梁振宇，鄒子鴻，湯菊芬，黃瑜，簡紀常，蔡佳，2*

(1.廣東海洋大學 水產(chǎn)學院，廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室，廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病害控制重點實驗室，廣東 湛江 524088； 2.廣西科學院 廣西北部灣海洋研究中心，廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成化學重點實驗室，廣西 南寧 530007)

斜帶石斑魚Epinepheluscoioides是中國重要的海洋經(jīng)濟魚類養(yǎng)殖品種，近年來，隨著石斑魚養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，養(yǎng)殖環(huán)境惡化，石斑魚養(yǎng)殖過程中病害頻繁發(fā)生，其中，主要的細菌性病原為哈維氏弧菌和溶藻弧菌，病毒性病原為虹彩病毒和神經(jīng)壞死病毒，嚴重制約了石斑魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[1]。

熱激蛋白(heat shock proteins, HSPs)，又稱為熱休克蛋白，當生物有機體受到各種生物(病害等)或非生物脅迫(如高溫、冷害等)時，該蛋白基因表達上調(diào)[2-3]。作為分子伴侶，HSPs能通過磷酸化、甲基化等方式產(chǎn)生多種異構(gòu)體與不同的蛋白質(zhì)形成復合物，進而調(diào)節(jié)蛋白的活性與功能[4]，在維持細胞生物活性、穩(wěn)定細胞結(jié)構(gòu)、修復細胞氧化損傷等方面也發(fā)揮著重要作用[5]。此外，HSPs還參與機體抗原提成加工、自身免疫、協(xié)同免疫[6]，以及通過調(diào)節(jié)細胞凋亡影響胚胎發(fā)育等過程[7]。

目前，HSPs同源物已經(jīng)在細菌、植物、魚類和哺乳類動物中相繼被鑒定。按相對分子質(zhì)量的大小可將 HSPs 分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40 和小分子HSP等6個超基因家族，其中 HSP70 基因家族蛋白在生物體內(nèi)分布最廣且報道最多。根據(jù)其功能不同，可將HSP70蛋白分為參與哺乳動物細胞功能的結(jié)構(gòu)型熱激蛋白HSP73、參與多種脅迫響應的誘導型熱激蛋白HSP72、定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的葡萄糖結(jié)合蛋白HSPA5 及定位于線粒體的HSPA9 蛋白等[8]。

對哺乳動物HSP70的功能研究表明，HSP70蛋白在蛋白質(zhì)的折疊、分解、降解方面具有重要的作用，能與大多數(shù)處于未折疊、錯誤折疊或聚集狀態(tài)的蛋白質(zhì)相互作用，主動降解和溶解異常的蛋白質(zhì)聚集體[9-12]。在免疫反應中，HSP70還能作為先天性和適應性免疫的刺激物,并在某些條件下抑制T細胞介導的炎癥反應[13]。

目前，魚類HSP22、HSP60、HSP70、HSP90等HSP家族的基因相繼被報道，每個HSP家族蛋白序列具有高度的保守性[14]。其中，HSP70家族的多個成員，包括HSPA1、HSPA2、HSPA4、HSPA5、HSPA8、HSPA9、HSPA12 和HSPA14[15]已經(jīng)在多種魚類中被鑒定。已有研究表明，水溫變化，細菌、病毒感染，低氧等應激因素均可刺激HSP70基因大量表達，HSP70可與變性蛋白結(jié)合，隨后介導變性蛋白聚合物的降解，從而保護細胞[16]。然而斜帶石斑魚HSP70的功能尚不清楚。

本研究中，克隆了斜帶石斑魚HSP70 基因(EcHSP70)，分析了該基因在脂多糖(LPS)與聚肌胞(Poly I∶C)刺激后的表達變化，并表達純化了EcHSP70重組蛋白，為進一步研究EcHSP70在抗病原感染免疫中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用斜帶石斑魚購自廣東省湛江市某水產(chǎn)批發(fā)市場，取其肝臟、脾臟、腸、心臟、皮膚、肌肉、鰓、頭腎、胸腺、腦等10個部位保存于RNAlater中，并提取其RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后置于冰箱(-20 ℃)中保存。

