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        固相萃取/氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中莠去津及其代謝物殘留

        2022-01-09 06:46:18甘欣甜張蓉蓉孫愛麗
        分析測試學(xué)報 2021年12期
        關(guān)鍵詞:代謝物水產(chǎn)品乙腈

        甘欣甜,薛 穎,張蓉蓉,孫愛麗*

        (1.寧波大學(xué) 海洋學(xué)院,浙江 寧波 315823;2.寧波大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院,浙江 寧波 315823)

        莠去津(ATR)又稱阿特拉津,是一種人工合成的三嗪類除草劑,由于其價格低和持久穩(wěn)定等特點,已成為世界產(chǎn)量最大的除草劑之一,也是世界玉米種植產(chǎn)業(yè)中使用量最多的除草劑之一。目前已在全球超70多個國家注冊使用,年消耗量高達7~9萬噸[1-2]。自20世紀(jì)80年代初被引進以來,我國的ATR使用量已超過1 萬噸,且以年均增長率超過20%的速率遞增。ATR 類除草劑的廣泛使用在帶來較高經(jīng)濟效益的同時,由于其具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、難以分解、水溶性較高等特點,近年來在水生生物中被頻繁檢出[3]??紫榧龋?]采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法對中華圓田螺體內(nèi)的ATR 及其代謝物脫乙基莠去津(DEA)、脫乙基脫異丙基莠去津(DDA)和脫異丙基莠去津(DIA)進行檢測,結(jié)果表明ATR 及DIA 的檢出率為100%,含量分別為6.93~8.06μg/kg 和7.06~10.53μg/kg;范廣宇等[5]對貝類樣品中22 種農(nóng)藥進行測定,結(jié)果顯示ATR 的檢出率達65.0%,含量為0.1~3.7μg/kg,對貝類具有較高的風(fēng)險殘留;Carafa 等[6]對北亞德里亞海域養(yǎng)殖場中文蛤體內(nèi)的農(nóng)藥進行測定,ATR 的檢出量為1.5μg/kg,相對于同一站點的表層沉積物而言(0.26μg/kg),文蛤?qū)TR 存在蓄積行為,富集系數(shù)約為5;Fu等[7]采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)對東北地區(qū)魚類樣品中多種農(nóng)藥進行測定,發(fā)現(xiàn)遼寧省魚類樣品中ATR的平均含量為2.3μg/kg,遠高于其他農(nóng)藥,表明應(yīng)重視水產(chǎn)品中ATR的潛在風(fēng)險。因此,加強對ATR及其代謝物殘留的監(jiān)測對于保障水產(chǎn)品安全及人類健康具有重要意義。

        目前,ATR 及其代謝產(chǎn)物的檢測方法主要有氣相色譜法(GC)、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)、免疫吸附檢測法、電化學(xué)傳感器法、毛細管電泳法和原子熒光光譜法等[8-19]。其中,檢測ATR 的最常用方法是色譜法及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。然而,ATR 及其代謝產(chǎn)物的性質(zhì)差異大,常規(guī)提取和凈化技術(shù)易導(dǎo)致部分分析物的靈敏度低等問題。同時,水產(chǎn)品基質(zhì)成分復(fù)雜、污染物濃度較低,單純依靠色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)易導(dǎo)致離子源受污染、儀器靈敏度降低等[20]。因此,本文通過對不同提取溶劑、凈化方式等前處理條件進行優(yōu)化,結(jié)合GC-MS/MS具有靈敏度高、分離效果好、成本低的優(yōu)點,采用多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM),在有效降低背景干擾的同時,提高了待測組分的信噪比和靈敏度,實現(xiàn)了對ATR 及其代謝產(chǎn)物的精確定性、定量測定。所建方法可為水產(chǎn)品中ATR 及其代謝物的殘留監(jiān)測提供技術(shù)支持。

