何 雙 溫菲菲 許曉陽 李揚揚 崔忠澤 路麗禎 吳淑華

濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科(256603)

結直腸癌的發(fā)生是一個非常復雜的過程，目前公認的經典癌變途徑是腺瘤-腺癌(正常腸黏膜-腺瘤-腺癌)序列[1]。本課題組的前期研究[2]結果顯示，在腺瘤癌變過程中，細胞自噬發(fā)揮了重要作用。而另外一種重要的細胞內死亡方式——凋亡在早期結直腸癌演進過程中的變化規(guī)律尚不明確。程序性細胞死亡因子4(programmed cell death 4, PDCD4)在細胞凋亡過程中發(fā)揮重要的調控作用，然而，PDCD4對早期結直腸癌發(fā)生的作用及其與自噬的關系鮮見相關報道。本研究通過采用免疫組化法檢測PDCD4、自噬相關因子LC3Ⅱ和p62在癌旁正常腸黏膜(paracancer normal intestinal mucous membranes, P-NIMM)、癌旁低級別上皮內瘤變(paracancer low-grade intraepithelial neoplasia, P-LGIN)、癌旁高級別上皮內瘤變(paracancer high-grade intraepithelial neoplasia, P-HGIN)和結直腸腺癌(colorectal adenocarcinoma)中的表達情況以及相關性，旨在探討凋亡和自噬在早期結直腸癌發(fā)生中的相互作用及其臨床意義。

對象與方法

一、研究對象

選取2015年1月—2020年11月在濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院接受內鏡黏膜下剝離術(ESD)切除且病理診斷為結直腸腺癌的標本54例。所有患者均首次確診為結直腸腺癌，未進行任何治療，基底切緣均為陰性，確保為T1期結直腸癌。HE切片由2位資深病理專家根據相關標準[3-4]重新閱片，緊密結合內鏡下表現，同時注重細胞異型性與結構異型性。本研究方案由濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院倫理委員會審批通過。

二、方法

1. 免疫組化法：全部標本經4%甲醛溶液固定，石蠟包埋后4 μm厚連續(xù)切片；經二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水后，檸檬酸熱修復2 min；滴加兔抗人PDCD4(Abcam公司，稀釋濃度為1∶500)、兔抗人LC3Ⅱ(Abcam公司，稀釋濃度為1∶200)、兔抗人p62(Abcam公司，稀釋濃度為1∶200)，4 ℃過夜；PBS洗滌后滴加通用型二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)，37 ℃孵育30 min；DAB顯色2 min，經蘇木素復染后鹽酸乙醇分化、脫水、中性樹膠封片。PDCD4、LC3Ⅱ的陽性對照分別為扁桃體和正常腦組織，p62陽性對照為已知陽性的宮頸癌組織，采用PBS代替一抗作為陰性對照。

結果判斷：PDCD4表達于細胞核或細胞質，LC3Ⅱ和p62表達于細胞質，均以細胞出現棕黃色顆粒為陽性標志。采用染色強度與陽性細胞率之積作為染色總分，染色強度：不著色，0分；淡黃色，1分；棕黃色，2分；黃褐色，3分。陽性細胞率：陽性細胞數<5%，0分；5%～30%，1分；31%～60%，2分；≥60%，3分?？偡?～4分判斷為陰性，6～9分為陽性。

2. UCSC數據庫分析PDCD4在泛癌中的表達情況：通過UCSC數據庫(https://xenabrowser.net/heatmap/)下載TCGA數據庫中33種癌相關基因表達數據。使用Perl軟件對數據進行整理，得到矩陣文件。應用R軟件進行差異表達分析。

三、統計學分析

使用SPSS 20.0統計學軟件，所得數據以率或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗；相關性分析采用Spearman相關性分析。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、結直腸腺癌患者的臨床病理特征分析