試驗試劑：pGEX-4T-1載體由廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室保存；T4 DNA連接酶、ExTaq酶、限制性內(nèi)切酶(SmaI和XhoI)等購自TaKaRa公司(日本)；DH5α competent cells和BL21(DE3) competent cells、質(zhì)粒提取試劑盒等購自生工生物工程(上海)股份有限公司；TransZol Up Plus RNA Kit和相關(guān)反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TransStart Green qPCR SuperMix等購自北京全式金公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自西安晶彩生物科技有限公司；Western blot相關(guān)試劑與抗體、10×PBS、1×PBS購自碧云天公司。胰蛋白胨、無水乙醇等均為國藥分析純。

熒光定量所用的斜帶石斑魚脾臟細胞(GS細胞)，由華南農(nóng)業(yè)大學秦啟偉老師惠贈。LPS購自碧云天公司，Poly I∶C 購自 Apexbio 公司。

蛋白純化試劑：Washing buffer包含0.5% Triton-100、50 mmol/L Tris (pH 8.0)、300 mmol/L NaCl、10 mmol/L EDTA、10 mmol/L DTT；Resuspend buffer包含50 mmol/L Tris (pH 8.0)、100 mmol/L NaCl、10 mmol/L EDTA、10 mmol/L DTT，均現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成及組織RNA提取 利用廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟病原生物學及流行病學重點實驗室斜帶石斑魚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)得到EcHSP70基因的開放閱讀框(ORF)，利用Primer 5.0軟件設(shè)計正向引物與反向引物及熒光定量引物(表1)。根據(jù)TransZol Up Plus RNA Kit與反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書提取斜帶石斑魚組織RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

表1 試驗所用引物Tab.1 Primer used in the test

1.2.2 LPS、Poly I∶C刺激GS細胞后EcHSP70基因的表達 將GS細胞接種至24孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)至細胞數(shù)量約為 1×105個/孔時，分別加入終質(zhì)量濃度為1 mg/mL的LPS和5 mg/mL的Poly I∶C進行刺激[17]，在刺激后0、4、8、12、24、48 h時收集細胞，按照細胞RNA提取試劑盒說明書提取細胞RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為熒光定量PCR模板。熒光定量PCR反應體系(10 μL)：cDNA模板0.5 μL，上、下游引物(HSP70-RT-S和HSP70-RT-A，10 μmol/L)各1 μL，2×SYBR Green Mix(Roche) 5 μL，dd H2O 2.5 μL。每個樣品設(shè)置4個復孔，反應程序：95 ℃下預變性10 s；95 ℃下循環(huán)變性5 s，58 ℃下退火復性15 s，72 ℃下延伸20 s，共進行34個循環(huán)。按照 2-ΔΔCt法計算基因相對表達量，采用 SPSS 19軟件進行統(tǒng)計學分析。

1.2.3EcHSP70原核表達載體構(gòu)建 PCR反應體系(20 μL)：上、下游引物(HSP70-S和HSP70-A，10 μmol/L)各1 μL，cDNA模板1 μL，EXTaq10 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應程序：94 ℃下預變性5 min；94 ℃下循環(huán)變性30 s，55 ℃下退火復性30 s，72 ℃下延伸90 s，共進行35個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后進行膠回收，與表達載體pGEX-4T-1質(zhì)粒DNA進行SmaⅠ和XhoⅠ雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)檢測后進行膠回收，用T4 DNA連接酶連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α中，利用氨芐西林篩選陽性克隆。陽性克隆經(jīng)PCR鑒定后送生工生物工程(廣州)股份有限公司進行測序。正確的陽性克隆命名為EcHSP70-4T。

