郭施勉，楚英杰

冠心病是指由冠狀動(dòng)脈血管發(fā)生粥樣硬化引起的血管狹窄、阻塞，從而造成心肌缺血、缺氧甚至壞死的心臟疾病，是臨床上常見(jiàn)的心血管疾病[1]。冠心病主要高發(fā)于中老年或合并心血管基礎(chǔ)疾病的病人，隨著社會(huì)人口老齡化的加快以及生活習(xí)慣的改變，冠心病發(fā)病率逐年增加，由冠心病導(dǎo)致的猝死也時(shí)有發(fā)生，嚴(yán)重威脅人們的生命健康和安全[2]。人參皂苷Rg1是從人參中提取的一種中藥活性物質(zhì)，研究表明，人參皂苷Rg1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及抗腫瘤方面均發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[3]。近代藥理研究證明，人參皂苷對(duì)缺血性心臟病、心律失常、心力衰竭以及心肌缺血再灌注損傷等多種心血管系統(tǒng)疾病具有深遠(yuǎn)的臨床意義，但關(guān)于人參皂苷Rg1在心血管系統(tǒng)中的作用仍鮮有報(bào)道[4]。研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1對(duì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng)具有一定的抑制作用，可抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[5]。本研究擬通過(guò)構(gòu)建大鼠冠心病模型，在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中觀察人參皂苷Rg1對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的作用，為人參皂苷Rg1在冠心病中的作用研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)健康雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量(200±20)g，動(dòng)物房中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，室溫(22±5)℃，相對(duì)濕度(50±5)%，通風(fēng)良好，環(huán)境安靜，自由飲水、攝食。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 人參總皂苷 Rg1(浙江康恩貝制藥股份有限公司)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(美國(guó)PeproTech公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Trizol裂解液、BCA蛋白定量試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司；兔抗鼠β-actin單克隆抗體、兔抗鼠Bcl-2單克隆抗體、兔抗鼠Bax單克隆抗體、兔抗鼠Caspase-3單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；Tunel試劑盒(美國(guó)Roche公司)；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、蛋白上樣緩沖液均購(gòu)自中國(guó)上海碧云天生物工程研究所；多聚甲醛、無(wú)水乙醇均產(chǎn)自天津化學(xué)試劑廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組與模型構(gòu)建 本研究采用高脂飲食飼養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射垂體后葉素構(gòu)建大鼠冠心病模型，每日高脂飲食連續(xù)飼養(yǎng)6周后，間隔24 h腹腔注射垂體后葉素30 μg/kg，連續(xù)3次[6]。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組，每組10只。對(duì)照組常規(guī)飲食，不進(jìn)行冠心病造模，給予人參皂苷Rg1等體積生理鹽水灌胃，每日1次；模型組構(gòu)建冠心病模型，給予人參皂苷Rg1等體積生理鹽水灌胃，每日1次；人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組、人參皂苷Rg1高劑量組均構(gòu)建冠心病模型，術(shù)后分別給予50 mg/kg、75 mg/kg、100 mg/kg人參皂苷Rg1灌胃，每日1次。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均連續(xù)灌胃12周。

1.3.2 心肌組織缺血區(qū)細(xì)胞形態(tài)觀察 斷頭法處理實(shí)驗(yàn)大鼠，各組大鼠取適量心肌均勻切成5片，每片厚度約為2.0 mm，置于包埋盒內(nèi)，浸于4%多聚甲醛中固定過(guò)夜。常規(guī)乙醇梯度脫水，隨后取出，置于包埋機(jī)中2 h進(jìn)行石蠟包埋。隨后將切片置于二甲苯及梯度乙醇中依次浸泡脫蠟，采用蘇木素染色40 s，1%鹽酸乙醇沖洗后，置于伊紅溶液中染色3 s后自來(lái)水沖洗。沖洗后將切片置于梯度乙醇及二甲苯溶液中進(jìn)行脫水和透明處理。使用中性樹(shù)脂覆蓋玻片進(jìn)行封固。于光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖片，應(yīng)用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件處理并作統(tǒng)計(jì)。