54例接受ESD治療的早期結直腸腺癌患者中，男性40例，女性14例，男女比為2.9∶1，男性早期結直腸腺癌的檢出率高于女性；年齡39～83歲，中位年齡64歲；病變位于右半結腸者6例，左半結腸者48例，以直腸檢出率最高；44例(81.5%)腺癌周邊伴發(fā)腺瘤性病變，其余10例周邊僅見正常腸黏膜。44例伴發(fā)腺瘤病變的患者中，25例僅伴發(fā)LGIN，9例僅伴發(fā)HGIN，10例同時伴發(fā)LGIN和HGIN；腺瘤類型多為管狀-絨毛狀腺瘤，占75.0%。

PDCD4表達與癌旁腺瘤長徑相關(P<0.05)，LC3Ⅱ和p62表達與腺癌長徑、癌旁腺瘤長徑相關(P<0.05)，PDCD4、LC3Ⅱ和p62表達與結直腸腺癌患者性別、年齡、腫瘤部位、分化程度、浸潤深度、癌旁腺瘤類型等無相關性(P>0.05；表1)。

二、不同病變組織中PDCD4、LC3Ⅱ、p62的表達情況

PDCD4在P-NIMM中的陽性表達主要位于細胞核，而在腺癌組織中主要位于細胞質(圖1-3)。P-NIMM的PDCD4核/質表達比和表達強度均明顯高于P-LGIN、P-HGIN和腺癌(P<0.05)，P-LGIN、P-HGIN的核/質表達比明顯高于腺癌(P<0.05)，而P-LGIN與P-HGIN無明顯差異(P>0.05；表2)。在10例癌旁僅正常腸黏膜的病例中，正常腸黏膜與腺癌的PDCD4核/質表達比差異無統計學意義(P>0.05；表3)。

LC3Ⅱ和p62在腺癌中的陽性表達率明顯高于P-NIMM和P-LGIN(P<0.05)，而與P-HGIN無明顯差異(P>0.05)，且P-LGIN中LC3Ⅱ和p62陽性表達率明顯高于P-NIMM(P<0.05；表2)。在10例癌旁僅正常腸黏膜的病例中，p62在腺癌的陽性表達率高于正常黏膜，差異有統計學意義(P<0.05)，而LC3Ⅱ在正常黏膜與腺癌的陽性表達率差異無統計學意義(P>0.05；表3)。

表1 早期結直腸腺癌患者PDCD4、LC3Ⅱ和p62表達與臨床病理特征的相關性(n)

表2 PDCD4、LC3Ⅱ和p62在不同組織中的表達情況n(%)

表3 腺瘤-腺癌組與正常黏膜-腺癌組中PDCD4、LC3Ⅱ和p62表達情況(n)

A：P-NIMM細胞核中陽性表達；B：P-LGIN中陽性表達；C：P-HGIN中陽性表達；D：腺癌中陽性表達

三、不同病變組織中PDCD4與LC3Ⅱ、p62表達的相關性

在P-LGIN、P-HGIN和腺癌中，PDCD4表達與LC3Ⅱ、p62表達均呈負相關，差異有統計學意義(P<0.05；表4)。

四、PDCD4在泛癌中的差異表達

通過UCSC數據庫進行PDCD4差異表達分析，結果顯示PDCD4在結直腸癌、膀胱尿路上皮癌、食管癌、頭頸鱗狀細胞癌、腎乳頭狀細胞癌等多種腫瘤中的表達均低于對應正常組織，而在嗜鉻細胞瘤和副神經節(jié)瘤中呈高表達，差異均有統計學意義(P<0.05；圖4)。

