造模成功率高。

1.1 BLM誘導小鼠模型 1976年，ASO等[1]通過BLM氣管給藥方式構(gòu)建了小鼠肺纖維化模型。隨后有學者通過皮下注射的方式建立了同時具備炎癥反應、局部皮膚纖維化、肺纖維化以及自身免疫反應等特征的SSc樣改變小鼠模型[2]，并沿用至今。目前，皮下植入滲透性微泵作為皮下注射的替代策略，解決了重復皮下注射存在的注射部位損傷和藥物濃度分布不均勻等缺點[3]。不同品系小鼠對BLM的敏感度不同，BALB/c小鼠比C57BL/6、DBA/2小鼠更為敏感[4]。BLM誘導小鼠模型能夠模擬SSc早期的炎癥特征，已被廣泛用于SSc發(fā)病機制的研究以及多種抗炎和抗纖維化藥物的療效評價。但該模型不適用于SSc后期非炎癥階段的研究。另外，該模型的纖維化表現(xiàn)局限于注射部位，無全身效應，自身抗體表達很低，并且?guī)缀醪荒苣M血管病變。

1.2 Scl-cGVHD小鼠模型 1983年，有學者將B10.D2小鼠脛骨、股骨骨髓以及脾臟制成淋巴細胞懸液，并注射至亞致死照射的BALB/c小鼠，構(gòu)建了Scl-cGVHD小鼠模型[5]。Scl-cGVHD小鼠模型早期即可觀察到嚴重的炎癥細胞浸潤，并可見皮膚、肺、肝、腎以及腸道進行性纖維化以及自身抗體ANA陽性。該模型適用于模擬SSc早期的炎癥階段，然而由于移植技術(shù)較為復雜，并且移植后動物處于免疫抑制狀態(tài)，易發(fā)生嚴重感染而死亡，造模成功率不高。有研究將BALB/c小鼠替換成Rag2基因敲除小鼠，這一改良使Scl-cGVHD小鼠模型更全面地模擬了人類SSc皮膚和內(nèi)臟纖維化、血管病變以及抗Scl-70抗體陽性的特征，并且動物死亡率明顯降低[6]。

1.3 ROS誘導小鼠模型 ROS是一種含有氧自由基的高活性化學物質(zhì)，包括O2-、HOCL、ONOO-、H2O2等。2009年，SERVETTAZ等[7]首次建立了ROS誘導的SSc小鼠模型，該模型通過皮下注射ONOO-引起小鼠局部皮膚損害以及血清抗CENP-B抗體陽性，產(chǎn)生與人類局限性SSc相似的特征；皮下注射HOCL可引起小鼠彌漫性皮膚損害、肺纖維化、腎臟受累及血清抗Scl-70抗體陽性，產(chǎn)生與人類彌漫性SSc相似的特征。2019年，MENG等[8]進一步研究發(fā)現(xiàn)，HOCL誘導小鼠模型能夠顯示全身免疫細胞浸潤、微血管損害和纖維化以及促炎和促纖維化途徑激活。ROS誘導小鼠模型能夠在BALB/c、C57BL/6、DBA/1、NZB等不同品系小鼠身上成功復制。與BLM誘導小鼠模型相比，ROS誘導小鼠模型在模擬血管病變方面更具優(yōu)勢，并且首次在小鼠體內(nèi)同時模擬了人類SSc不同的臨床類型，并證實抗Scl-70抗體直接參與SSc發(fā)病。目前，ROS誘導小鼠模型主要用于抗纖維化藥物的研究。

1.4 TopoⅠ誘導小鼠模型 2011年，YOSHIZAKI等[9]通過皮下注射重組人TopoⅠ和完全弗氏佐劑(CFA)誘導SSc樣病變，C57BL/6小鼠表現(xiàn)出皮膚和肺組織炎癥、纖維化，并產(chǎn)生高水平的抗TopoⅠ抗體，炎癥因子IL-6、IL-4、TGF-β1、IL-17等水平升高，IL-10水平降低；而IL-6表達缺失的C57BL/6小鼠皮膚和肺組織纖維化明顯減輕。提示該模型可能通過IL-6誘導SSc樣皮膚和肺組織纖維化以及自身免疫異常。2016年，MEHTA等[10]采用負載TopoⅠA和TopoⅠB多肽的樹突狀細胞重復免疫小鼠，亦可誘導出類似人類彌漫性SSc樣的彌漫性皮膚纖維化和抗TopoⅠ自身抗體反應。TopoⅠ誘導小鼠模型的優(yōu)點在于以TopoⅠ免疫為基礎(chǔ)，再現(xiàn)了彌漫性SSc的特征，可用于研究TopoⅠ抗體在SSc發(fā)病機制中的作用。但該模型的缺點是無法模擬血管病變。

