單會艷，俞艷華，趙瑞彪

心肌缺血再灌注損傷是指心肌組織缺血后恢復(fù)血流，血液的再灌注加重其結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙的病理生理過程，最終可能導(dǎo)致心肌梗死、纖維化、心肌肥厚和心力衰竭等多器官功能障礙[1]。因此，深入研究其發(fā)生發(fā)展機制，抑制心肌細胞凋亡，對防治心肌缺血再灌注損傷具有重要作用。研究報道，miR-206在低氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷和凋亡過程中發(fā)揮了保護心肌細胞的作用[2]。miR-206通過靶向蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B)對急性心肌梗死誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡具有保護作用[3]。miR-206還可通過靶向CC趨化因子配體2(CC motif chemokine ligand 2，CCL2)抑制癲癇發(fā)作誘發(fā)的腦損傷[4]。S100鈣結(jié)合蛋白A9(S100 calcium-binding protein A9，S100A9)是S100蛋白家族成員，在小鼠腦缺血再灌注損傷模型中高表達[5]。S100A9是早期再灌注階段上調(diào)最明顯的基因，敲除S100A9使心肌細胞凋亡明顯減少，并改善心臟功能[6]。S100A9還參與了兒童急性肺損傷[7]。然而miR-206-3p和S100A9對缺氧/復(fù)氧(H/R)誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的影響還尚未清楚。本實驗旨在研究miR-206-3p和S100A9對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的影響，且miR-206-3p是否通過靶向調(diào)控S100A9表達影響H/R誘導(dǎo)的心肌細胞損傷。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 大鼠心肌細胞H9C2購自美國ATCC公司；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；Trizol試劑、cDNA試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-qPCR)試劑盒均購自日本Takara公司；BCA試劑盒購自上海羽朵生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)試劑盒均購自上海滬震實業(yè)有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；雙熒光素酶報告實驗試劑盒購自上海英拜生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 H/R細胞模型的建立 將無血清DMEM培養(yǎng)基先置于含95%N2、5%CO2密閉培養(yǎng)箱中3 h，進行缺氧處理，將大鼠心肌細胞H9C2接種于上述培養(yǎng)基中繼續(xù)缺氧處理3 h，然后換成含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃含95%O2、5%CO2的培養(yǎng)箱中復(fù)氧處理4 h。

1.2.2 細胞分組與處理 將心肌細胞隨機分為正常對照(Con)組、H/R組；H/R+miR-NC組、H/R+miR-206-3p組、H/R+si-NC組、H/R+si-S100A9組、H/R+miR-206-3p+pcDNA組、H/R+miR-206-3p+pcDNA-S100A9組。Con組細胞常規(guī)培養(yǎng)；H/R組構(gòu)建H/R細胞模型；H/R+miR-NC組、H/R+miR-206-3p組、H/R+si-NC組、H/R+si-S100A9組將miR-NC、miR-206-3p、si-NC、si-S100A9轉(zhuǎn)染至心肌細胞H9C2中后進行H/R處理；H/R+miR-206-3p+pcDNA組、H/R+miR-206-3p+pcDNA-S100A9組將miR-206-3p分別與pcDNA、pcDNA-S100A9共轉(zhuǎn)染至心肌細胞H9C2中后進行H/R處理。

1.2.3 miR-206-3p和S100A9 mRNA表達水平的檢測 RT-qPCR檢測miR-206-3p和S100A9 mRNA的表達水平。提取細胞總RNA，合成cDNA，進行PCR，相對表達量用2-△△Ct法計算。miR-206-3p和S100A9分別以U6和GAPDH為內(nèi)參，miR-206-3p正向引物序列：5′-AGCTCGATTAAGGTGGAATGTAAGGAAGT-3′，反向引物序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGG-3′；U6正向引物序列：5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，反向引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3′；S100A9正向引物序列：5′-ACCCAGACACCCTGAACC-3′，反向引物序列：5′-AGCATGATGAACTCCTCGA-3′；GAPDH正向引物序列：5′-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3′，反向引物序列：5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGAC-3′；引物均由上海生工生物工程公司合成。

1.2.4 S100A9、B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)x蛋白(Bax)蛋白表達的檢測 蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測S100A9、Bcl-2、Bax蛋白表達。提取總蛋白采用蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA法)測定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉后加入一抗，4 ℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育2 h，用ECL發(fā)光液顯影，用Quantity One測定蛋白條帶灰度值，以目的條帶和GAPDH條帶灰度值比值作為蛋白相對表達水平。