討 論

早期結直腸癌是指局限于黏膜和黏膜下層的結直腸癌，而不論腫瘤大小以及有無淋巴結轉移。在內鏡技術發(fā)展前，早期結直腸癌只能選擇外科手術進行治療，手術創(chuàng)傷大且破壞正常解剖結構，影響患者生理功能。隨著內鏡技術的發(fā)展，ESD治療具有創(chuàng)傷小、恢復快、對患者生理功能影響小等優(yōu)點，能有效阻斷消化道癌前病變的進一步發(fā)展，目前已成為消化道早癌的常規(guī)治療方法[5-6]。ESD切除標本需進行詳盡的病理學檢查[7]，因固定及時、充分，可保持各種生物因子在體內的真實狀態(tài)，降低標本離體后因組織缺血、缺氧等外因而產生的各種化學反應，提高研究的準確性。本研究對54例早期結直腸腺癌的ESD標本進行臨床病理特征分析發(fā)現，男性早期結直腸腺癌的檢出率明顯高于女性(2.9∶1)，檢出部位以左半結腸為主(88.9%)，因此，行結腸鏡檢查時應仔細檢查腸道各部位，重點關注乙狀結腸和直腸的黏膜變化，尤其是男性患者，盡量避免漏診病灶。本研究篩選出44例結直腸腺癌周邊伴發(fā)腺瘤患者，這部分患者可能是通過腺瘤-腺癌序列演進而來的，其中3/4的腺瘤類型為管狀-絨毛狀腺瘤。管狀-絨毛狀腺瘤發(fā)生惡變的概率高于單純管狀腺瘤，因此，對于結腸鏡活檢病理診斷為管狀-絨毛狀腺瘤的患者，無論是LGIN還是HGIN，均應加強隨訪，定期復診，及早發(fā)現、治療腸道腫瘤。本研究還納入了10例無腺瘤病變的結直腸腺癌患者，可能是通過其他癌變途徑直接由正常腸黏膜惡變而來。總之，結直腸癌的發(fā)病機制復雜，深入研究其發(fā)病機制對于結直腸癌的防治具有重要的臨床意義。

A：P-NIMM中陰性表達；B：P-LGIN中陽性表達；C：P-HGIN中陽性表達；D：腺癌中陽性表達

A：P-NIMM中陰性表達；B：P-LGIN中陽性表達；C：P-HGIN中陽性表達；D：腺癌中陽性表達

表4 P-LGIN、P-HGIN和腺癌中PDCD4表達與LC3Ⅱ和p62表達的相關性(n)

圖4 PDCD4在33種泛癌中的差異表達情況

腫瘤的發(fā)生過程涉及腫瘤抑癌基因的失活、癌基因的激活以及多種細胞信號通路的異常，最終導致腫瘤細胞的無限增殖和凋亡受抑。凋亡是活體內細胞在基因調控下發(fā)生的主動死亡過程，若腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中凋亡受到抑制，將會促進腫瘤進展。新近研究發(fā)現，PDCD4對細胞凋亡過程具有調控作用，可通過抑制基因的轉錄、翻譯過程而抑制腫瘤細胞增殖，因此認為PDCD4是一種潛在的抑癌因子[8-10]。研究表明，正常組織中PDCD4蛋白主要在細胞核中發(fā)揮作用，在發(fā)生營養(yǎng)缺乏或惡性增殖等外在條件改變時，PDCD4可通過核輸出信號轉移至細胞質中。本研究通過UCSC數據庫分析發(fā)現PDCD4在包括結直腸癌內的多種腫瘤中表達下調或缺失。在44例腺瘤-腺癌患者中，免疫組化結果顯示，PDCD4在P-NIMM的細胞核中陽性表達，而在腺癌中主要表達于細胞質中，且表達強度減弱，P-LGIN、P-HGIN的核/質表達比明顯高于腺癌。推測在正常腸黏膜向LGIN轉變以及HGIN向腺癌轉變的過程中，PDCD4從細胞核轉運至細胞質的過程可能發(fā)揮了重要作用。即當PDCD4由細胞核轉移至細胞質時，失去了對細胞凋亡的誘導以及細胞周期的抑制作用，從而使細胞增殖失控，導致腫瘤的發(fā)生。因此，深入研究PDCD4發(fā)生細胞內轉位的機制，對預防結直腸腺瘤癌變的發(fā)生具有重要意義。此外，在正常-腺癌患者中，PDCD4在正常腸黏膜與腺癌之間的核/質表達比無明顯差異，提示正常腸黏膜-腺癌途徑的激活與PDCD4的細胞內表達轉位相關性不大，可能是通過其他途徑誘導結直腸腺癌的發(fā)生。