1.5 AngⅡ誘導小鼠模型 2012年，STAWSKI等[11]通過皮下滲透泵連續(xù)注射AngⅡ建立了SSc模型，該模型小鼠可表現(xiàn)出顯著的真皮纖維化和炎癥細胞浸潤。2014年該團隊進一步研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ誘導小鼠模型皮膚和心臟血管內(nèi)皮血管損傷標記物顯著增加，如vWF、TSP-1、MMP-12，而MMP-12缺失小鼠血管損傷、M2巨噬細胞聚集以及皮膚和心臟纖維化明顯減輕[12]，提示MMP-12可能是一個SSc新的潛在治療靶點。AngⅡ誘導小鼠模型能夠模擬人類SSc組織纖維化、皮膚和心臟血管損傷，但該模型無法展現(xiàn)SSc發(fā)病時的自身免疫反應過程。

1.6 ColⅤ誘導小鼠模型 有研究報道，ColⅤ異常沉積與皮膚增厚和疾病活動度有關(guān)[13]，并被證實與SSc的自身免疫特征有關(guān)[14]。有研究通過對新西蘭兔皮下注射人ColⅤ和CFA誘導出SSc樣病變，該病變表現(xiàn)為皮膚和肺血管重塑、纖維化，ANA和抗Scl-70抗體陽性[15]。由于小鼠在可重復性、操作性及成本等方面較新西蘭兔更具優(yōu)勢，2019年該團隊改用C57BL/6小鼠建立了ColⅤ誘導小鼠模型，并成功復制了SSc的炎癥反應、纖維化、血管病變和自身免疫特征[16]。在誘導模型中，ColⅤ誘導小鼠模型能夠較為完整地復制SSc疾病特征，在未來的研究中具有更為廣闊的應用前景。但ColⅤ誘導小鼠模型無法確定微血管疾病和炎癥反應是否先于肺纖維化，并且觸發(fā)SSc的機制尚不完全清楚。

2 基因模型

基因模型可分為基因突變模型、轉(zhuǎn)基因模型及基因敲除模型?；蚰Ｐ驮谀MSSc組織纖維化和血管病變方面更具優(yōu)勢，能夠在一定程度上彌補誘導模型的不足，但存在靶點單一、技術(shù)復雜、成本高等缺點。

2.1 基因突變模型

2.1.1 UCD-200小雞模型 1981年，GERSHWIN等[17]建立的UCD-200小雞模型被認為是目前對SSc疾病特征模擬最為完整的動物模型。該模型能夠展現(xiàn)內(nèi)皮損傷、小動脈閉塞、皮膚和內(nèi)臟纖維化、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎和自身免疫反應等SSc疾病特征。但UCD-200小雞遺傳表型具有異質(zhì)性，目前對其遺傳信息和分子基礎(chǔ)的研究有限，并且該模型應用技術(shù)尚不成熟，難以繁育，價格昂貴，在應用中受到明顯限制。

2.1.2 TSK小鼠模型 TSK小鼠模型包括TSK-1、TSK-2小鼠模型，其基因突變位點不同但表現(xiàn)相似。TSK-1小鼠模型為原纖維蛋白基因1發(fā)生的顯性突變[18]，而TSK-2小鼠模型是由乙基亞硝基脲誘導1號染色體基因的顯性突變，特別是Col3a1基因PIIINP片段的功能獲得性突變[19]。TSK-1、TSK-2小鼠模型均能展現(xiàn)出皮膚纖維化和自身免疫反應的SSc樣特征，但TSK-2小鼠模型在真皮下層和脂肪組織隔膜中可觀察到單核細胞浸潤，較TSK-1小鼠模型模擬更為全面。目前，TSK小鼠模型主要用于人類SSc晚期纖維化方面的研究，常與BLM誘導小鼠模型聯(lián)合應用。但與SSc患者臨床病理特征有所不同，TSK小鼠模型皮膚纖維化發(fā)生在皮下組織、位置深在，肺部受累以肺氣腫樣改變?yōu)橹?，幾乎無纖維化，并且缺乏血管病變[18]。

