談曉佩,李珊珊,石海珠,張純姑*,封 順*
(1.西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川 成都 610031;2.烏魯木齊市第十五中學(xué),新疆 烏魯木齊 830046)
萘乙酸(α-Naphthylacetic,NAA)是一種廣譜、高效的植物生長調(diào)節(jié)劑,具有促進(jìn)植物生根、抽芽、開花,防止落花落果,促進(jìn)果實(shí)成熟和增產(chǎn)等調(diào)節(jié)作用,廣泛用于小麥、水稻、棉花、番茄等農(nóng)作物中[1]。NAA 具有神經(jīng)毒性和急性毒性,其在農(nóng)作物中的殘留進(jìn)入人體后可使人的生殖和發(fā)育受損,甚至導(dǎo)致癌癥[1-3]。因此許多國家和組織將NAA 列入限制使用的農(nóng)藥名單。我國(GB 2763-2019[4])和歐盟(EC 396/2005[5])分別規(guī)定NAA在食品中的最大殘留限量(MRL)為100μg·kg-1和60μg·kg-1。
針對(duì)NAA 的測(cè)定,目前已發(fā)展了熒光分光光度法[6-7]、氣相色譜法[8-9]、高效液相色譜法(HPLC)[10-13]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[14-17]等技術(shù)。但由于NAA 的殘留量相對(duì)較低,且樣本基質(zhì)復(fù)雜,為提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性,實(shí)現(xiàn)高通量分析,開發(fā)新的樣本前處理技術(shù)具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
分子印跡聚合物(Molecular imprinted polymers,MIPs)對(duì)待測(cè)化合物具有特異性識(shí)別能力,兼具實(shí)用性高、分離速度快、制備方便等優(yōu)點(diǎn),近年來被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物、食品、生物和環(huán)境樣品中目標(biāo)化合物的選擇性識(shí)別[18-22]。NAA 的分子印跡聚合物目前也得到了應(yīng)用,但其制備步驟繁瑣、耗時(shí)[23-24]。
本文將磁分離技術(shù)引入MIPs 中,發(fā)展了一種無皂液乳化技術(shù)制備NAA 磁性分子印跡聚合物多孔微球的方法。以甲基丙烯酸-苯乙烯聚合物前驅(qū)體為功能單體,NAA為模板分子,與Fe3O4磁流體和引發(fā)劑偶氮二異丁腈混合,采用“一鍋法”快速制得NAA-mMIPs 微球。該制備方法簡便、快捷,同時(shí)賦予微球多孔結(jié)構(gòu),有利于提高傳質(zhì)速率,增加實(shí)際結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量。
萘乙酸(C12H10O2,分析純)購于上海阿拉丁試劑有限公司;硫酸亞鐵銨((NH4)2SO4·FeSO4·6H2O)、甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)、氯仿(CHCl3)、乙酸(HAc)購于天津市永盛精細(xì)化工廠;甲基丙烯酸(MAA)、偶氮二異丁腈(AIBN)購于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;苯乙烯(St)、油酸(OA)、氫氧化鈉(NaOH)、環(huán)己烷(C6H12)購于天津市富宇精細(xì)化工有限公司;番茄購自烏魯木齊當(dāng)?shù)爻?。?shí)驗(yàn)用水為超純水。
采用LEO 1430VP 掃描電子顯微鏡(SEM,德國LEO 電鏡有限公司)、H-600 透射電子顯微鏡(TEM,日本日立公司)、Presti-21傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR,日本島津公司)對(duì)微球形貌、紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行表征。