1.2.4EcHSP70-4T載體誘導表達條件的優(yōu)化 將構(gòu)建好的EcHSP70-4T重組載體導入到E.coliBL21感受態(tài)細胞中，挑取陽性單克隆震蕩培養(yǎng)后加入IPTG誘導。根據(jù)相關(guān)文獻資料，對EcHSP70重組蛋白的表達條件進行優(yōu)化[18]，溫度設(shè)為37、28、16 ℃，IPTG濃度設(shè)為1.0、0.6、0.2 mmol/L，并取各組樣品進行SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.5EcHSP70-4T重組蛋白純化 取200 mL重組質(zhì)粒菌液，37 ℃下以1.0 mmol/L IPTG誘導6 h，經(jīng)破碎后以10 000×g離心30 min，去除上清，用玻璃棒將細菌碎片撥掉，盡量去除細菌碎片，用Washing buffer 洗滌3次，每次洗滌后以10 000×g離心10～20 min，第3次洗滌后用Resuspension buffer 充分重懸包涵體，以10 000×g離心10～20 min，以質(zhì)量濃度為30 mg/mL 的尿素4 ℃下攪拌溶解后，再以10 000×g離心10～20 min，取上清50 μL制成樣品，進行SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.6EcHSP70-4T重組蛋白Western blot鑒定 將純化后的EcHSP70-4T重組蛋白進行SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)印到PVDF膜，經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為5%的脫脂奶粉4 ℃下封閉過夜，用TBST洗滌3次(10 min/次)，加入小鼠抗GET標簽的單克隆抗體(1∶10 000)，室溫下孵育2 h，再用TBST洗滌4次(10 min/次)，加入HRP標記的山羊抗小鼠IgG(H+L)(1∶1 000)，室溫下孵育2 h，用TBST洗滌4次(10 min/次)，采用ECL超敏發(fā)光液顯影并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 EcHSP70基因原核表達質(zhì)粒構(gòu)建

通過PCR擴增斜帶石斑魚HSP70基因，命名為EcHSP70(GenBank登錄號：MW411059)，擴增產(chǎn)物經(jīng)過凝膠電泳檢測，得到1 521 bp的目的條帶(圖1)，經(jīng)切膠回收、雙酶切連接載體后檢測，結(jié)果顯示，插入的EcHSP70基因結(jié)構(gòu)域完整，表明EcHSP70-4T重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 EcHSP70基因的PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR products of EcHSP70 gene

2.2 LPS與Poly I∶C刺激GS細胞后EcHSP70的表達差異

從圖2可見：LPS刺激GS細胞后，EcHSP70基因表達上調(diào)，在4 h達到最高(P<0.05)，隨后逐漸降至0 h水平；而Poly I∶C刺激GS細胞后，EcHSP70基因逐漸上升，在12 h時達到峰值。

*表示該組與0 h組有顯著性差異(P<0.05)。*indicates significant differences compared to 0 h (P<0.05) .圖2 LPS與Poly I∶C刺激后EcHSP70基因表達模式Fig.2 Expression profiles of EcHSP70 post LPS and Poly I∶C stimulation

2.3 重組蛋白的誘導表達與可溶性分析

分別取pGEX-4T-1未誘導組與誘導組、EcHSP70-4T未誘導組與誘導組樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果顯示，pGEX-4T-1載體經(jīng)過誘導后，在相對分子質(zhì)量為26 000處有明顯的GST標簽表達，而EcHSP70-4T重組蛋白經(jīng)過誘導后，其表達的EcHSP70蛋白相對分子質(zhì)量約為96 000，與預期的目的條帶相符(圖3)。

取EcHSP70-4T陽性克隆分別在37、28、16 ℃，以及1.0、0.6、0.2 mmol/L 3個不同IPTG濃度下進行誘導。SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果顯示，EcHSP70-4T重組蛋白在3個溫度下的IPTG誘導組、上清組、沉淀組均有表達，且主要以包涵體形式表達，其中在37 ℃、IPTG為1.0 mmol/L條件下誘導的重組蛋白表達量最高(圖4)。

M—蛋白分子量標準；1～3—1.0 mmol/L IPTG誘導組、上清組、沉淀組；4～6—0.6 mmol/L IPTG誘導組、上清組、沉淀組；7～9—0.2 mmol/L IPTG誘導組、上清組、沉淀組。M—protein marker；1-3—groups of recombinant protein，supernatant，and inclusion induced by 1.0 mmol/L IPTG；4-6—groups of recombinant protein，supernatant，and inclusion induced by 0.6 mmol/L IPTG; 7-9—groups of recombinant protein，supernatant，and inclusion induced by 0.2 mmol/L IPTG.圖4 37、28、16 ℃組EcHSP70-4T重組蛋白IPTG濃度優(yōu)化Fig.4 Concentration optimization of recombinant protein of EcHSP70-4T IPTG in 37，28，and 16 ℃ groups

