趙錫蝶，鄭海玲，劉明明，湯雨，喬秀亭，劉群，黃宗海，程鎮(zhèn)燕*

(1.天津農(nóng)學院 水產(chǎn)學院，天津市水產(chǎn)生態(tài)與養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384；2.天津市動物疫病預防控制中心，天津 300402；3.天津農(nóng)學院 食品科學與生物工程學院，天津300384)

凡納濱對蝦Litopenaeusvannamei殼薄體肥、肉質(zhì)鮮美、含肉率高、營養(yǎng)豐富，與斑節(jié)對蝦Penaeusmonodon和日本對蝦P.japonicus并稱為世界三大對蝦養(yǎng)殖品種[1]。近年來，隨著中國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展，凡納濱對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量持續(xù)增加，對飼料的需求也不斷上漲，作為飼料主要原料的魚粉和魚油，由于資源短缺、價格高，限制了其在飼料中的使用[2]，然而，當用廉價而資源豐富的植物蛋白源替代魚粉時，養(yǎng)殖動物的健康就會受到一定影響，尤其會導致動物腸道產(chǎn)生一些病理變化[3-4]。

近年來，有機酸作為一種高效、無污染、無殘留的保健型飼料添加劑，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中越來越受到歡迎。大量研究表明，有機酸能降低胃腸道的pH值，促進營養(yǎng)物質(zhì)的消化，從而提高飼料的利用率，并促進動物的生長[5]。此外，有機酸還能抗菌、抑菌，并能提高機體的抗氧化能力，提高魚蝦的免疫力、抗病能力[6-8]。林雪等[9]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加0.2%(質(zhì)量分數(shù)，下同)以檸檬酸和延胡索酸為主要成分的酸化劑，可顯著提高羅非魚血清T-AOC、ACP及AKP活性，提高了魚體的抗氧化性能和免疫功能, 增強了抗應激能力，同時還能在檸檬酸和延胡索酸的協(xié)同作用下調(diào)節(jié)代謝過程，減少有害微生物對宿主的傷害。栗雄高[1]研究發(fā)現(xiàn)，在凡納濱對蝦飼料中添加0.2%～0.3%檸檬酸能促進凡納濱對蝦生長，提高消化酶活性和免疫功能，并通過促進蝦腸道內(nèi)有益菌的繁殖抑制有害菌繁殖，使腸道菌群結(jié)構(gòu)向有益方面改變，促進維生素、鈣等元素的吸收，從而提高了水產(chǎn)動物的抗病能力和抵抗力。尚衛(wèi)敏等[10]發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加檸檬酸和乳酸可以提高草魚Ctenopharyngodonidellus血清超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和溶菌酶活性，提高草魚的抗氧化能力和免疫功能。羅玲等[7]和魏朝青等[8]均研究發(fā)現(xiàn)，丁酸鈉可以提高團頭魴Megalobramaamblycephala和大菱鲆Scophthalmusmaximus的抗氧化能力。Ring?[11]發(fā)現(xiàn)，在北極鮭Salvelinusalpinus日糧飼料中補充丙酸鈉可降低棕櫚酸含量，促進生長和消化。

本試驗中，選取檸檬酸鈉、丁酸鈉、丙酸鈉和延胡索酸4種有機酸，研究了其對凡納濱對蝦生長、免疫和腸道健康的影響，以期為促進對蝦養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料

養(yǎng)殖試驗在天津市西青區(qū)畜牧基地水產(chǎn)局養(yǎng)殖試驗示范基地進行，試驗用凡納濱對蝦由試驗基地提供。

1.2 方法

1.2.1 試驗飼料制備 試驗設正對照組(記為D0，含24%進口魚粉和18%豆粕的基礎飼料，為高魚粉組)和負對照組(記為D1，含12%進口魚粉和36%豆粕，為低魚粉組)，在負對照組飼料基礎上分別添加0.3%檸檬酸鈉、0.3%丁酸鈉、0.3%丙酸鈉和0.3%延胡索酸(均為質(zhì)量分數(shù)，下同)，記為D2、D3、D4、D5，并以正對照組為參考補充賴氨酸和蛋氨酸，制成等氮等能的6種試驗飼料。試驗飼料組成及營養(yǎng)成分水平見表1、表2(能量為計算值，其余為實測值)。飼料制作過程中，將所有飼料原料粉碎后過198 μm孔徑篩，然后加入魚油、磷脂、魷魚膏和蒸餾水，混合均勻后制成直徑為2 mm的硬性顆粒飼料，最后自然冷卻風干后收放在密封袋中，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗飼料原料組成Tab.1 Ingredients of the experimental diets w/%

