曹程 王慶凱 楊寶剛 馬明靜

(河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院心內(nèi)科，河北 滄州061001)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是好發(fā)于育齡期女性的自身免疫性彌漫性結(jié)締組織疾病，患者體內(nèi)產(chǎn)生過量攻擊自身抗體，引起體內(nèi)多器官、組織損傷，有效控制SLE病情可明顯延長(zhǎng)患者生存時(shí)間[1-2]。SLE臨床癥狀具有多樣化特點(diǎn)，并且其臨床癥狀隨著SLE病情變化呈輕重交替出現(xiàn)現(xiàn)象，可出現(xiàn)全身性炎癥、皮膚黏膜、肌肉關(guān)節(jié)、腎臟和血液系統(tǒng)等疾病癥狀，還可引起胸腔積液、肺間質(zhì)纖維化或肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension，PH)[3]。PH是由多種因素所致肺動(dòng)脈壓異常升高疾病，也是SLE常見并發(fā)癥，系統(tǒng)性紅斑狼瘡合并肺動(dòng)脈高壓(systemic lupus erythematosus and pulmonary hypertension，SLE-PH)具有疾病進(jìn)展迅速，控制難度和致死率均高的特點(diǎn)[4-5]。因此，盡早采取積極有效的防控措施對(duì)改善SLE患者預(yù)后具有重要意義。DNA甲基化屬于DNA化學(xué)修飾形式之一，可在不改變DNA序列情況下改變遺傳表現(xiàn)。人類基因啟動(dòng)子區(qū)域含有大量DNA甲基化修飾位點(diǎn)，某些基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化可誘導(dǎo)腫瘤、自身免疫性疾病和心腦血管疾病等發(fā)生[6-8]。現(xiàn)探討ABCG1和GALNT2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與SLE相關(guān)PH預(yù)后關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月—2017年1月河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院收治的SLE患者123例，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)納入患者均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)風(fēng)濕病學(xué)分會(huì)制定的《系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷及治療指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡>20歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并先天性心臟病、原發(fā)性心肌?。?2)肺癌、肺栓塞、肺靜脈閉塞、慢性阻塞性肺部疾病和門靜脈高壓患者；(3)合并惡性腫瘤；(4)合并嚴(yán)重肝腎功能障礙；(5)重疊綜合征；(6)認(rèn)知功能障礙；(7)妊娠期、哺乳期婦女。納入患者對(duì)本研究均知情，自愿簽署知情同意書，通過本醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 分組方法

PH的診斷參照歐洲心臟病學(xué)會(huì)(ESC)制定的《肺動(dòng)脈高壓診斷和治療指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9][右心導(dǎo)管測(cè)量顯示肺動(dòng)脈平均壓≥25 mm Hg(1 mm Hg=0.133 3 kPa)]將123例患者分為合并PH組(SLE-PH組，n=48)與不合并PH組(SLE-noPH組，n=75)。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 基本資料

根據(jù)患者的臨床資料，統(tǒng)計(jì)分析患者性別、年齡、右心室內(nèi)徑、右心房上下徑、右心房左右徑、左心室內(nèi)徑、肺動(dòng)脈寬度、射血分?jǐn)?shù)、美國(guó)紐約心臟病協(xié)會(huì)(NYHA)分級(jí)、SLE疾病活動(dòng)度指數(shù)(SLE disease activity index，SLEDAI)和伴隨疾病等情況。

1.3.2 ABCG1和GALNT2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測(cè)

患者入院后，采集清晨空腹靜脈血4 mL，置于含有乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝管中，采用全血基因組DNA提取試劑盒(美國(guó)Promega公司)提取DNA，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