2.2 轉(zhuǎn)基因模型

2.2.1 Fra-2轉(zhuǎn)基因小鼠模型 Fra-2是轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白酶1家族成員之一，與炎癥反應和膠原生成等密切相關(guān)。在SSc患者中可觀察到Fra-2基因啟動子的表觀遺傳學改變[20]。有研究在MHC-Ⅰ類抗原H2Kb啟動子介導的Fra-2過表達小鼠中觀察到肺纖維化，隨后又在Fra-2轉(zhuǎn)基因小鼠模型中發(fā)現(xiàn)進行性加重的皮膚纖維化和毛細血管減少、微血管內(nèi)皮細胞凋亡和肺動脈血管閉塞及肺動脈高壓(PAH)等典型血管病變，非常類似于SSc的肺動脈血管重塑和非特異性間質(zhì)性肺炎表現(xiàn)[21]。2015年，VENALIS等[22]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ra-2轉(zhuǎn)基因小鼠模型能夠模擬SSc相關(guān)心肌病的所有特征。Fra-2轉(zhuǎn)基因小鼠模型能夠高度模擬SSc的血管病變和纖維化這兩大特征，可作為研究SSc血管病變和心肌損害的臨床前模型，但該模型缺乏自身免疫病表現(xiàn)，并且PAH能夠極大程度地降低小鼠壽命。

2.2.2 TGF-β相關(guān)轉(zhuǎn)基因小鼠模型 TGF-β通路是參與SSc組織纖維化的重要通路之一。TBRICA；Cre-ER轉(zhuǎn)基因小鼠是在TGFβRⅠ基因上游引入原α2(Ⅰ)膠原基因的轉(zhuǎn)錄增強子和他莫昔芬誘導Cre/loxP系統(tǒng)，小鼠出生后2周給予4-羥基他莫昔芬可激活組成性活性TGFβRⅠ表達，小鼠會逐漸出現(xiàn)全身性進行性真皮纖維化，但不會出現(xiàn)肺纖維化，并可見腎、肺和腎上腺動脈血管壁增厚[23]。另一種TGFβRⅡΔK轉(zhuǎn)基因小鼠成纖維細胞中表達激酶缺陷型人Ⅱ型TGF-β受體，表現(xiàn)為真皮、肺、心臟和腸道纖維化，還能觀察到血管纖維化[24]。這兩種模型對研究TGF-β介導的組織纖維化具有重要價值，但這兩種模型缺少自身免疫反應和炎癥反應特征，并且模型建立需要條件性成纖維細胞轉(zhuǎn)基因方面的特殊技術(shù)支持。

2.2.3 其他轉(zhuǎn)基因模型 2011年，WEI等[25]建立的Wnt-10b轉(zhuǎn)基因小鼠模型，能夠表現(xiàn)出顯著的纖維化和皮下脂肪萎縮，與典型的SSc皮膚病變特征相似。Wnt-10b轉(zhuǎn)基因小鼠模型特別適合研究Wnt/β-catenin信號通路及其下游靶點以及脂肪細胞與真皮成纖維細胞的相互作用。2014年，MAURER等[26]構(gòu)建的VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠模型，能夠展現(xiàn)出明顯的皮膚纖維化和增殖性血管病變。VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠模型可用于研究SSc發(fā)病機制中血管病變與纖維化的關(guān)系。

2.3 基因敲除模型

2.3.1 uPAR-/-小鼠模型 uPAR是參與ECM重構(gòu)和血管生成的纖溶系統(tǒng)中的關(guān)鍵成分，可表達于內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、肌成纖維細胞以及免疫細胞等。2014年，MANETTI等[27]建立了uPAR-/-小鼠模型，該模型能夠表現(xiàn)出真皮增厚、非特異性間質(zhì)性肺炎和血管病變；隨后有研究在該模型中發(fā)現(xiàn)了類似SSc相關(guān)心肌病特征的心臟受累[28]。但該模型缺乏免疫學異常相關(guān)的證據(jù)。