表2 試驗飼料營養(yǎng)成分(干質(zhì)量)Tab.2 Nutrient content of experimental diets(dry mass)

1.2.2 試驗設計與養(yǎng)殖管理 選取大小均勻、體格健康的對蝦720尾隨機分成6組，每組設3個平行，共用18個網(wǎng)箱(100 cm×100 cm×150 cm)，每個網(wǎng)箱投放40尾試驗蝦(體質(zhì)量為7.54 g±0.40 g)，養(yǎng)殖周期為42 d。養(yǎng)殖期間，水溫為24～30 ℃，pH為8.42～8.88，溶解氧為7.11～8.97 mg/L，亞硝酸鹽≤0.01 mg/L，氨氮≤0.2 mg/L。

1.2.3 樣品采集 養(yǎng)殖試驗結(jié)束時，對試驗蝦禁食24 h，稱重計數(shù)。使用經(jīng)抗凝劑潤洗過的1 mL無菌注射器從蝦頭胸甲腹竇采集血液樣本，置于2 mL含有EDTA-2Na的離心管中，以3 000 r/min離心10 min，取血清于-80 ℃超低溫冰箱中保存。于無菌環(huán)境中取出腸道內(nèi)容物置于凍存管中，液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2.4 生長指標測定與計算 增重率(WGR，%)、特定生長率(SGR，%/d)、飼料系數(shù)(FCR)計算公式分別為

WGR=(mt-m0)/W0×100%，

(1)

SGR=(lnmt-lnm0)/t×100%，

(2)

FCR=F/(mt-m0)。

(3)

其中：m0、mt分別為試驗初始和終末凡納濱對蝦的總質(zhì)量(g)；F為養(yǎng)殖過程投餌干質(zhì)量(g)；t為養(yǎng)殖時間(d)。

1.2.5 血清抗氧化及免疫指標測定 根據(jù)南京建成生物工程研究所相應試劑盒操作說明書檢測凡納濱對蝦血清酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LSZ)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。

1.2.6 腸道及內(nèi)容物多樣性測定 將凡納濱對蝦腸道內(nèi)容物在北京科學院微生物研究所基因組研究中心進行測序分析。將檢測合格的微生物DNA樣本對其指定區(qū)域進行PCR擴增、文庫制備、文庫質(zhì)檢、定量，使用設定的TAG序列進行樣本區(qū)分。采用Illumina Hiseq 2500高通量測序平臺對檢測合格的文庫進行測序?；趦?yōu)化序列進行OTU聚類分析和物種分類注釋，基于OTU聚類結(jié)果進行多樣性指數(shù)分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 測序基本數(shù)據(jù)處理 采用Flash軟件對原始數(shù)據(jù)進行拼接，拼接得到的序列采用Trimmomatic進行質(zhì)量過濾，用UCHIME去除嵌合體，最終得到高質(zhì)量的Tags序列。在一致性97%的水平上對序列進行聚類，以測序所有序列數(shù)的0.005%作為閾值過濾OTU。

1.3.2 統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標準差(mean ± S.D.)表示。采用SPSS 19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，再用Duncan 法進行組間多重比較，顯著性水平設為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 凡納濱對蝦生長性能的變化

從表3可見：與正對照組(高魚粉組)相比，負對照組(低魚粉組)凡納濱對蝦的終末體質(zhì)量、增重率、特定生長率均顯著降低(P<0.05)，飼料系數(shù)顯著升高(P<0.05)；而在負對照組基礎上，添加0.3%丁酸鈉與0.3%檸檬酸鈉，凡納濱對蝦的增重率和特定生長率均顯著高于負對照組(P<0.05)，飼料系數(shù)顯著低于負對照組(P<0.05)，添加0.3%丙酸鈉和0.3%延胡索酸，凡納濱對蝦終末體質(zhì)量、增重率和特定生長率與負對照組無顯著性差異(P>0.05)；添加有機酸后，丁酸鈉組終末體質(zhì)量、增重率和飼料系數(shù)與正對照組無顯著性差異(P>0.05)，但特定生長率較正對照組顯著提高(P<0.05)，檸檬酸鈉組對蝦終末體質(zhì)量、特定生長率與正對照組無顯著性差異(P>0.05)。由此可見，添加檸檬酸鈉和丁酸鈉緩解了高豆粕替代魚粉造成的凡納濱對蝦增重率和特定生長率的下降。