2.4 EcHSP70-4T重組蛋白的純化

對包涵體進行純化后，利用SDS-PAGE檢測，結(jié)果如圖5所示，純化后的包涵體條帶較單一，純度較高，可用于后續(xù)試驗。

M—蛋白分子量標準；1—純化的EcHSP70-4T包涵體蛋白。M—protein marker;1—purified EcHSP70-4T recombinant protein.圖5 EcHSP70-4T重組蛋白的純化Fig.5 Purification of EcHSP70-4T recombinant protein

2.5 重組蛋白的Western blot 鑒定

純化后的樣品經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，進行 Western blot 鑒定，結(jié)果如圖6所示，在相對分子質(zhì)量約96 000處有明顯的條帶，與重組蛋白的大小一致。

M—蛋白分子量標準；1—純化的EcHSP70-4T重組蛋白。M—protein marker; 1—purified EcHSP70-4T recombinant protein.圖6 EcHSP70-4T重組蛋白的Western blot鑒定Fig.6 Western blot of EcHSP70-4T recombinant protein

3 討論

3.1 LPS與Poly I∶C刺激GS細胞后EcHSP70基因的表達差異分析

HSP70蛋白在維持細胞穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮著重要作用，熱休克、重金屬、輻射、紫外線、磁場、細菌、病毒等刺激均可誘導該蛋白的表達[16，19]。LPS作為一種內(nèi)毒素和重要群特異性抗原，為革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要成分，能刺激細胞釋放炎癥因子，誘導細胞凋亡[21-23]。本研究中，LPS刺激斜帶石斑魚脾臟細胞過程中EcHSP70基因的表達趨勢，與Cui等[24]利用溶藻弧菌刺激斜帶石斑魚細胞時HSP70基因相對表達量的趨勢類似。而Poly I∶C是雙鏈RNA的類似物，能激活TLR3、PKR等細胞表面受體，誘導干擾素表達。Poly I∶C可以被MDA5和TLR3識別，從而激活Ⅰ型IFN的表達[25-26]。本研究表明，EcHSP70可能參與了IFN表達的調(diào)控。神經(jīng)壞死病毒是魚類養(yǎng)殖中危害嚴重的一種RNA病毒，已有研究表明，石斑魚干擾素通路的相關(guān)因子如IRF3、MDA5及ISG15等均能影響該病毒的增殖[27]，因此筆者推測，EcHSP70可能通過調(diào)節(jié)IFN的表達參與石斑魚抗病毒免疫，后續(xù)將進一步對EcHSP70的功能展開分析。本研究中，EcHSP70基因在LPS和Poly I∶C刺激后表達上調(diào)，表明該分子可能參與了石斑魚抗感染免疫反應。

3.2 EcHSP70-4T重組蛋白的制備

為了進一步研究HSP70的功能，本研究中構(gòu)建了EcHSP70的原核表達質(zhì)粒EcHSP70-4T。pGEX-4T-1 作為一種常用的原核表達載體，所表達的蛋白在N 端帶有一個GST標簽蛋白，其相對分子質(zhì)量約為26 000。pGEX-4T-1 載體能在IPTG誘導下高效表達外源蛋白，且表達的融合蛋白又可通過GST 親和層析柱簡便、快速地純化，得到高純度的蛋白，所以許多原核表達研究使用pGEX-4T-1載體。

本研究中，誘導EcHSP70-4T重組蛋白表達并經(jīng)SDS-PAGE檢測，結(jié)果顯示，在接近相對分子質(zhì)量100 000處出現(xiàn)目的條帶，與預期相符。其中，溫度為37 ℃，IPTG為終濃度為0.6、1.0 mmol/L的誘導組上清有少量EcHSP70蛋白存在，所有組別的沉淀組與上清組相比，沉淀組在相對分子質(zhì)量約96 000處有明顯條帶，說明斜帶石斑魚EcHSP70蛋白主要以包涵體形式表達。后續(xù)研究中將對獲得的EcHSP70重組蛋白進行復性，并利用復性后的EcHSP70通過GST pull down技術(shù)釣取與該蛋白互作的病毒或細胞蛋白，為進一步了解該蛋白在抗病毒免疫中的作用網(wǎng)絡及機制奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

1)EcHSP70在LPS和Poly I∶C刺激后表達上調(diào)，表明該基因可能參與了石斑魚抗感染免疫反應。

2)經(jīng)SDS-PAGE檢測，EcHSP70-4T重組蛋白相對分子質(zhì)量約為96 000，并以包涵體形式表達。