甘欣甜，薛 穎，張蓉蓉，孫愛麗*

（1.寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 寧波 315823；2.寧波大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波 315823）

莠去津（ATR）又稱阿特拉津，是一種人工合成的三嗪類除草劑，由于其價格低和持久穩(wěn)定等特點，已成為世界產(chǎn)量最大的除草劑之一，也是世界玉米種植產(chǎn)業(yè)中使用量最多的除草劑之一。目前已在全球超70多個國家注冊使用，年消耗量高達7～9萬噸［1－2］。自20世紀(jì)80年代初被引進以來，我國的ATR使用量已超過1 萬噸，且以年均增長率超過20%的速率遞增。ATR 類除草劑的廣泛使用在帶來較高經(jīng)濟效益的同時，由于其具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、難以分解、水溶性較高等特點，近年來在水生生物中被頻繁檢出［3］?？紫榧龋?］采用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用（GC－MS）法對中華圓田螺體內(nèi)的ATR 及其代謝物脫乙基莠去津（DEA）、脫乙基脫異丙基莠去津（DDA）和脫異丙基莠去津（DIA）進行檢測，結(jié)果表明ATR 及DIA 的檢出率為100%，含量分別為6.93～8.06μg/kg 和7.06～10.53μg/kg；范廣宇等［5］對貝類樣品中22 種農(nóng)藥進行測定，結(jié)果顯示ATR 的檢出率達65.0%，含量為0.1～3.7μg/kg，對貝類具有較高的風(fēng)險殘留；Carafa 等［6］對北亞德里亞海域養(yǎng)殖場中文蛤體內(nèi)的農(nóng)藥進行測定，ATR 的檢出量為1.5μg/kg，相對于同一站點的表層沉積物而言（0.26μg/kg），文蛤?qū)TR 存在蓄積行為，富集系數(shù)約為5；Fu等［7］采用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（LC－MS/MS）對東北地區(qū)魚類樣品中多種農(nóng)藥進行測定，發(fā)現(xiàn)遼寧省魚類樣品中ATR的平均含量為2.3μg/kg，遠高于其他農(nóng)藥，表明應(yīng)重視水產(chǎn)品中ATR的潛在風(fēng)險。因此，加強對ATR及其代謝物殘留的監(jiān)測對于保障水產(chǎn)品安全及人類健康具有重要意義。

目前，ATR 及其代謝產(chǎn)物的檢測方法主要有氣相色譜法（GC）、氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（GC－MS/MS）、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法（GC－MS）、高效液相色譜法（HPLC）、高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC－MS）、免疫吸附檢測法、電化學(xué)傳感器法、毛細管電泳法和原子熒光光譜法等［8－19］。其中，檢測ATR 的最常用方法是色譜法及色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法。然而，ATR 及其代謝產(chǎn)物的性質(zhì)差異大，常規(guī)提取和凈化技術(shù)易導(dǎo)致部分分析物的靈敏度低等問題。同時，水產(chǎn)品基質(zhì)成分復(fù)雜、污染物濃度較低，單純依靠色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)易導(dǎo)致離子源受污染、儀器靈敏度降低等［20］。因此，本文通過對不同提取溶劑、凈化方式等前處理條件進行優(yōu)化，結(jié)合GC－MS/MS具有靈敏度高、分離效果好、成本低的優(yōu)點，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），在有效降低背景干擾的同時，提高了待測組分的信噪比和靈敏度，實現(xiàn)了對ATR 及其代謝產(chǎn)物的精確定性、定量測定。所建方法可為水產(chǎn)品中ATR 及其代謝物的殘留監(jiān)測提供技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