LC-10Atvp HPLC(日本島津)由LC-10Atvp二元泵和SPD-10Avp檢測(cè)器組成。色譜條件如下:色譜柱OptimaPak C18柱(150 mm×4.6 mm,5μm),進(jìn)樣量20μL;流動(dòng)相為甲醇-0.2%乙酸水溶液(體積比1∶1),等度洗脫,流速1.0 mL·min-1,檢測(cè)波長280 nm。分析前所有樣品需用0.45μm微孔膜過濾。
1.2.1 Fe3O4磁流體的制備Fe3O4磁流體的制備參考本實(shí)驗(yàn)室之前的工作[25]:將10 mL 0.2 mol·L-1(NH4)2SO4?FeSO4?6H2O 溶液在攪拌下加入30 mL 0.1 g·mL-1NaOH/EtOH/OA(1∶1∶1,體積比)溶液;于40 mL 聚四氟乙烯反應(yīng)釜中180 ℃反應(yīng)10 h;待其自然冷卻至室溫,取出沉淀;用10 mL 環(huán)己烷和30 mL EtOH連續(xù)洗滌,重復(fù)3次。最后將得到的產(chǎn)物分散于4 mL CHCl3中,儲(chǔ)存,備用。
1.2.2 聚合物前驅(qū)體的合成將0.4 mL MAA、10.0 mL St和0.2 g AIBN 加入60 mL CHCl3中,混合均勻后,100 ℃反應(yīng)10 h。冷卻至室溫,加入120 mL CH3OH,離心,收集沉淀;用20 mL CHCl3洗滌3次,以除去未反應(yīng)的單體;60 ℃真空干燥12 h,即得poly(St-co-MAA)前驅(qū)體[23]。
1.2.3 磁性分子印跡聚合物的制備將300μL磁流體、1 mmol·L-1NAA 水溶液和0.524 6 g聚合物前驅(qū)體依次加入4 mL CHCl3中,混合均勻后,于攪拌下緩慢加入10 mL 0.1 g·mL-1NaOH 水溶液;70 ℃反應(yīng)2 h,自然冷卻至室溫后磁分離;依次用1 mL MeOH、含10%(體積分?jǐn)?shù))HAc 的MeOH 溶液洗滌。60 ℃真空下干燥,即得產(chǎn)物NAA 磁性分子印跡聚合物(mMIPs)。同時(shí),不添加模板分子NAA,平行制備了磁性非印跡聚合物(mNIPs)。
1.2.4 吸附性能等溫吸附實(shí)驗(yàn):將10 mg mMIPs 或mNIPs 分散于2 mL 質(zhì)量濃度1~100 μg·mL-1的NAA 標(biāo)準(zhǔn)溶液中,室溫振蕩3 h,磁分離;采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法,利用UV-Vis 在280 nm 處測(cè)定吸附前后溶液中NAA的質(zhì)量濃度。
吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn):將10 mg mMIPs 或mNIPs分散于2 mL 50μg·mL-1的NAA 標(biāo)準(zhǔn)溶液中,按一定時(shí)間間隔(5、15、30、60、90、120、180 min)收集上清,利用UV-Vis 在280 nm 處測(cè)定溶液中NAA 的質(zhì)量濃度。
1.2.5 實(shí)際樣本檢測(cè)將烏魯木齊當(dāng)?shù)爻匈徺I的番茄洗凈后,榨汁,過0.45μm 微孔膜。分別加入NAA 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制最終質(zhì)量濃度分別為0.005、5、15、25 μg·mL-1的加標(biāo)液。加入10 mg mMIPs,孵育90 min;磁分離后,用1 mL MeOH-HAc(9∶1,體積比)洗脫捕獲的NAA,重復(fù)3 次。合并洗脫液,真空干燥后,以100μL流動(dòng)相復(fù)溶,過膜后,進(jìn)行HPLC分析。其中0.005μg·mL-1加標(biāo)樣本的樣本量為2 mL。
以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。