        1 實驗部分

        1.1 試劑與儀器

        莠去津(純度99.0%)、脫乙基莠去津(98.5%)、脫異丙基莠去津(99.5%)、脫乙基脫異丙基莠去津(99.0%)、ATR-D5(內(nèi)標(biāo)99.0%)標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma-Aldrich 公司。色譜級丙酮、甲醇購于Tedia 公司;二氯甲烷(≥99.99%)、乙酸乙酯(≥99.9%)、乙腈(≥99.9%)、甲苯(≥99.9%)等購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司;GCB/NH2固相萃取柱(500 mg/6 mL)購自上海安譜實驗科技股份有限公司。

        7890B-7000C氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Agilent公司);固相萃取儀(美國Supelco公司);HSC-12B氮吹儀(天津市恒奧科技發(fā)展公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國IKA公司);UPR純水儀(四川優(yōu)普超純科技公司)。

        1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

        精確稱取適量ATR 及其代謝物的標(biāo)準(zhǔn)品,用丙酮配制成100.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-20 ℃保存?zhèn)溆茫挥帽♂寴?biāo)準(zhǔn)儲備液,配制成質(zhì)量濃度為1 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,再用丙酮逐級稀釋成系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0μg/L),并加入20.0μL 質(zhì)量濃度為1.0μg/mL的內(nèi)標(biāo),于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.3 樣品前處理

        SPE 步驟:稱取2.00 g 經(jīng)冷凍干燥后的樣品置于50 mL 離心管中,然后向該離心管中迅速加入20.0 mL乙腈,渦旋1 min,超聲提取20 min后,以5.0×103g/min離心10 min,收集上清液;重復(fù)上述步驟2次,合并上清液,40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干,加入2.0 mL乙腈復(fù)溶,待凈化。用4.0 mL乙腈-甲苯(3∶1,體積比)溶液活化GCB/NH2固相萃取柱,上樣完成后,用8.0 mL 乙腈-甲苯(3∶1)溶液淋洗,收集淋洗液,于40 ℃用氮氣吹至近干,以1.0 mL丙酮復(fù)溶,待檢測。

        QuEChERS 步驟:稱取2.00 g樣品置于50 mL 離心管中,依次加入2 mL 蒸餾水、5 mL 乙腈、0.6 g氯化鈉和1.0 g無水MgSO4,渦旋1 min,超聲分散10 min,以3.0×103g/min離心5 min;然后將收集的上清液轉(zhuǎn)移至含有50 mg C18或PSA 或GCB 的15 mL 離心管中,渦旋混勻30 s,以3.0 × 103g/min 離心5 min;取上清液置于10 mL玻璃離心管中,40 ℃水浴中用氮氣吹至近干,以1.0 mL丙酮復(fù)溶,待檢測。

        1.4 儀器條件

        1.4.1 氣相色譜條件色譜柱:DB-5MS 型毛細管色譜柱(30 m × 0.25 mm × 0.25μm);載氣:氦氣;恒流模式;柱流量:2.25 mL/min;進樣口溫度:280 ℃;進樣體積:1μL;進樣方式:不分流進樣;程序升溫:初始溫度為70 ℃,保持1 min,以10 ℃/min 升至180 ℃,保持6 min,再以40 ℃/min 升至310 ℃,保持1 min。

        1.4.2 質(zhì)譜條件電子轟擊離子源(EI)電壓:70 eV;離子源溫度:280 ℃;傳輸線溫度:280 ℃;溶劑延遲時間:5.8 min;掃描范圍:50~500 amu;掃描模式:質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(MRM),碰撞氣N2流速:1.5 mL/min。表1為MRM 模式下,ATR及其代謝物的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)。

        表1 ATR及其代謝物的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)Table 1 GC-MS/MS parameters of ATR and its metabolites

        2 結(jié)果與討論

        2.1 質(zhì)譜條件的選擇

        在全掃描模式下確定ATR 及其代謝產(chǎn)物的保留時間,根據(jù)質(zhì)譜圖離子對的峰形及響應(yīng),選取合適的母離子;其次,在子離子掃描模式下,對子離子及轟擊電壓進行優(yōu)化,確定最佳定性定量離子對和碰撞能(表1)。利用優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)通過MRM 分析,ATR 及其代謝產(chǎn)物(100μg/L)的總離子流與子離子色譜圖如圖1所示。結(jié)果顯示,ATR及其代謝產(chǎn)物具有良好的色譜行為和質(zhì)譜響應(yīng)。