莠去津（純度99.0%）、脫乙基莠去津（98.5%）、脫異丙基莠去津（99.5%）、脫乙基脫異丙基莠去津（99.0%）、ATR－D5（內(nèi)標(biāo)99.0%）標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma－Aldrich 公司。色譜級丙酮、甲醇購于Tedia 公司；二氯甲烷（≥99.99%）、乙酸乙酯（≥99.9%）、乙腈（≥99.9%）、甲苯（≥99.9%）等購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；GCB/NH2固相萃取柱（500 mg/6 mL）購自上海安譜實驗科技股份有限公司。

7890B－7000C氣相色譜－三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）；固相萃取儀（美國Supelco公司）；HSC－12B氮吹儀（天津市恒奧科技發(fā)展公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA公司）；UPR純水儀（四川優(yōu)普超純科技公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

精確稱取適量ATR 及其代謝物的標(biāo)準(zhǔn)品，用丙酮配制成100.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于－20 ℃保存?zhèn)溆茫挥帽♂寴?biāo)準(zhǔn)儲備液，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用丙酮逐級稀釋成系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0μg/L），并加入20.0μL 質(zhì)量濃度為1.0μg/mL的內(nèi)標(biāo)，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣品前處理

SPE 步驟：稱取2.00 g 經(jīng)冷凍干燥后的樣品置于50 mL 離心管中，然后向該離心管中迅速加入20.0 mL乙腈，渦旋1 min，超聲提取20 min后，以5.0×103g/min離心10 min，收集上清液；重復(fù)上述步驟2次，合并上清液，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入2.0 mL乙腈復(fù)溶，待凈化。用4.0 mL乙腈－甲苯（3∶1，體積比）溶液活化GCB/NH2固相萃取柱，上樣完成后，用8.0 mL 乙腈－甲苯（3∶1）溶液淋洗，收集淋洗液，于40 ℃用氮氣吹至近干，以1.0 mL丙酮復(fù)溶，待檢測。

QuEChERS 步驟：稱取2.00 g樣品置于50 mL 離心管中，依次加入2 mL 蒸餾水、5 mL 乙腈、0.6 g氯化鈉和1.0 g無水MgSO4，渦旋1 min，超聲分散10 min，以3.0×103g/min離心5 min；然后將收集的上清液轉(zhuǎn)移至含有50 mg C18或PSA 或GCB 的15 mL 離心管中，渦旋混勻30 s，以3.0 × 103g/min 離心5 min；取上清液置于10 mL玻璃離心管中，40 ℃水浴中用氮氣吹至近干，以1.0 mL丙酮復(fù)溶，待檢測。

1.4 儀器條件

1.4.1 氣相色譜條件色譜柱：DB－5MS 型毛細管色譜柱（30 m × 0.25 mm × 0.25μm）；載氣：氦氣；恒流模式；柱流量：2.25 mL/min；進樣口溫度：280 ℃；進樣體積：1μL；進樣方式：不分流進樣；程序升溫：初始溫度為70 ℃，保持1 min，以10 ℃/min 升至180 ℃，保持6 min，再以40 ℃/min 升至310 ℃，保持1 min。

1.4.2 質(zhì)譜條件電子轟擊離子源（EI）電壓：70 eV；離子源溫度：280 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；溶劑延遲時間：5.8 min；掃描范圍：50～500 amu；掃描模式：質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），碰撞氣N2流速：1.5 mL/min。表1為MRM 模式下，ATR及其代謝物的氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)。

表1 ATR及其代謝物的氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)Table 1 GC－MS/MS parameters of ATR and its metabolites

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

在全掃描模式下確定ATR 及其代謝產(chǎn)物的保留時間，根據(jù)質(zhì)譜圖離子對的峰形及響應(yīng)，選取合適的母離子；其次，在子離子掃描模式下，對子離子及轟擊電壓進行優(yōu)化，確定最佳定性定量離子對和碰撞能（表1）。利用優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)通過MRM 分析，ATR 及其代謝產(chǎn)物（100μg/L）的總離子流與子離子色譜圖如圖1所示。結(jié)果顯示，ATR及其代謝產(chǎn)物具有良好的色譜行為和質(zhì)譜響應(yīng)。