2.3.2 SIRT3基因敲除小鼠模型 SIRT3是一種線粒體定位的脫乙酰酶。有研究表明，SIRT3基因敲除小鼠隨著年齡增長而自發(fā)出現(xiàn)多個器官纖維化，如心、肺、肝、腎[29]。PAULIN等[30]研究報道，SIRT3基因敲除小鼠模型能夠發(fā)生PAH，表現(xiàn)為動脈壁增厚、總肺動脈阻力增加和右心室肥厚。該模型類似于SSc樣組織纖維化和PAH，這為探討炎癥非依賴性纖維化和肺血管病變的發(fā)病機制提供了有利條件，但該模型缺乏自身免疫特征。

2.3.3 FLI1+/-KLF5+/-雙雜合小鼠模型 FLI1是Ⅰ型膠原基因的有效抑制因子。由于FLI1在SSc患者成纖維細胞、內(nèi)皮細胞和角質(zhì)形成細胞等表達均顯著降低，已建立了多種細胞特異性條件的FLI1基因敲除小鼠模型。如上皮細胞特異性FLI1缺陷(K14Cre；fl/fl)小鼠模型具有多種SSc特征，包括自身免疫反應、炎癥反應和組織纖維化，但沒有血管病變特征[31]。此外，有學者將FLIfiox/flox小鼠與在內(nèi)皮特異性Tie2(Tek)受體啟動子控制下表達Cre重組酶的小鼠雜交，從而獲得內(nèi)皮細胞特異性FLI1基因敲除小鼠，該小鼠可表現(xiàn)出明顯的血管病變特征[32]，并且參與維持血管穩(wěn)態(tài)的分子表達下調(diào)[33-34]。但該模型缺乏SSc典型的組織纖維化和自身免疫特征。

KLF5是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子SP/KLF家族成員，在腎臟和心臟纖維化過程中發(fā)揮重要的作用。FLI1+/-KLF5+/-雙雜合小鼠模型具備SSc的三個特征：皮膚和肺纖維化、血管病變、B細胞激活和自身抗體產(chǎn)生[35]。該模型小鼠在1月齡時可出現(xiàn)小動脈狹窄，2月齡時出現(xiàn)皮膚血管密度減少，3月齡時出現(xiàn)顯著的真皮纖維化，8月齡時肺部表現(xiàn)為非特異性間質(zhì)性肺炎、PAH和肺靜脈閉塞性疾病的典型組織學特征。除了UCD-200小雞模型外，F(xiàn)LI1+/-KLF5+/-雙雜合小鼠模型是迄今為止模擬人類SSc疾病特征較為全面的動物模型。

綜上所述，SSc動物模型種類較多，研究者應根據(jù)實際需求選用合適的單一或組合模型，以尋求最佳的實驗結(jié)果。如BLM誘導小鼠模型、Scl-cGVHD小鼠模型主要用于研究SSc早期的炎性反應；ROS誘導小鼠模型和TopoⅠ誘導小鼠模型可用于復制人類彌漫性SSc；幾乎所有模型能夠模擬人類SSc的組織纖維化特征，但以TSK小鼠模型應用最廣泛；UCD-200小雞模型、uPAR-/-小鼠模型、SIRT3基因敲除小鼠模型、Fra-2轉(zhuǎn)基因小鼠模型以及VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠模型等主要用于SSc血管病變的研究。UCD-200小雞模型和FLI1+/-KLF5+/-雙雜合小鼠模型是目前能夠較為全面地模擬人類SSc疾病特征的模型，但UCD-200小雞為禽類，與人類基因相差甚遠，且基因模型普遍存在造模技術(shù)復雜、價格昂貴、不宜推廣等弊端。此外，常用的嚙齒類動物與人類種屬和免疫學存在較大差異。因此，仍需進一步尋求一種遺傳背景、免疫學等與人類更為接近、盡可能全面地模擬人類SSc疾病特征且易于推廣的動物模型。