        圖1 ATR及其代謝產(chǎn)物(100μg/L)的總離子流及子離子色譜圖Fig.1 Total ion flow and ion chromatograms of ATR and its metabolites(100μg/L)

        2.2 提取溶劑的選擇

        生物樣品基質(zhì)中除草劑的提取主要使用二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、甲醇及其混合溶劑。由于ATR 及其代謝產(chǎn)物的極性相差較大,根據(jù)相似相溶原理,本研究選擇極性中等或較強的溶劑進行提取。加標(biāo)濃度為50.0μg/kg時,比較了二氯甲烷(DCM)、乙酸乙酯(EA)、乙酸乙酯-甲醇(EA-MeOH,4∶1)以及乙腈(ACN)4種溶劑對水產(chǎn)品中4 種目標(biāo)物的提取效果,每組樣品平行測定3 次。結(jié)果表明(圖2),以二氯甲烷為提取試劑時,僅ATR 的回收率滿足要求;乙酸乙酯對ATR、DEA、DIA 的提取效果較好,但DDA 的回收率無法滿足要求。后2 種溶劑的提取效果均能滿足要求,然而弱極性溶劑占主導(dǎo)時,提取液中油脂、多糖等含量會增大,造成基質(zhì)干擾且損傷儀器,因此本研究選用乙腈作為提取溶劑。

        圖2 不同提取溶劑對ATR及其代謝產(chǎn)物的回收率Fig.2 Recoveries of ATR and its metabolites in different extraction solvents

        2.3 凈化方式的優(yōu)化

        由于水產(chǎn)品基質(zhì)復(fù)雜,檢測過程中會產(chǎn)生嚴(yán)重的干擾峰,影響目標(biāo)物的靈敏度和準(zhǔn)確度。因此,凈化方式對于檢測結(jié)果的靈敏度和準(zhǔn)確度至關(guān)重要。按照“1.3”條件,本文比較了QuEChERS 和固相萃取柱的凈化效果。結(jié)果表明,ATR 及其代謝產(chǎn)物采用QuEChERS 法的回收率為50.4%~83.1%,表明C18、PSA 和GCB 吸附劑對目標(biāo)物具有一定的吸附。進一步比較了GCB/NH2、C18、HLB、MCX 4 種固相萃取柱對ATR 及其代謝產(chǎn)物的回收率,如圖3所示,GCB/NH2固相萃取柱具有最佳的萃取效率,對4 種目標(biāo)物的回收率為83.1%~94.6%。因此,實驗選擇GCB/NH2固相萃取柱進行樣品凈化。

        圖3 不同SPE柱對ATR及其代謝產(chǎn)物(50.0μg/kg)的萃取效果比較Fig.3 Comparison of extraction effects for ATR and its metabolites with different SPE cartridges(50.0μg/kg)

        2.4 基質(zhì)效應(yīng)

        由于水產(chǎn)品中通常含有較多的脂肪及蛋白等雜質(zhì),在質(zhì)譜分析過程中易受到基質(zhì)增強或基質(zhì)抑制效應(yīng)的影響,從而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度。因此,本文采用基質(zhì)效應(yīng)(Matrix effect,ME)進一步對其凈化效果進行評價。其中,基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液采用前處理步驟凈化空白樣品配制。計算公式:ME(%)=100%×(基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率-1)。結(jié)果顯示,ATR 及其代謝物均無明顯的基質(zhì)效應(yīng)(ME<20%),表明建立的前處理方法可以有效消除基質(zhì)干擾。