圖1 ATR及其代謝產(chǎn)物（100μg/L）的總離子流及子離子色譜圖Fig.1 Total ion flow and ion chromatograms of ATR and its metabolites（100μg/L）

2.2 提取溶劑的選擇

生物樣品基質(zhì)中除草劑的提取主要使用二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、甲醇及其混合溶劑。由于ATR 及其代謝產(chǎn)物的極性相差較大，根據(jù)相似相溶原理，本研究選擇極性中等或較強的溶劑進行提取。加標(biāo)濃度為50.0μg/kg時，比較了二氯甲烷（DCM）、乙酸乙酯（EA）、乙酸乙酯－甲醇（EA－MeOH，4∶1）以及乙腈（ACN）4種溶劑對水產(chǎn)品中4 種目標(biāo)物的提取效果，每組樣品平行測定3 次。結(jié)果表明（圖2），以二氯甲烷為提取試劑時，僅ATR 的回收率滿足要求；乙酸乙酯對ATR、DEA、DIA 的提取效果較好，但DDA 的回收率無法滿足要求。后2 種溶劑的提取效果均能滿足要求，然而弱極性溶劑占主導(dǎo)時，提取液中油脂、多糖等含量會增大，造成基質(zhì)干擾且損傷儀器，因此本研究選用乙腈作為提取溶劑。

圖2 不同提取溶劑對ATR及其代謝產(chǎn)物的回收率Fig.2 Recoveries of ATR and its metabolites in different extraction solvents

2.3 凈化方式的優(yōu)化

由于水產(chǎn)品基質(zhì)復(fù)雜，檢測過程中會產(chǎn)生嚴(yán)重的干擾峰，影響目標(biāo)物的靈敏度和準(zhǔn)確度。因此，凈化方式對于檢測結(jié)果的靈敏度和準(zhǔn)確度至關(guān)重要。按照“1.3”條件，本文比較了QuEChERS 和固相萃取柱的凈化效果。結(jié)果表明，ATR 及其代謝產(chǎn)物采用QuEChERS 法的回收率為50.4%～83.1%，表明C18、PSA 和GCB 吸附劑對目標(biāo)物具有一定的吸附。進一步比較了GCB/NH2、C18、HLB、MCX 4 種固相萃取柱對ATR 及其代謝產(chǎn)物的回收率，如圖3所示，GCB/NH2固相萃取柱具有最佳的萃取效率，對4 種目標(biāo)物的回收率為83.1%～94.6%。因此，實驗選擇GCB/NH2固相萃取柱進行樣品凈化。

圖3 不同SPE柱對ATR及其代謝產(chǎn)物（50.0μg/kg）的萃取效果比較Fig.3 Comparison of extraction effects for ATR and its metabolites with different SPE cartridges（50.0μg/kg）

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

由于水產(chǎn)品中通常含有較多的脂肪及蛋白等雜質(zhì)，在質(zhì)譜分析過程中易受到基質(zhì)增強或基質(zhì)抑制效應(yīng)的影響，從而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度。因此，本文采用基質(zhì)效應(yīng)（Matrix effect，ME）進一步對其凈化效果進行評價。其中，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液采用前處理步驟凈化空白樣品配制。計算公式：ME（%）=100%×（基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率－1）。結(jié)果顯示，ATR 及其代謝物均無明顯的基質(zhì)效應(yīng)（ME<20%），表明建立的前處理方法可以有效消除基質(zhì)干擾。

2.5 方法學(xué)驗證

2.5.1 線性關(guān)系與檢出限將含有質(zhì)量濃度為1.0μg/mL 內(nèi)標(biāo)的ATR 及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0μg/L）依次進樣至GC－MS/MS，再以目標(biāo)分析物與內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度之比為橫坐標(biāo)，以目標(biāo)分析物與內(nèi)標(biāo)物的響應(yīng)值之比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如表2 所示，ATR、DEA、DIA 和DDA 在0.5～100.0 μg/L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.999 1～0.999 9。以信噪比（S/N）為3 時的質(zhì)量濃度作為方法的檢出限（LOD），4 種目標(biāo)物的LOD 為0.02～0.13μg/kg。