2.2 凡納濱對蝦血清抗氧化及免疫指標的變化

從表4可見：與正對照組(高魚粉組)相比，負對照組(低魚粉組)凡納濱對蝦血清ACP、AKP、SOD、LSZ活性均顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)；與負對照組相比，添加0.3%檸檬酸鈉后，凡納濱對蝦血清ACP、AKP和LSZ活性均顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)，SOD活性呈現(xiàn)上升趨勢但無顯著性差異(P>0.05)；與負對照組相比，添加0.3%丁酸鈉后，血清ACP、SOD和LSZ活性顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)；與負對照組相比，添加0.3%丙酸鈉和0.3%延胡索酸后，AKP和SOD活性均顯著降低(P<0.05)，LSZ活性顯著升高(P<0.05)，丙酸鈉組MDA含量顯著降低(P<0.05)；添加有機酸后，除檸檬酸鈉和丁酸鈉組ACP外，各組ACP、AKP、SOD、LSZ酶活性均顯著低于正對照組(P<0.05)。

2.3 凡納濱對蝦腸道內(nèi)容物菌群微生物Alpha多樣性的變化

從表5可見：測序樣本中覆蓋率均大于99%，因而測序結(jié)果可代表凡納濱對蝦腸道內(nèi)容物中微生物的真實情況；各組凡納濱對蝦腸道內(nèi)容物的OTU數(shù)目、Chao1指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)(Shannon)和辛普森指數(shù)(Simpson)均無顯著性差異(P>0.05)；添加0.3%檸檬酸鈉和0.3%丁酸鈉后，OTU數(shù)目、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)值與正對照組內(nèi)容物菌群數(shù)值最相近，添加0.3%丙酸鈉和0.3%延胡索酸后，物種豐富度及物種多樣性均較正對照組升高，與負對照組接近。

2.4 凡納濱對蝦腸道內(nèi)容物菌群結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 基于門水平的菌群結(jié)構(gòu)分析 各組腸道內(nèi)容物菌群結(jié)構(gòu)在門水平上的組成如圖1所示，6個組的菌群在門水平上，主要由變形菌門Proteobacteria、藍藻門Cyanobacteria、放線菌門Actinobacteria、疣微菌門Verrucomicrobia、浮酶菌門Planctomycetes和厚壁菌門Firmicutes組成，相對豐度均達到94%以上，但是在各組所占比例有所不同。變形菌門、藍藻門、放線菌門、疣微菌門、浮酶菌門和厚壁菌門6個優(yōu)勢菌門在正對照組的占比分別為46.72%、11.48%、12.24%、12.49%、10.40%、1.42%，在負對照組的占比分別為35.13%、18.28%、8.31%、18.01%、12.91%、2.19%，在檸檬酸鈉組的占比分別為38.09%、7.27%、33.53%、5.70%、7.61%、3.13%，在丁酸鈉組的占比分別為24.37%、21.88%、7.51%、26.37%、14.40%、1.19%，在丙酸鈉組的占比分別為28.73%、23.57%、9.62%、17.68%、14.44%、1.38%，在延胡索酸組的占比分別為33.09%、17.93%、19.88%、10.45%、10.94%、2.09%。與正對照組相比，負對照組放線菌門的相對豐度有所下降，而浮酶菌門和藍藻門的相對豐度有所上升。在負對照組中添加0.3%檸檬酸鈉后，浮酶菌門和藍藻門的相對豐度低于負對照組，放線菌門的相對豐度高于負對照組；添加0.3%丁酸鈉和0.3%丙酸鈉后，浮酶菌門和藍藻門的相對豐度高于負對照組和正對照組，放線菌門的相對豐度低于負對照組和正對照組；添加0.3%延胡索酸后，浮酶菌門的相對豐度低于負對照組，放線菌門和藍藻門的相對豐度高于負對照組和對照組。綜上，添加0.3%檸檬酸鈉和0.3%延胡索酸后，凡納濱對蝦的腸道內(nèi)容物物種豐度與正對照組相似。