1.3.3 心肌組織中炎性因子含量檢測(cè) 每只大鼠取心肌組織約50 mg，制成10%的勻漿液，3 000 r/min，4 ℃下離心10 min，收集上清液，采用ELISA試劑盒檢測(cè)上清液中白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量。使用酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices)在450 nm下測(cè)定OD值。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 SOD、MDA含量檢測(cè) 每只大鼠取心肌組織約50 mg，于預(yù)冷生理鹽水中漂洗后，除去血液，采用手術(shù)剪將心肌組織塊剪碎，轉(zhuǎn)移至勻漿管中，制成10%的組織漿液。3 000 r/min離心10 min，使組織勻漿化，取上清液，嚴(yán)格按照各個(gè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)心肌組織SOD活性及MDA含量。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 凋亡相關(guān)蛋白 mRNA表達(dá)情況檢測(cè) 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)心肌組織中凋亡相關(guān)蛋白 mRNA表達(dá)情況。采用Trizol法提取各組大鼠心肌組織細(xì)胞總RNA。采用紫外分光光度儀測(cè)定總RNA濃度與純度，A260/280在1.8～2.0。參照mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和RT-PCR檢測(cè)，反應(yīng)程序：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)，最后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s收集熒光信號(hào)，計(jì)算相對(duì)定量結(jié)果，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。Bax、Bcl-2、Caspase-3引物及內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物均由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.3.6 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況檢測(cè) 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)心肌組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況。每只大鼠取心肌組織約50 mg，加入組織蛋白提取液，4 ℃充分碾磨10 000 r/min離心10 min，取上清液。采用BCA 蛋白定量試劑盒對(duì)提取的蛋白進(jìn)行定量，各組以30～60 μg 相同的蛋白上樣量，煮沸變性后進(jìn)行凝膠電泳，隨后使用半干轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，5%脫脂牛奶封閉 1 h，抗Bax單克隆抗體(1∶1 000)、抗Bcl-2單克隆抗體(1∶1 000)、抗Caspase-3單克隆抗體(1∶800)4 ℃孵育過(guò)夜。PBS-Tween 20液漂洗，HRP標(biāo)記的二抗反應(yīng)，PBS-Tween 20液洗膜，化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色，凝膠成像儀曝光拍照。檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)大鼠心肌組織中Bax、Bcl-2及Caspase-3等凋亡標(biāo)志蛋白表達(dá)情況。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，灰度值采用Image Pro Plus 6.0軟件檢測(cè)分析。

2 結(jié) 果

2.1 5組心肌組織細(xì)胞形態(tài)比較 光學(xué)顯微鏡下觀察，對(duì)照組大鼠心肌組織細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊，細(xì)胞核膜完整，核仁清晰可見(jiàn)，無(wú)明顯核固縮表現(xiàn)；模型組大鼠心肌組織細(xì)胞體積明顯縮小，核固縮明顯，呈深染色表現(xiàn)，細(xì)胞水腫明顯，細(xì)胞間隙有明顯的細(xì)胞浸潤(rùn)表現(xiàn)，可見(jiàn)明顯的壞死細(xì)胞；人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組大鼠心肌組織細(xì)胞水腫狀態(tài)均較模型組有所改善，細(xì)胞水腫狀態(tài)呈現(xiàn)不同程度減輕，其中，人參皂苷Rg1高劑量組細(xì)胞腫脹程度緩解最為明顯，其細(xì)胞核深染明顯減輕，細(xì)胞皺縮明顯緩解，細(xì)胞形態(tài)基本趨于正常。詳見(jiàn)圖1。

圖1 5組心肌組織細(xì)胞形態(tài)比較

2.2 5組心肌組織炎性因子含量比較 與對(duì)照組比較，模型組、人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與人參皂苷Rg1中劑量組比較，人參皂苷Rg1高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與人參皂苷Rg1低劑量組比較，人參皂苷Rg1高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠心肌組織炎性因子含量比較 () 單位：ng/L

2.3 5組SOD活性及MDA含量比較 與對(duì)照組比較，模型組、人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與人參皂苷Rg1中劑量組比較，人參皂苷Rg1高劑量組SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與人參皂苷Rg1低劑量組比較，人參皂苷Rg1高劑量組SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 5組SOD活性及MDA含量比較 ()

2.4 5組凋亡相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，模型組、人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組、人參皂苷Rg1高劑量組Bax及Caspase-3 mRNA表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組Bax及Caspase-3 mRNA表達(dá)水平明顯降低，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與人參皂苷Rg1中劑量組比較，人參皂苷Rg1高劑量組Bax及Caspase-3 mRNA表達(dá)水平明顯降低，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與人參皂苷Rg1低劑量組比較，人參皂苷Rg1高劑量組Bax及Caspase-3 mRNA表達(dá)水平明顯降低，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖2。

圖2 5組凋亡相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)比較

2.5 5組凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，模型組、人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組、人參皂苷Rg1高劑量組Bax及Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組Bax及Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與人參皂苷Rg1中劑量組比較，人參皂苷Rg1高劑量組Bax及Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與人參皂苷Rg1低劑量組比較，人參皂苷Rg1高劑量組Bax及Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖3。