1.2.5 SOD、GSH-Px活性和MDA含量的檢測 應(yīng)用試劑盒檢測細胞SOD、GSH-Px活性和MDA含量。細胞培養(yǎng)48 h，收集各組細胞，按試劑盒說明書進行操作。

1.2.6 細胞凋亡的檢測 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡。各組細胞用預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)漂洗2次，與500 μL的結(jié)合緩沖液混勻，加入10 μL的Annexin V-FITC、5 μL的PI，混勻后避光孵育10 min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.7 miR-206-3p對S100A9的靶向調(diào)控的檢測 熒光素酶報告實驗檢測miR-206-3p對S100A9的靶向調(diào)控。TargetScan數(shù)據(jù)庫顯示，miR-206-3p與S100A9存在結(jié)合位點。構(gòu)建S100A9野生型和突變型熒光素酶表達載體WT-S100A9和MUT-S100A9，將其分別與miR-NC和miR-206-3p共轉(zhuǎn)染至心肌細胞中，按說明書檢測熒光素酶活性。將miR-NC、miR-206-3p、anti-miR-NC、anti-miR-206-3p轉(zhuǎn)染至心肌細胞中檢測S100A9表達水平。

2 結(jié) 果

2.1 Con組與H/R組miR-206-3p和S100A9表達比較 與Con組比較，H/R組心肌細胞中miR-206-3p表達水平明顯降低，S100A9 mRNA和蛋白表達水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖1、表1。

圖1 Con組與H/R組S100A9蛋白表達條帶圖

表1 Con組與H/R組miR-206-3p和S100A9表達比較 ()

2.2 miR-206-3p過表達對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的影響 與Con組比較，H/R組心肌細胞中miR-206-3p表達水平、SOD和GSH-Px活性、Bcl-2蛋白表達水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；細胞凋亡率、Bax蛋白表達水平、MDA含量明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與H/R+miR-NC組比較，H/R+miR-206-3p組心肌細胞中miR-206-3p表達水平、SOD和GSH-Px活性、Bcl-2蛋白表達水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；細胞凋亡率、MDA含量、Bax蛋白表達水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖2、圖3、表2。

圖2 4組Bcl-2、Bax凋亡相關(guān)蛋白表達條帶圖

圖3 miR-206-3p過表達對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的影響

表2 miR-206-3p過表達對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的影響 ()

2.3 抑制S100A9表達對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的影響 與Con組比較，H/R組心肌細胞中S100A9表達水平、MDA含量、細胞凋亡率、Bax表達水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SOD和GSH-Px活性、Bcl-2表達水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與H/R+si-NC組比較，H/R+si-S100A9組心肌細胞中SOD和GSH-Px活性、Bcl-2表達水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；S100A9表達水平、MDA含量、細胞凋亡率、Bax表達水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖4、圖5、表3。

圖4 4組S100A9、Bcl-2、Bax蛋白表達條帶圖

圖5 抑制S100A9表達對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的影響

表3 抑制S100A9表達對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的影響 ()

2.4 miR-206-3p靶向調(diào)控S100A9的表達 TargetScan預(yù)測顯示，miR-206-3p與S100A9存在結(jié)合位點。熒光素酶報告實驗顯示，與miR-NC組比較，miR-206-3p組中轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-S100A9的細胞熒光素酶活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；轉(zhuǎn)染突MUT-S100A9的細胞熒光素酶活性比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與miR-NC組比較，miR-206-3p組S100A9表達水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-206-3p組S100A9表達水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖6、表4、圖7、表5。

圖6 S100A9的3′UTR中含有與miR-206-3p互補的核苷酸序列

表4 miR-NC組、miR-206-3p組細胞熒光素酶活性比較 ()

圖7 4組S100A9蛋白表達條帶圖

表5 miR-206-3p調(diào)控S100A9蛋白的表達()

2.5 上調(diào)S100A9表達逆轉(zhuǎn)了miR-206-3p過表達對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的作用 與H/R+miR-NC組比較，H/R+miR-206-3p組SOD和GSH-Px活性、Bcl-2蛋白表達水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；S100A9表達水平、MDA含量、細胞凋亡率、Bax蛋白表達水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與H/R+miR-206-3p+pcDNA組比較，H/R+miR-206-3p+pcDNA-S100A9組心肌細胞中S100A9表達水平、MDA含量、細胞凋亡率、Bax蛋白表達水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SOD和GSH-Px活性、Bcl-2表達水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖8、圖9及表6。