2.4.2 基于科水平的菌群結(jié)構(gòu)分析 各組腸道內(nèi)容物菌群結(jié)構(gòu)在科水平上的組成如圖2所示，豐度超過0.25%的菌科有15個，其中，主要優(yōu)勢種有軟骨桿菌科Chthoniobacterales、扁平菌科Planctomycetaceae、紅桿菌科Rhodobacteraceae、腸桿菌科Enterobacteriaceae、長頸菜科Golenkinia longispicula和希氏藻科Shewanellaceae等。

圖2 凡納濱對蝦腸道內(nèi)容物基于科水平的菌群組成Fig.2 Composition of the microflora in intestinal contents of Pacific white leg shrimp micro florain Litopenaeus vannamei on family level

2.5 凡納濱對蝦腸道內(nèi)容物菌群差異性分析

2.5.1 腸道內(nèi)容物菌群相對豐度分布 用相對豐度的常用對數(shù)(logarithm of relative abundance，LDA)值統(tǒng)計不同組別中有顯著作用的微生物類群，柱狀圖長度代表顯著差異物種的影響大小。如圖3所示，腸桿菌科在正對照組中顯著上調(diào)，漆草科Lachnospiraceae和未培養(yǎng)細菌unculturedbacterium在負對照組中顯著上調(diào)，雙歧桿菌科Bifidobacteriaceae在檸檬酸鈉組中顯著上調(diào)，梭桿菌科Fusobacteriaceae在丁酸鈉組中顯著上調(diào)，0319_6G20菌科在丙酸鈉組中顯著上調(diào)，類桿菌目Bacteroidales在延胡索酸組中顯著上調(diào)。這表明，添加不同的有機酸影響腸道菌群不同種類的豐度。

圖3 不同處理組對蝦腸道內(nèi)容物顯著差異菌群相對豐度Fig.3 Relative abundance of the significantly different microflora in the intestinal contents of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei in different treatment groups

2.5.2 在科水平上不同組的顯著差異菌群相對豐度比較 從表6可見：丁酸鈉組的梭桿菌科相對豐度高于其他組，但各組間無顯著性差異(P>0.05)；檸檬酸鈉組的雙歧桿菌科和類桿菌科相對豐度最高，且顯著高于其他組(P<0.05)；正對照組的腸桿菌科相對豐度最高，檸檬酸鈉組次之；負對照組的漆草科相對豐度分布最高，其次是檸檬酸鈉組。由此可見，添加0.3%檸檬酸鈉提高了腸桿菌、雙歧桿菌、類桿菌的組內(nèi)相對豐度，添加0.3%丁酸鈉提高了梭桿菌的相對豐度。

表6 豆粕替代魚粉并添加有機酸對凡納濱對蝦腸道內(nèi)容物顯著差異菌群科水平相對豐度的影響Tab.6 Effects of fish meal replaced by soybean meal and supplemented with different organic acids on the bacterial relative abundance in the significantly different microflora in the intestinal contents in Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei on family level

2.5.3 Dadogram進化分支圖 Lefse進化分支圖如圖4所示，其中，由內(nèi)至外輻射的圓圈代表了由門至屬的分類級別。在不同分類級別上的每一個小圓圈代表該水平下的一個分類，小圓圈直徑大小與相對豐度大小成正比。無顯著性差異的物種統(tǒng)一著色為黃色，差異物種跟隨組進行著色，紅色節(jié)點表示在紅色組別中起到重要作用的微生物類群，綠色節(jié)點表示在綠色組別中起到重要作用的微生物類群，其他圈顏色意義類同。結(jié)果顯示，腸桿菌在正對照組發(fā)生富集，JG35_K1_AG5和漆草科菌在負對照組發(fā)生富集，雙歧桿菌在檸檬酸鈉組發(fā)生富集，梭桿菌在丁酸鈉組發(fā)生富集，0319_6G20菌科在丙酸鈉組發(fā)生富集，類桿菌在延胡索酸組發(fā)生富集，這與圖3顯示結(jié)果一致。