自噬是指由雙層膜囊泡結構包裹、吞噬受損的胞內物質形成自噬體，然后其外膜與溶酶體融合，形成自噬溶酶體后被溶酶體水解酶所降解的過程[11]。自噬過程中涉及多種自噬相關蛋白參與，其中LC3Ⅱ始終定位于前自噬體和自噬體膜，其含量代表了自噬體數目，可作為自噬的標志物[12-13]。p62既可誘導自噬發(fā)生，又是自噬調節(jié)蛋白和選擇性降解底物，最終作為底物通過自噬途徑被降解，故p62蛋白水平變化可反映自噬降解水平，又可作為自噬活性的標志物[12,14-15]。正常細胞的自噬通常呈低水平，這種適度的基礎自噬至關重要，通過降解、再利用細胞內受損物質發(fā)揮抗凋亡和促進細胞修復的作用[11,16]。自噬在腫瘤中存在促進與抑制腫瘤進展的雙重作用[17-18]。本課題組的前期研究[2]結果顯示，自噬與結直腸腺瘤癌變的過程密切相關。本研究結果顯示，LC3Ⅱ和p62在P-NIMM、P-LGIN、P-HGIN和腺癌中的陽性表達率逐漸升高，腺癌的陽性表達率明顯高于P-LGIN和P-NIMM(P<0.05)，而與P-HGIN無明顯差異(P>0.05)。隨著癌旁腺瘤長徑和腺癌長徑的增加，LC3Ⅱ和p62的陽性表達率逐漸增高，提示自噬在結直腸腺瘤癌變過程中發(fā)揮重要作用。推測隨著腫瘤體積的增大，使部分細胞缺氧、饑餓，通過提高自噬水平降解腫瘤細胞內受損的蛋白質和細胞器，為其生長提供營養(yǎng)和能量，增強了腫瘤細胞抵御不利生存因素影響的能力，從而促進腫瘤生長，推動正常腸黏膜向低級別上皮內瘤變和高級別上皮內瘤變的轉化，直至發(fā)生癌變。

凋亡與自噬在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，自噬和凋亡有共同的調節(jié)因子和信號調控交匯點[19]。有關研究表明PDCD4在多種腫瘤細胞和免疫細胞中均能抑制自噬的發(fā)生，PDCD4的MA-3功能域通過eIF4A依賴的方式抑制自噬關鍵蛋白ATG5的翻譯，抑制ATG12-ATG5復合體的形成，進而抑制自噬[20-22]。Manirujjaman等[23]發(fā)現，肝細胞癌細胞株中PDCD4蛋白在p62的引導下與自噬體上的LC3Ⅱ結合，從而被自噬系統降解，而抑制p62和自噬活性則會抑制PDCD4的降解。本研究發(fā)現，在P-LGIN、P-HGIN和腺癌中PDCD4表達與LC3Ⅱ、p62表達均呈負相關。推測在正常腸上皮發(fā)生瘤變的過程中，PDCD4首先由細胞核轉運至細胞質中，其對凋亡的誘導和自噬的抑制作用減弱，共同促進了腫瘤的發(fā)生。而在腺瘤癌變的進展過程中，自噬活性的增強進一步促進了PDCD4的降解，從而導致癌變。通過p62引導PDCD4與LC3Ⅱ相結合，降解PDCD4，從而抑制腫瘤細胞發(fā)生凋亡，可能是自噬導致腫瘤發(fā)生的機制之一。

綜上所述，細胞凋亡的抑制和自噬的激活共同作用促進了正常腸上皮向腺瘤甚至腺癌的轉變。其機制可能為PDCD4的細胞內轉位可抑制細胞凋亡，并增強自噬作用，而自噬激活后又可通過降解PDCD4進一步減弱其抑癌作用。在結直腸腺瘤-腺癌發(fā)展的早期階段，闡明PDCD4由細胞核轉運至細胞質的分子機制，并通過阻斷這一過程增強細胞凋亡、降低細胞自噬，可有助于揭示腫瘤發(fā)生的規(guī)律，并能指導腫瘤的臨床診治。然而，本實驗的研究方法比較單一，且樣本量較少，故具體的致病機制仍有待于行大樣本研究以及基因、分子等層面的研究進一步深入探討證實。