亞硫酸氫鹽修飾基因組DNA以及DNA純化回收：向聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)管中加入15 μL DNA Protect Buffer、85 μL Buffer mix和40 μL DNA樣本，混勻，于PCR儀(95 ℃ 5 min，60 ℃ 25 min，95 ℃ 5 min，60 ℃ 85 min，95 ℃ 5 min，60 ℃ 175 min，20 ℃ 2 min)進(jìn)行重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化完成后向樣本中加入310 μL Buffer BL、250 μL無水乙醇脈沖混勻15 s，12 000 r/min離心1 min，加入500 μL Buffer BW，12 000 r/min離心1 min，棄濾液。加入500 μL Buffer BD，室溫靜置15 min，12 000 r/min離心1 min，棄濾液。加入500 μL Buffer BW，12 000 r/min離心1 min(重復(fù)2次)。加入250 μL無水乙醇，12 000 r/min離心1 min，室溫?fù)]發(fā)5 min，加入39 μL Buffer EB溶液洗脫離心柱中的DNA，將所得DNA用于甲基化特異性PCR檢測(cè)與瓊脂糖凝膠電泳判定甲基化結(jié)果。

根據(jù)人類基因數(shù)據(jù)庫核實(shí)ABCG1和GALNT2基因啟動(dòng)子區(qū)以及上游序列，采用Primer Express Software v2.0(ABI公司)軟件設(shè)計(jì)ABCG1和GALNT2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化、非甲基化特異性PCR引物(引物由華大基因科技有限公司合成)，ABCG1甲基化：sense 5’-ATTTGTATTGTGATATCGACGAGAC-3’，antisense 5’-CTTACCTCCTCGATTCTAAACGTAC-3’，退火溫度54 ℃； ABCG1非甲基化：sense 5’-AGATTTGTATTGTGATATTGATGAGAT-3’，antisense 5’-AACTTACCTCTCAATTCTAACATAC-3’，退火溫度48 ℃； GALNT2甲基化：sense 5’-TTATAAGATAGATCTTTTTTTGTATC-3’，antisense 5’-CCGCTAATATGATTTTATTAT-3’，退火溫度48 ℃； GALNT2非甲基化：sense 5’-ATGTTATAAGATAGATTTTTTTTTTATT-3’，antisense 5’-AACCCACTAATATCAATTTTATTAT-3’，退火溫度46 ℃。甲基化特異性PCR體系：5 μL PCR Buffer，0.5 μL dNTP mix，0.5 μL sense引物，0.5 μL antisense引物，0.5 μL DNA模板，0.1 μL KAPA Taq DNA聚合酶，17.90 μL無菌水。PCR循環(huán)參數(shù)設(shè)置為95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，68 ℃ 5 min，72 ℃ 1 min，10個(gè)循環(huán)；95 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，39個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸6 min。收集甲基化特異性PCR產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)中的Quantity One軟件對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行分析，觀察ABCG1和GALNT2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況。

1.3.3 不良預(yù)后

納入患者從入院治療日開始計(jì)算，跟蹤隨訪3年，記錄患者3年存活情況，以死亡作為患者不良預(yù)后判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組患者基本資料比較

兩組患者年齡、性別、病程、射血分?jǐn)?shù)和關(guān)節(jié)炎、口腔潰瘍、發(fā)熱、光敏感、肺間質(zhì)病變構(gòu)成比比較，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；SLE-PH組雷諾現(xiàn)象、活動(dòng)后胸悶、指端血管炎構(gòu)成比和右心室內(nèi)徑、右心房上下徑、右心房左右徑、肺動(dòng)脈寬度、SLEDAI、ABCG1甲基化比率、GALNT2甲基化比率均顯著高于SLE-noPH組(P<0.05)，而左心室內(nèi)徑和NYHA分級(jí)(Ⅰ～Ⅱ)構(gòu)成比顯著低于SLE-noPH組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組患者基本資料比較

2.2 ABCG1和GALNT2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化對(duì)SLE患者生存的影響

ABCG1啟動(dòng)子區(qū)甲基化組平均生存時(shí)間為(30.53±1.08)個(gè)月，ABCG1啟動(dòng)子區(qū)非甲基化組平均生存時(shí)間為(33.75±0.99)個(gè)月，Log-Rank檢驗(yàn)顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.076，P=0.043)，見圖1。GALNT2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化組平均生存時(shí)間為(29.91±1.44)個(gè)月，GALNT2基因啟動(dòng)子區(qū)非甲基化組平均生存時(shí)間為(32.81±0.90)個(gè)月，Log-Rank檢驗(yàn)顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.661，P=0.103)，見圖2。