圖4 從門到屬的Lefse進化分支圖Fig. 4 Lefse evolutionary branch diagram from phylum to genus

3 討論

3.1 飼料中添加有機酸對凡納濱對蝦生長性能的影響

有機酸在水產(chǎn)動物養(yǎng)殖飼料中起著誘食劑的作用，在魚蝦類飼料中添加有機酸能夠促進魚蝦攝食，促進水產(chǎn)動物生長[1]。本試驗中發(fā)現(xiàn)，與正對照組(高魚粉組)相比，負對照組(低魚粉組)凡納濱對蝦的生長受到了抑制，而在負對照組基礎上添加0.3%檸檬酸和0.3%丁酸鈉后，凡納濱對蝦的特定生長率和增重率均較負對照組顯著升高，飼料系數(shù)顯著降低，且與高魚粉的正對照組相比，0.3%丁酸鈉組凡納濱對蝦也體現(xiàn)出了生長優(yōu)勢。這表明，檸檬酸和丁酸鈉能夠緩解高豆粕對凡納濱對蝦帶來的生長抑制，并有效促進其生長。與此相似，Liu等[12]研究表明，丁酸鈉不僅能改善魚類生長性能，增加腸道吸收面積，而且能減輕固有層混合白細胞的浸潤，證明有機酸對魚類腸道免受豆粕的損傷有積極作用，從而促進魚類生長。齊鑫等[13]、孫浪等[14]、張曉曉等[15]分別在鱘、湘云鯽、凡納濱對蝦飼料中添加丁酸鈉也出現(xiàn)相似結(jié)果。栗雄高[1]、潘慶等[16]、Sarker 等[17]和 Khajepour等[18]則在凡納濱對蝦、羅非魚、鯛和達氏鰉飼料中添加檸檬酸同樣出現(xiàn)相似結(jié)果。相關(guān)研究表明，延胡索酸(又稱富馬酸)也可作為飼料添加劑，張玲等[19]發(fā)現(xiàn)，添加0.6%以檸檬酸、磷酸、富馬酸為主要成分的酸化劑可顯著提高草魚特定生長率，降低飼料系數(shù)。本試驗中，低魚粉飼料中添加0.3%丙酸鈉和延胡索酸，凡納濱對蝦的生長性能與負對照組無顯著性差異，這與石澤[20]在無魚粉飼料中添加富馬酸后對建鯉的生長性能、營養(yǎng)物質(zhì)與粗蛋白質(zhì)消化率無顯著性影響的結(jié)果一致，潘慶等[21]對羅非魚的研究中也得出相似結(jié)果。而Bjerkeng 等[22]則報道飼料中添加乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉的混合物對大西洋鮭生長性能無顯著影響。研究結(jié)果出現(xiàn)差異的原因，可能是由于添加有機酸鹽水平或者動物種類不同，飼糧蛋白質(zhì)含量不同，酸的結(jié)合力就不同，消耗有機酸鹽的量也不同。

3.2 飼料中添加有機酸對凡納濱對蝦血清抗氧化及免疫指標的影響

凡納濱對蝦主要依靠非特異免疫系統(tǒng)防御病害因子，其中，最重要的免疫應答因子有ACP、AKP、LSZ[6]。LSZ有殺菌、抗炎、抗病毒等作用，MDA是脂質(zhì)過氧化與氧化損傷最重要的產(chǎn)物[23-24]，其含量反映了生物體的脂質(zhì)過氧化水平，其含量降低代表機體抗氧能力的提高[24]。SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用。SOD和MDA都是表現(xiàn)機體抗氧化能力的重要指標。Zhu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在植物蛋白源飼料中補充有機酸，能顯著降低黃鲇血清SOD和CAT活性以及肝臟中CAT活性，這表明，有機酸能保護魚體免受植物蛋白源引起的氧化損傷。本試驗中，負對照組對蝦血清ACP、AKP、SOD、LSZ活性較正對照組均顯著降低，MDA含量顯著升高，說明在飼料中添加過高含量的豆粕會降低凡納濱對蝦的非特異性免疫應答，同時降低對蝦機體的抗氧化能力，造成對蝦免疫系統(tǒng)的失衡，從而影響對蝦的生長與免疫能力，這與段晶等[26]的研究結(jié)果一致。本試驗中，在負對照組飼料基礎上添加0.3%檸檬酸鈉和0.3%丁酸鈉后，ACP、AKP、SOD、LSZ活性較負對照組均有升高，MDA含量降低，基本達到正對照組的水平，添加0.3%丙酸鈉后，MDA含量較負對照組顯著降低，甚至達到正對照組水平。這表明，在飼料中添加有機酸能夠延緩飼料的氧化，減少水產(chǎn)飼料的浪費，且能緩解豆粕對凡納濱對蝦造成的機體損傷，降低因豆粕替代引起的MDA含量的增加，從而提高其抗氧化的能力和免疫功能，這與尚衛(wèi)敏等[10]、石澤[20]、張曉曉等[15]研究結(jié)果一致。

