羅之晟 王超 劉家汝 關(guān)秀茹

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江 哈爾濱150001)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是大部分心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)，包括冠心病、心肌纖維化、腦軟化以及外周血管疾病等，其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，是全球健康的重大威脅[1]。AS的主要特征是血管內(nèi)膜的內(nèi)皮損傷、脂質(zhì)滲入和炎性反應(yīng)等共同作用形成纖維斑塊，導(dǎo)致管腔變硬、狹窄，引發(fā)相應(yīng)器官的缺血性改變。其中炎性機(jī)制貫穿了AS病變起始、進(jìn)展和并發(fā)癥形成的全過程，而單核巨噬細(xì)胞是其中起關(guān)鍵作用的炎性細(xì)胞。巨噬細(xì)胞具有高度的可塑性即巨噬細(xì)胞的極化，在斑塊形成過程中微環(huán)境的改變進(jìn)而刺激巨噬細(xì)胞的分化，表達(dá)不同的表型[2]。M1型巨噬細(xì)胞主要是在斑塊早期表達(dá)CD36、清道夫受體吞噬脂質(zhì)，主要發(fā)揮促炎作用；M2型巨噬細(xì)胞主要是在斑塊進(jìn)展期進(jìn)行纖維修復(fù)、穩(wěn)定斑塊，主要發(fā)揮抗炎作用[3]。除了以上兩種主要的表型，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)在斑塊中還存在其他表型。比如，由趨化因子4誘導(dǎo)產(chǎn)生，高表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶7和鈣結(jié)合蛋白(S100A8)的促炎表型M4型[4]；Mox型，由氧化磷脂誘導(dǎo)并過表達(dá)以核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)介導(dǎo)的氧化還原調(diào)節(jié)基因的促炎表型，主要分泌白介素(IL)-1β等促炎因子以及表現(xiàn)為較低的吞噬和趨化能力[5]；另外，還有一種Mhem/M(Hb)型巨噬細(xì)胞[Mhem/M(Hb)]。

Mhem/M(Hb)是一種出血相關(guān)的新巨噬細(xì)胞表型，是對(duì)AS斑塊內(nèi)出血所產(chǎn)生的適應(yīng)性反應(yīng)機(jī)制[6]。而斑塊內(nèi)出血是進(jìn)展期AS嚴(yán)重繼發(fā)性病變之一，是促進(jìn)斑塊進(jìn)展和不穩(wěn)定性的主要因素。因此，探究Mhem/M(Hb)在斑塊內(nèi)出血所發(fā)揮的作用有望成為穩(wěn)定斑塊的替代靶標(biāo)，并通過調(diào)控巨噬細(xì)胞極化參與抗AS的治療[7]?，F(xiàn)就Mhem/M(Hb)的自身特點(diǎn)及其在斑塊中的來源分布進(jìn)行闡述，并對(duì)比分析其在斑塊中所發(fā)揮的作用。

1 Mhem/M(Hb)的概念和表達(dá)特征

Mhem/M(Hb)是一種針對(duì)斑塊內(nèi)出血的特異性替代性活化巨噬細(xì)胞亞群，其特征是高表達(dá)CD163，在血紅蛋白(Hb)-結(jié)合珠蛋白(Hp)復(fù)合物或血紅素(Heme)刺激時(shí)巨噬細(xì)胞極化形成。主要出現(xiàn)在有內(nèi)出血的斑塊、新生血管和鐵負(fù)荷等區(qū)域，是對(duì)相應(yīng)微環(huán)境改變所做出的應(yīng)答反應(yīng)[8]。這種亞群是Boyle等[6]在出血性AS斑塊中的巨噬細(xì)胞表型檢查中首次發(fā)現(xiàn)，并稱為出血性巨噬細(xì)胞亞群(HA-mac)；隨后，其進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)HA-mac不同于M1、M2，是一種抵抗AS巨噬細(xì)胞狀態(tài)，因而重新命名為Mhem[9]。同年，F(xiàn)inn等[10]進(jìn)一步研究分析，發(fā)現(xiàn)這一新型巨噬細(xì)胞亞群并不是IL-4和出血所誘導(dǎo)形成，而是在血紅蛋白復(fù)合物刺激作用下分化形成，因此也稱為M(Hb)。

Mhem/M(Hb)的主要特征表現(xiàn)在其分子表達(dá)上，并發(fā)揮著特異性的功能。在AS斑塊內(nèi)，Mhem/M(Hb)的分子表達(dá)包括清道夫受體(CD163)、甘露糖受體(CD206)以及人白細(xì)胞抗原[6]等，以高表達(dá)CD163為主要特征，因此也被稱為CD163+型巨噬細(xì)胞[11]。CD163也稱為M130蛋白，是結(jié)合血紅蛋白復(fù)合物的內(nèi)吞受體。其結(jié)構(gòu)由9個(gè)半胱氨酸豐富的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、1個(gè)跨膜段和1個(gè)帶有內(nèi)吞信號(hào)的胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)組成，特異性表達(dá)于單核細(xì)胞系細(xì)胞中，并高表達(dá)于吞噬組織的巨噬細(xì)胞中[12]。CD163首次發(fā)現(xiàn)是Law等[13]用四種不同的單克隆抗體(Ki-M8、BerMac3、GHI/61和SM4)定義的一種新型人巨噬細(xì)胞相關(guān)抗原，并命名為M130。Kristiansen等[14]研究發(fā)現(xiàn)，Hp-Hb復(fù)合物的攝取受體與巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)的急性期調(diào)控CD163蛋白相同，表現(xiàn)為結(jié)合和清除Hb復(fù)合物的功能，這也是CD163首次發(fā)現(xiàn)和研究最多的功能。后來，CD163被鑒定為紅細(xì)胞黏附受體和腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導(dǎo)因子(TWEAK)的受體，以及包括細(xì)菌和病毒在內(nèi)的不同病原體的受體，是一種多功能受體并發(fā)揮多種作用[15]。