從TEM 圖可以發(fā)現(xiàn),F(xiàn)e3O4磁流體粒徑在5~30 nm 之間(圖1A)。SEM 圖顯示,NAA-mMIPs 粒徑為80μm,微球呈多孔結(jié)構(gòu),孔洞均勻分布,直徑約1~10μm(圖1B)。該多孔結(jié)構(gòu)使得微球具有較大的比表面積,同時(shí)顯著增加了可接觸識(shí)別位點(diǎn)數(shù)量,有利于增大柱容量,提升傳質(zhì)速率。在圖1C 中,曲線a(Fe3O4)578 cm-1處的峰為Fe3O4的Fe—O 特征峰。曲線b(poly(St-co-MAA)前驅(qū)體)中,750、830、1 500、1 580 cm-1處均為poly(St-co-MAA)中苯環(huán)的特征峰;1 697 cm-1處為C====O 紅外吸收峰,2 800 cm-1和3 000 cm-1處的峰可歸屬為—CH3的伸縮振動(dòng),3 400 cm-1處為—OH的伸縮振動(dòng)。而在曲線c 中,可同時(shí)觀察到上述官能團(tuán)(Fe—O、苯環(huán)、C====O、—CH3、—OH)的紅外特征吸收峰,表明NAA-mMIPs 被成功制備。同時(shí)該微球具有良好的磁響應(yīng)性,在外加磁場(chǎng)作用下,可在30 s 內(nèi)實(shí)現(xiàn)液固分離(圖1D)。
圖1 Fe3O4的TEM圖(A),NAA-mMIPs的SEM圖(B)、FT-IR光譜圖(C)、磁分離圖(D)Fig.1 TEM image of Fe3O4(A),and SEM(B),F(xiàn)T-IR(C),magnetic separation image(D)of NAA-mMIPs a.Fe3O4,b.poly(St-co-MAA)precursor,c.mMIPs
依據(jù)等溫吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以方程(1)計(jì)算NAA在mMIPs和mNIPs上的吸附量(Q,mg·g-1):
式中:C0(μg·mL-1)表示模板分子的初始質(zhì)量濃度;Ct(μg·mL-1)表示吸附后上清液中模板分子的質(zhì)量濃度;m(g)表示聚合物的質(zhì)量;V(mL)表示所取模板分子溶液的體積。從圖2A 可以發(fā)現(xiàn),隨著NAA 初始質(zhì)量濃度的增加,mMIPs 對(duì)模板分子的結(jié)合量增加。同時(shí),mMIPs 在所有濃度下的吸附量均顯著高于mNIPs。說明MNIPs 對(duì)NAA 的吸附是由非特異性相互作用引起的。
采用Scatchard方程(式2)進(jìn)一步對(duì)其吸附性能進(jìn)行分析:
式中:Q(mg·g-1)為mMIPs 對(duì)模板分子的平衡結(jié)合量;C(μg·mL-1)為溶液中模板分子的平衡質(zhì)量濃度;Qmax(mg·g-1)為結(jié)合位點(diǎn)的最大表觀結(jié)合量;Kd(μg·mL-1)為結(jié)合位點(diǎn)的平衡解離常數(shù)。從圖2B中可以看出,mMIPs的Scatchard圖由兩條斜率不同的直線組成,說明mMIPs對(duì)NAA 的結(jié)合存在高和低兩種親和位點(diǎn),擬合所得線性方程分別為y=-6.200 × 10-3x+ 0.182 0(r2= 0.995 5)和y= 7.800 ×10-3x+0.152 1(r2=0.968 8)。由斜率和截距可得高、低親和位點(diǎn)的解離常數(shù)和最大表觀結(jié)合量分別為161.30 μg·mL-1、29.35 mg·g-1以及-128.20 μg·mL-1、-19.50 mg·g-1。對(duì)于mNIPs,其Scatchard圖中僅有一條曲線(圖2C),說明NAA-mNIPs與NAA 的結(jié)合只有一種形式,線性方程為y=-1.629×10-2x+0.075 88,解離常數(shù)Kd=61.39μg·mL-1,最大表觀吸附量Qmax=4.658 mg·g-1。上述結(jié)果表明mMIPs 存在著特異性和非特異性吸附,但特異性吸附要遠(yuǎn)強(qiáng)于非特異性吸附;而mNIPs 對(duì)NAA 的吸附?jīng)]有選擇性,僅存在著非特異性吸附。
圖2 mMIPs和mNIPs等溫吸附曲線(A),mMIPs(B)和mNIPs(C)的Scatchard曲線Fig.2 The adsorption isotherms of mMIPs and mNIPs(A),Scatchard plots of mMIPs(B)and mNIPs(C)
動(dòng)力學(xué)吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。由圖3A可知,mMIPs在120 min時(shí)基本達(dá)到吸附平衡。分別采用偽一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型(式3)和偽二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型(式4)對(duì)吸附數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合:
圖3 mMIPs和mNIPs吸附動(dòng)力曲線(A),mMIPs和mNIPs的偽一級(jí)(B)和偽二級(jí)(C)動(dòng)力學(xué)模型Fig.3 The adsorption curves of mMIPs and mNIPs(A),the pseudo-first-order(B)and pseudo-second-order(C)kinetic models of mMIPs and mNIPs
式中:Qe(mg·g-1)和Qt(mg·g-1)分別為達(dá)到吸附平衡和在時(shí)間t時(shí)的吸附量;k1(min)和k2(g·mg-1·min-1)分別為偽一級(jí)和偽二級(jí)動(dòng)力學(xué)吸附速率常數(shù)。由表1 可以看出,mMIPs 和mNIPs 對(duì)NAA的吸附更吻合偽二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型,化學(xué)吸附為決速步。
表1 NAA-mMIPs及NAA-mNIPs的動(dòng)力學(xué)模型結(jié)果Table 1 The experimental results of absorption kinetics of NAA-mMIPs and NAA-mNIPs
首先建立了HPLC測(cè)定NAA的標(biāo)準(zhǔn)曲線,其在1~100μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,r2為0.999 8,說明該HPLC方法可應(yīng)用于NAA的準(zhǔn)確定量。分別配制NAA最終質(zhì)量濃度為5、15、25μg·mL-1的番茄汁加標(biāo)溶液,取2 mL 經(jīng)mMIPs 處理后,采用優(yōu)化的HPLC 條件對(duì)洗脫液進(jìn)行分析,得到其平均回收率為78.7%~89.2%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=3)小于3.9%,表明方法重現(xiàn)性良好。進(jìn)一步將mMIPs應(yīng)用于番茄汁中質(zhì)量濃度低至0.005μg·mL-1的NAA的富集,由圖4可見,番茄汁、加標(biāo)番茄汁、上清液對(duì)應(yīng)的色譜圖中均無NAA 色譜峰,而在洗脫液中能夠清晰觀察到NAA 的色譜峰,且其平均回收率高達(dá)80.3%(RSD<5.0%,n=3)。該NAA測(cè)定值(0.005μg·mL-1)遠(yuǎn)低于國標(biāo)[4]或歐盟標(biāo)準(zhǔn)[5]規(guī)定的最大殘留限量。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)所制備的mMIPs對(duì)NAA表現(xiàn)出優(yōu)異的選擇性和特異性,能夠有效消除復(fù)雜基質(zhì)的影響,對(duì)實(shí)際樣本中痕量NAA的測(cè)定結(jié)果具有高準(zhǔn)確性和可靠性。
圖4 番茄汁原液(A)、加標(biāo)液(B)、mMIPs處理后的上清液(C)和洗脫液(D)的色譜圖Fig.4 Chromatograms of initial sample(A),spiked sample(B),the supernatant after treated with the mMIPs(C)and the eluent(D)
本文將Fe3O4磁流體、poly(St-co-MAA)共聚物、NAA 和CHCl3混合,成功制備了NAA 多孔結(jié)構(gòu)mMIPs,并采用多種方法研究了吸附劑的形態(tài)和吸附行為。方法簡便,制備的NAA-mMIPs 擁有多孔結(jié)構(gòu)和良好的超順磁性,同時(shí)對(duì)NAA 表現(xiàn)出高的識(shí)別能力。實(shí)際樣品測(cè)定表明,mMIPs可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜食品中微量NAA的高效富集。