表2 ATR及其代謝物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients and detection limits of ATR and its metabolites

2.5.2 準(zhǔn)確度與精密度比較了5種不同種類水產(chǎn)品（縊蟶、海鯽魚、金鯧魚、黃魚、黑鯛）的加標(biāo)回收率，分別稱取不同種類冷凍干燥后的水產(chǎn)品2.0 g，加標(biāo)水平為10.0、20.0、50.0μg/kg，每個水平進行3 組平行實驗。表3 結(jié)果表明，4 種目標(biāo)分析物的平均回收率為83.6%～98.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.6%～8.1%，表明建立的方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

2.6 方法對比

進一步將本文建立的檢測方法與已有文獻方法進行對比（表4）。結(jié)果表明，本方法具有更好或相當(dāng)?shù)撵`敏度、準(zhǔn)確度和精密度，可滿足水產(chǎn)品中ATR及其代謝產(chǎn)物的檢測要求。

2.7 實際樣品分析

從象山西滬港養(yǎng)殖區(qū)采集6種水產(chǎn)樣品，采用本方法進行檢測，目標(biāo)物的檢出量見表5，代表性樣品的總離子流圖見圖4。結(jié)果顯示，6 種水產(chǎn)樣品均檢出ATR、DEA 和DIA，檢出量分別為1.55～30.63μg/kg、0.48～4.96μg/kg、0.34～3.57μg/kg；DDA 未檢出。ATR、DEA 及DIA 在海鯽魚中的檢出含量最高，其次是黑鯛魚，含量最低的為金鯧魚。生物體對ATR 的代謝能力會受到生物種類、覓食習(xí)慣以及生存年齡等多種因素影響，在該海域生物體中，ATR 仍占據(jù)主導(dǎo)位置，其次是DEA 和DIA。海鯽魚、黑鯛魚以及縊蟶等屬于底棲養(yǎng)殖生物，因此在攝食過程中更易富集ATR，較該海域海水中濃度［23］而言，本實驗測得海鯽魚、黑鯛和縊蟶的富集系數(shù)約為400。鑒于水產(chǎn)樣品中ATR 及其代謝產(chǎn)物的檢出率較高，其帶來的環(huán)境及水產(chǎn)品安全風(fēng)險需重點關(guān)注。

圖4 實際樣品中ATR及其代謝產(chǎn)物的總離子流色譜圖Fig.4 Total ion chromatograms of ATR and its metabolites in real samples

表5 水產(chǎn)品中ATR及其代謝產(chǎn)物的含量（μg/kg，n=3）Table 5 Contents of ATR and its metabolites in aquatic products（μg/kg，n=3）

3 結(jié) 論

本文建立了測定水產(chǎn)品中ATR及其代謝物的固相萃取/氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜方法，水產(chǎn)樣品經(jīng)乙腈提取，GCB/NH2固相萃取柱富集、凈化。結(jié)果表明，4 種分析物的LOD 為0.02～0.13μg/kg；在10.0、20.0、50.0μg/kg加標(biāo)濃度下的平均回收率為83.6%～98.4%，RSD 為3.6%～8.1%。采用該方法在6種水產(chǎn)樣品中均檢出ATR、DEA 和DIA，檢出量分別為1.55～30.63 μg/kg、0.48～4.96 μg/kg、0.34～3.57μg/kg。本文研究結(jié)果為進一步探究ATR 及其主要代謝產(chǎn)物在近岸養(yǎng)殖環(huán)境及水產(chǎn)品中的污染狀況和風(fēng)險控制提供了技術(shù)支撐。