3.3 飼料中添加有機酸對凡納濱對蝦腸道內(nèi)容物微生物菌群的影響

腸道內(nèi)容物菌群與對蝦腸道健康有著密切的關(guān)系。本試驗中，在負對照組中添加0.3%檸檬酸鈉和0.3%丁酸鈉，腸道內(nèi)容物菌群的物種豐富度和多樣性與正對照組最相似，但添加0.3%丙酸鈉和0.3%延胡索酸物種豐富度及物種多樣性與負對照組接近。同時，檸檬酸鈉組和丁酸鈉組的飼料pH與正對照組最接近，丙酸鈉組的飼料pH較正對照組偏高，而延胡索酸組的飼料pH相比于正對照組偏低。這說明腸道內(nèi)容物的菌群豐富度與多樣性可能與飼料pH有關(guān)。石澤[20]研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加有機酸鹽可造成飼料中pH在一定程度上有所降低，同時研究發(fā)現(xiàn)，只有檸檬酸組的建鯉在攝食0.5 h后前腸食糜pH有降低的趨勢。而Su等[27]研究發(fā)現(xiàn)，在凡納濱對蝦飼料中添加0.25%～0.30%的檸檬酸能提高腸道消化酶活性，從而改善其生長性能。這表明，飼料pH可以影響腸道內(nèi)容物的pH，通過激活蛋白酶影響腸道內(nèi)容物的菌群變化，影響對蝦腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而影響對蝦的生長，Gao等[28]的研究結(jié)果中也證實了有機酸對腸道菌群平衡具有積極作用。

有機酸還可以促進腸道有益菌群的增殖，抑制有害菌的繁殖，進而提高免疫能力。研究表明，有機酸和揮發(fā)油混合物對腸道菌群有較好的影響，可提高太平洋對蝦的免疫應答和抗病性[29]。本試驗中，各組在門水平上的菌群主要由變形菌門、藍藻門、放線菌門、疣微菌門、浮酶菌門、厚壁菌門組成，這與吳金鳳等[30]、李可等[31]的研究結(jié)果一致，證明凡納濱對蝦腸道內(nèi)容物菌群組成具有一定的保守性，藍藻門的豐度偏高可能是由于飼養(yǎng)環(huán)境為室外水體，對蝦的攝食并不完全來自養(yǎng)殖飼料，對蝦攝食水體中的藻類，使得對蝦腸道內(nèi)容物的多樣性增高。本試驗中發(fā)現(xiàn)，飼料中添加過高水平的豆粕降低了放線菌的豐度，在低魚粉水平下添加0.3%檸檬酸鈉后提高了放線菌的豐度，科水平上雙歧桿菌和類桿菌在檸檬酸鈉組發(fā)生富集且顯著高于正對照組，表明檸檬酸鈉促進雙歧桿菌和類桿菌的增長，這與王麗娜等[24]的研究結(jié)果一致，說明檸檬酸鈉有利于雙歧桿菌和乳酸菌等有益菌的繁殖增長，對大腸桿菌和沙門菌屬等有害菌具有抑制作用；梭桿菌在丁酸鈉組發(fā)生富集，其次是丙酸鈉組和延胡索酸組，表明丁酸鈉促進梭桿菌的增殖，同時也表明添加不同的有機酸會影響腸道不同種類菌群的豐度，這與曾晨爔等[23]的研究結(jié)果相符；根瘤菌依附于植物生長，在負對照組漆草科和根瘤菌顯著高于其他組，可能與負對照組中的藍藻門數(shù)量高有關(guān)。本試驗中，腸道菌群的結(jié)果與生長、免疫方面的結(jié)果體現(xiàn)了一致性，低魚粉飼料中添加檸檬酸鈉和丁酸鈉后不僅可以促進凡納濱對蝦生長、提高抗病力，還可以調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡。

4 結(jié)論

1)本試驗條件下，高比例豆粕替代魚粉后，凡納濱對蝦生長受到抑制，免疫力降低，優(yōu)勢菌群豐度下降，尤其以放線菌門最為突出。

2)高比例豆粕替代魚粉并添加有機酸后，凡納濱對蝦生長、免疫力得到了不同程度的提高，并能改善腸道菌群的平衡。綜合分析，4種有機酸中以丁酸鈉和檸檬酸鈉添加效果最佳。