圖8 4組S100A9、Bcl-2、Bax蛋白表達條帶圖

圖9 上調(diào)S100A9表達逆轉(zhuǎn)了miR-206-3p過表達對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡的影響

表6 上調(diào)S100A9表達逆轉(zhuǎn)了miR-206-3p過表達對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的作用 ()

3 討 論

心肌缺血/再灌注損傷是臨床常見的病理過程，如何有效預(yù)防心肌缺血/再灌注損傷，提高病人的生存質(zhì)量，是臨床研究的熱點[8]。研究表明，心肌缺血/再灌注損傷與氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)[9]。本實驗通過H/R誘導(dǎo)心肌細胞建立缺血再灌注損傷模型，結(jié)果顯示，H/R誘導(dǎo)的心肌細胞中SOD和GSH-Px活性、Bcl-2蛋白表達水平明顯降低；細胞凋亡率、Bax蛋白表達水平、MDA含量明顯升高，表明本實驗H/R模型建立成功。

研究表明，miRNA在心肌缺血/再灌注損傷的信號通路中發(fā)揮重要作用，可作為未來治療心肌缺血/再灌注損傷的新型工具和診斷心血管疾病的敏感生物標(biāo)記物[10]。研究報道，LncRNA RMRP過表達通過下調(diào)miR-206加劇了缺氧誘導(dǎo)的H9c2細胞損傷；miR-206過表達通過靶向生長停滯DNA損傷誘導(dǎo)基因45β(growth arrest DNA damage-inducible gene 45β，Gadd45β)可明顯減少梗死面積并抑制缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡；LncRNA UCA1使miR-206海綿化，從而加劇了氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)在人類巨噬細胞中誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細胞凋亡[11-13]。

本實驗結(jié)果顯示，H/R誘導(dǎo)的心肌細胞中miR-206-3p低表達；過表達miR-206-3p后H/R誘導(dǎo)的心肌細胞中MDA含量明顯降低，SOD、GSH-Px活性明顯升高，細胞凋亡率明顯降低，Bcl-2蛋白表達水平明顯升高，Bax蛋白表達水平明顯降低。表明過表達miR-206-3p可抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡和氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。為進一步研究miR-206-3p影響H/R誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的機制，本實驗通過TargetScan預(yù)測其靶基因，結(jié)果顯示，miR-206-3p與S100A9存在結(jié)合位點，雙熒光素酶報告實驗證實miR-206-3p可靶向調(diào)控S100A9。且本實驗結(jié)果表明，H/R誘導(dǎo)的心肌細胞中S100A9高表達，表明S100A9可能參與H/R誘導(dǎo)的心肌細胞損傷。研究報道，柯薩奇病毒B3引起的心肌炎病人中S100A9高表達，加重了心肌炎；S100A9基因敲除小鼠可改善左心室功能，減少心臟炎癥和氧化反應(yīng)[14]。外傷性腦損傷誘發(fā)了促炎性和淀粉樣蛋白S100A9的產(chǎn)生，S100A9是腦損傷的重要標(biāo)志[15]。血漿S100A8/A9異二聚體是心臟手術(shù)相關(guān)的急性腎損傷的早期預(yù)后標(biāo)志物[16]。因此，本實驗為研究S100A9是否影響H/R誘導(dǎo)的心肌細胞損傷，轉(zhuǎn)染S100A9抑制表達載體，結(jié)果顯示，MDA含量明顯降低，SOD、GSH-Px活性明顯升高，細胞凋亡率明顯降低，Bcl-2蛋白表達水平明顯升高，Bax蛋白表達水平明顯降低。說明抑制S100A9表達可抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡和氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。且上調(diào)S100A9表達逆轉(zhuǎn)了miR-206-3p過表達對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的保護作用。提示miR-206-3p可能通過調(diào)控S100A9影響H/R誘導(dǎo)的心肌細胞損傷。

綜上所述，過表達miR-206-3p通過靶向下調(diào)S100A9可抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡和氧化應(yīng)激，miR-206-3p對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞損傷具有保護作用。