圖3 5組凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較

3 討 論

冠心病是一類(lèi)常見(jiàn)的嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的心血管系統(tǒng)疾病，其發(fā)生與動(dòng)脈粥樣硬化、血管再狹窄、心肌缺血再灌注損傷等密切相關(guān)[7]。研究顯示，心肌細(xì)胞凋亡在動(dòng)脈粥樣硬化、心肌缺血、再灌注損傷以及急性心肌梗死等心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色[8]。細(xì)胞凋亡又稱(chēng)為程序性細(xì)胞死亡，是細(xì)胞自我有效消亡的過(guò)程，在形態(tài)特征上有別于細(xì)胞壞死，但同屬于細(xì)胞死亡[9]。隨著對(duì)冠心病發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，心肌細(xì)胞凋亡與冠心病的關(guān)系逐漸成為臨床研究的熱點(diǎn)話題。

人參皂苷是人參的主要活性成分，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等具有不同程度的保護(hù)作用，尤其在心血管系統(tǒng)疾病的防治中具有重要意義[10]。人參皂苷Rg1屬于人參三醇型皂苷，有研究顯示，人參皂苷Rg1對(duì)缺血心肌具有保護(hù)作用，不僅可通過(guò)與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮(NO)，擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，增加冠狀動(dòng)脈血流量，保護(hù)心肌功能，還可通過(guò)降低缺血缺氧心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡紊亂，保護(hù)心肌細(xì)胞[11-12]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1在血管新生方面也具有積極作用，可通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，參與血管重構(gòu)與新生，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用[13-14]。此外，人參皂苷Rg1在一定程度上可增加冠心病病灶區(qū)的血管密度，提高血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)，在急性心肌梗死中發(fā)揮保護(hù)作用[15]。人參皂苷Rg1已作為復(fù)方制劑的成分之一投入到臨床使用中，目前臨床上廣泛應(yīng)用的血栓通注射液的主要成分即為人參皂苷Rg1，但目前人參皂苷Rg1心肌保護(hù)作用的研究多在細(xì)胞水平，人參皂苷Rg1通過(guò)何種途徑影響冠心病的發(fā)展和預(yù)后仍不清楚。本研究以人參皂苷Rg1對(duì)冠心病心肌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制為切入點(diǎn)，以大鼠冠心病模型為研究對(duì)象，探討人參皂苷Rg1影響心肌細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，給予人參皂苷Rg1不同劑量干預(yù)后，人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組大鼠心肌細(xì)胞水腫狀態(tài)均較模型組改善，細(xì)胞水腫狀態(tài)呈現(xiàn)不同程度減輕，提示人參皂苷Rg1對(duì)于緩解心肌細(xì)胞水腫有一定作用，且人參皂苷Rg1高劑量組細(xì)胞腫脹程度緩解最為明顯。IL-1β是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，可通過(guò)刺激黏附分子異常高表達(dá)，介導(dǎo)粒細(xì)胞在血管內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附和浸潤(rùn)，還可通過(guò)刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)相關(guān)血管活性物質(zhì)的合成與分泌，促進(jìn)微血栓的形成[16]。IL-6在缺血再灌注損傷發(fā)病早期即可通過(guò)異常高表達(dá)刺激炎性細(xì)胞介質(zhì)釋放發(fā)揮促炎作用[17]。TNF-α作為一種常見(jiàn)的炎性因子，在眾多炎癥中均有著明顯的異常表達(dá)，主要在炎癥發(fā)生的初始階段發(fā)揮前炎性因子作用[18]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯高于人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組(P<0.05)，且人參皂苷Rg1高劑量組大鼠心肌組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯低于人參皂苷Rg1低、中高劑量組(P<0.05)，提示人參皂苷Rg1能有效抑制冠心病發(fā)生過(guò)程中的炎癥反應(yīng)，且其對(duì)心肌細(xì)胞損傷的抗炎效應(yīng)與劑量密切相關(guān)。SOD廣泛存在于人體，是心肌組織中清除自由基的有效成分，MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，可通過(guò)干預(yù)氧自由基的生成量間接反映細(xì)胞損傷的程度[19-20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組SOD活性明顯低于人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組(P<0.05)，而MDA含量明顯高于人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組(P<0.05)，表明人參皂苷Rg1能增強(qiáng)冠心病大鼠心肌組織中SOD活性，同時(shí)降低MDA水平，從而減輕氧自由基的破壞作用，保護(hù)心肌細(xì)胞，與其抗炎作用一致。與模型組比較，人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組大鼠心肌組織中凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)量則明顯升高(P<0.05)，提示人參皂苷Rg1對(duì)冠心病心肌組織細(xì)胞凋亡具有一定的抑制作用。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人參皂苷Rg1在降低炎癥水平及氧自由基作用的同時(shí)，還可抑制心肌細(xì)胞凋亡，其抑制凋亡效應(yīng)可能與線粒體凋亡信號(hào)通路的失活有關(guān)。

綜上所述，人參皂苷Rg1可通過(guò)降低損傷后炎癥反應(yīng)、抗氧化、抑制線粒體凋亡信號(hào)通路作用，發(fā)揮對(duì)冠心病大鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，其作用效果與干預(yù)劑量明顯相關(guān)。