        2.5 方法學(xué)驗證

        2.5.1 線性關(guān)系與檢出限將含有質(zhì)量濃度為1.0μg/mL 內(nèi)標(biāo)的ATR 及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0μg/L)依次進樣至GC-MS/MS,再以目標(biāo)分析物與內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度之比為橫坐標(biāo),以目標(biāo)分析物與內(nèi)標(biāo)物的響應(yīng)值之比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如表2 所示,ATR、DEA、DIA 和DDA 在0.5~100.0 μg/L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r2)為0.999 1~0.999 9。以信噪比(S/N)為3 時的質(zhì)量濃度作為方法的檢出限(LOD),4 種目標(biāo)物的LOD 為0.02~0.13μg/kg。

        表2 ATR及其代謝物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients and detection limits of ATR and its metabolites

        2.5.2 準(zhǔn)確度與精密度比較了5種不同種類水產(chǎn)品(縊蟶、海鯽魚、金鯧魚、黃魚、黑鯛)的加標(biāo)回收率,分別稱取不同種類冷凍干燥后的水產(chǎn)品2.0 g,加標(biāo)水平為10.0、20.0、50.0μg/kg,每個水平進行3 組平行實驗。表3 結(jié)果表明,4 種目標(biāo)分析物的平均回收率為83.6%~98.4%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.6%~8.1%,表明建立的方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

        2.6 方法對比

        進一步將本文建立的檢測方法與已有文獻方法進行對比(表4)。結(jié)果表明,本方法具有更好或相當(dāng)?shù)撵`敏度、準(zhǔn)確度和精密度,可滿足水產(chǎn)品中ATR及其代謝產(chǎn)物的檢測要求。

        2.7 實際樣品分析

        從象山西滬港養(yǎng)殖區(qū)采集6種水產(chǎn)樣品,采用本方法進行檢測,目標(biāo)物的檢出量見表5,代表性樣品的總離子流圖見圖4。結(jié)果顯示,6 種水產(chǎn)樣品均檢出ATR、DEA 和DIA,檢出量分別為1.55~30.63μg/kg、0.48~4.96μg/kg、0.34~3.57μg/kg;DDA 未檢出。ATR、DEA 及DIA 在海鯽魚中的檢出含量最高,其次是黑鯛魚,含量最低的為金鯧魚。生物體對ATR 的代謝能力會受到生物種類、覓食習(xí)慣以及生存年齡等多種因素影響,在該海域生物體中,ATR 仍占據(jù)主導(dǎo)位置,其次是DEA 和DIA。海鯽魚、黑鯛魚以及縊蟶等屬于底棲養(yǎng)殖生物,因此在攝食過程中更易富集ATR,較該海域海水中濃度[23]而言,本實驗測得海鯽魚、黑鯛和縊蟶的富集系數(shù)約為400。鑒于水產(chǎn)樣品中ATR 及其代謝產(chǎn)物的檢出率較高,其帶來的環(huán)境及水產(chǎn)品安全風(fēng)險需重點關(guān)注。

        圖4 實際樣品中ATR及其代謝產(chǎn)物的總離子流色譜圖Fig.4 Total ion chromatograms of ATR and its metabolites in real samples

        表5 水產(chǎn)品中ATR及其代謝產(chǎn)物的含量(μg/kg,n=3)Table 5 Contents of ATR and its metabolites in aquatic products(μg/kg,n=3)

        3 結(jié) 論

        本文建立了測定水產(chǎn)品中ATR及其代謝物的固相萃取/氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法,水產(chǎn)樣品經(jīng)乙腈提取,GCB/NH2固相萃取柱富集、凈化。結(jié)果表明,4 種分析物的LOD 為0.02~0.13μg/kg;在10.0、20.0、50.0μg/kg加標(biāo)濃度下的平均回收率為83.6%~98.4%,RSD 為3.6%~8.1%。采用該方法在6種水產(chǎn)樣品中均檢出ATR、DEA 和DIA,檢出量分別為1.55~30.63 μg/kg、0.48~4.96 μg/kg、0.34~3.57μg/kg。本文研究結(jié)果為進一步探究ATR 及其主要代謝產(chǎn)物在近岸養(yǎng)殖環(huán)境及水產(chǎn)品中的污染狀況和風(fēng)險控制提供了技術(shù)支撐。

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