2.3 死亡組和存活組患者基本資料比較

在SLE患者中，死亡組雷諾現(xiàn)象、肺間質(zhì)病變、ABCG1甲基化構(gòu)成比率和右心室內(nèi)徑、右心房上下徑、右心房左右徑、動(dòng)脈寬度、SLEDAI均顯著高于存活組(P<0.05)，而NYHA分級(jí)(Ⅰ～Ⅱ)構(gòu)成比率顯著低于存活組(P<0.05)，見表2。

表2 死亡組患者和存活組患者基本資料比較

在SLE-PH患者中，死亡組雷諾現(xiàn)象構(gòu)成比率和SLEDAI均顯著高于存活組(P<0.05)，而NYHA分級(jí)(Ⅰ～Ⅱ)構(gòu)成比率顯著低于存活組(P<0.05)，見表2。

2.4 Cox回歸分析SLE患者不良預(yù)后危險(xiǎn)因素

將表2中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素納入多因素Cox回歸分析，使用向前法進(jìn)行Cox模型多因素分析SLE患者不良預(yù)后危險(xiǎn)因素，結(jié)果顯示，NYHA分級(jí)(Ⅲ～Ⅳ)、SLEDAI(≥20分)和ABCG1甲基化是SLE患者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，NYHA分級(jí)(Ⅲ～Ⅳ)是SLE-PH患者不良預(yù)后危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表3。

表3 Cox回歸分析SLE患者不良預(yù)后危險(xiǎn)因素

3 討論

SLE為多臟器受累的慢性自身免疫性系統(tǒng)疾病，中國(guó)SLE患病率為70/100 000，女性患病率為113/100 000[10-11]，SLE發(fā)病與遺傳、環(huán)境等多種因素有關(guān)。PH是SLE嚴(yán)重并發(fā)癥之一，其并發(fā)率為0.5%～43.0%[12-13]，肺動(dòng)脈壓力增加和肺血管阻力升高是引起PH患者右心衰竭或死亡的原因之一[14-15]。SLE-PH與肺血管內(nèi)皮功能障礙、血管重塑、自身抗體形成、免疫功能異常、肺血管炎和血栓形成等因素有關(guān)[16]。表觀遺傳學(xué)修飾可通過調(diào)控免疫相關(guān)基因表達(dá)水平參與心血管疾病、神經(jīng)類疾病和惡性腫瘤等疾病的發(fā)生、進(jìn)展過程。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)修飾方式之一，DNA甲基化可在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶作用下將胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸胞嘧啶甲基化為5-甲基胞嘧啶，對(duì)基因表達(dá)有調(diào)節(jié)作用。

人類ABCG1位于21號(hào)染色體上，含23個(gè)外顯子，屬于跨膜半轉(zhuǎn)運(yùn)體。ABCG1在腦、腎上腺、巨噬細(xì)胞、胸腺和肺部高表達(dá)，具有防止脂質(zhì)過量積累和發(fā)揮預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的作用[17]。ABCG1可促進(jìn)膽固醇從細(xì)胞流出，通過提高膽固醇在細(xì)胞膜雙層間運(yùn)動(dòng)，增強(qiáng)與成熟富脂載脂蛋白結(jié)合，清除體內(nèi)多余膽固醇。GALNT2位于1號(hào)染色體上，含16個(gè)外顯子，屬于多肽-N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶家族成員，在O-糖基化反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。此外，GALNT2還可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝糖基化改變體內(nèi)脂質(zhì)水平，對(duì)調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)定性具有重要意義[18-19]。本研究結(jié)果顯示SLE-PH患者的SLEDAI、ABCG1甲基化比率和GALNT2甲基化比率顯著高于SLE-noPH患者，與研究[20]結(jié)果存在相似趨勢(shì)，出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能與PH發(fā)病機(jī)制有關(guān)，脂質(zhì)代謝紊亂可引發(fā)體內(nèi)炎癥反應(yīng)，內(nèi)皮細(xì)胞炎癥趨化因子高表達(dá)可引起白細(xì)胞遷移，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷，增加PH發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)SLE-PH患者NYHA分級(jí)(Ⅰ～Ⅱ)構(gòu)成比明顯低于SLE-noPH患者，已有研究[21]表明SLE-PH患者3年存活率為44.90%，而5年存活率為16.80%，SLE-PH降低患者存活率可能與PH所致心功能降低有關(guān)，SLE-PH可使肺血管炎癥內(nèi)壁增厚，引起管腔變窄，肺循環(huán)阻力增大，導(dǎo)致肺部功能降低，從而影響患者預(yù)后。SLE早期伴隨的肺血管炎屬于急性病癥，及時(shí)給予免疫抑制劑、激素治療可逆轉(zhuǎn)，但隨著SLE疾病加重，肺血管炎則轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維素樣壞死，此病變屬于PH的慢性病理改變，臨床治療可逆性差，所以SLE-PH患者長(zhǎng)期預(yù)后情況差。

本研究還發(fā)現(xiàn)ABCG1甲基化SLE患者3年平均生存時(shí)間明顯低于ABCG1非甲基化患者，而GALNT2甲基化與其非甲基化患者3年平均生存時(shí)間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明ABCG1甲基化可能會(huì)影響SLE患者長(zhǎng)期預(yù)后情況。此外，本研究發(fā)現(xiàn)雷諾現(xiàn)象、肺間質(zhì)病變、ABCG1甲基化、NYHA分級(jí)以及心室內(nèi)徑、心房大小可能對(duì)SLE患者不良預(yù)后存在影響，進(jìn)一步Cox分析顯示NYHA分級(jí)(Ⅲ～Ⅳ)、SLEDAI(≥20分)和ABCG1甲基化是SLE患者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素。NYHA分級(jí)(Ⅲ～Ⅳ)是SLE-PH患者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素，可能是因?yàn)镾LE-PH患者體內(nèi)ABCG1甲基化水平較高，影響對(duì)膽固醇、脂質(zhì)過量積累調(diào)節(jié)能力，引起血管內(nèi)壁炎癥反應(yīng)，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能降低，加重患者心功能損傷，導(dǎo)致患者預(yù)后生存時(shí)間減少。因此，SLE-PH患者可選用DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑治療以逆轉(zhuǎn)基因的甲基化狀態(tài)，恢復(fù)ABCG1和GALNT2表達(dá)，減少血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，增強(qiáng)對(duì)膽固醇的調(diào)節(jié)作用，降低肺動(dòng)脈壓力及不良預(yù)后的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，從而延長(zhǎng)患者生存時(shí)間。

本研究仍存在一定局限性，如納入患者主要為本地區(qū)患者，未納入經(jīng)濟(jì)狀況和教育背景等其他人口學(xué)因素的影響；納入樣本數(shù)量較少，可能會(huì)影響研究結(jié)果的可靠性；隨訪時(shí)間只隨訪至3年，可能延長(zhǎng)隨訪時(shí)間能得到更多的臨床代表性結(jié)果。

綜上所述，SLE-PH患者ABCG1和GALNT2甲基化構(gòu)成比較高且ABCG1甲基化可能會(huì)影響SLE患者預(yù)后，NYHA分級(jí)(Ⅲ～Ⅳ)是SLE-PH患者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素。臨床可增加DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑治療以逆轉(zhuǎn)ABCG1和GALNT2表達(dá)水平，注重患者心功能恢復(fù)救治，改善心臟的相應(yīng)調(diào)節(jié)功能，以延長(zhǎng)患者生存時(shí)間。