2 Mhem/M(Hb)的來源和分布

Mhem/M(Hb)主要通過吞噬破碎紅細(xì)胞所釋放的Hb/Heme極化而來。在AS斑塊早期，動(dòng)脈內(nèi)皮受損，脂質(zhì)沉積，血管中小部分衰老或異常的紅細(xì)胞滲入內(nèi)皮；在AS斑塊進(jìn)展期，斑塊內(nèi)新生血管脆弱，通透性低，血管內(nèi)紅細(xì)胞滲出，當(dāng)斑塊進(jìn)一步進(jìn)展破裂時(shí)，形成斑塊內(nèi)出血，大量紅細(xì)胞釋放聚集，斑塊碎片以及聚集的紅細(xì)胞形成血腫或血栓，閉塞管腔或隨血流阻塞其他血管[16]；同時(shí)，在高氧化應(yīng)激的斑塊微環(huán)境中，紅細(xì)胞破碎分解成富含膽固醇的膜脂和Hb，與巨噬細(xì)胞活化結(jié)合進(jìn)一步加重斑塊中氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化[17]。其中Hb富含亞鐵離子，可氧化生成非氧結(jié)合高鐵血紅蛋白以及過氧化物質(zhì)等，發(fā)生芬頓反應(yīng)進(jìn)一步生成氧化自由基，對(duì)相應(yīng)組織造成損傷[18]。

因此，為了中和被釋放的Hb毒性，血清中急性反應(yīng)蛋白Hp以高親和力與Hb快速結(jié)合[14]，形成Hb-Hp復(fù)合物，刺激巨噬細(xì)胞表達(dá)CD163受體，在CD163受體的介導(dǎo)下，內(nèi)吞Hb-Hp復(fù)合物，調(diào)控相應(yīng)基因網(wǎng)絡(luò)，誘導(dǎo)一系列基因的表達(dá)差異，極化形成一種新的巨噬細(xì)胞亞群。與經(jīng)典的巨噬細(xì)胞相比，Mhem/M(Hb)表現(xiàn)為細(xì)胞更小，形態(tài)更長(zhǎng)，并能誘導(dǎo)一系列不同于M1、M2的基因，調(diào)控大約700個(gè)獨(dú)特基因，其中表達(dá)的血紅素氧合酶-1(HO-1)、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體、載脂蛋白E(ApoE)和肝X受體(LXR)等顯著增加[19]。

Bengtsson等[20]評(píng)估了包含200個(gè)頸動(dòng)脈斑塊的大隊(duì)列中CD163的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CD163高表達(dá)多見于斑塊肩區(qū)和斑塊中心，在斑塊表面出現(xiàn)較少；CD163+巨噬細(xì)胞首次在斑塊內(nèi)出血區(qū)域描述，除此以外，其他富含紅細(xì)胞如新生血管、鐵負(fù)荷等區(qū)域，也有大量的Mhem/M(Hb)聚集，而在鈣化、富含膠原蛋白和CD68表達(dá)的區(qū)域Mhem/M(Hb)明顯減少。

3 Mhem/M(Hb)在斑塊中發(fā)揮的作用

巨噬細(xì)胞具有高度的可塑性，可極化形成多種不同的表型。但這些表型并不是固定的，也不能提前劃分為預(yù)先分類好的亞群，而是根據(jù)所處的微環(huán)境以及已激活的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路發(fā)揮不同的功能[21]。而Mhem/M(Hb)從首次發(fā)現(xiàn)并提出至今，它在AS斑塊中發(fā)揮的作用存在明顯的爭(zhēng)議。

3.1 Mhem/M(Hb)的抗AS作用

Boyle等[6]在2009年出血性AS斑塊的巨噬細(xì)胞表型檢查中首次發(fā)現(xiàn)一種新的出血性巨噬細(xì)胞群(HA-mac)，在斑塊中發(fā)揮抗炎抗氧化的保護(hù)作用。通過研究在連續(xù)尸檢中收集到的斑塊，發(fā)現(xiàn)并證明了這一亞群可快速清除Hb-Hp復(fù)合物，減少活性氧和氧化應(yīng)激，同時(shí)運(yùn)用非線性建模的方法驗(yàn)證了IL-10/CD163正反饋回路機(jī)制，不斷自分泌細(xì)胞因子(IL-10)而發(fā)揮抗炎作用。2012年其在此基礎(chǔ)上繼續(xù)研究，主要探究了Mhem在基因轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控，并首次將脂質(zhì)和鐵處理相互聯(lián)系[9]。Heme刺激轉(zhuǎn)錄因子抗體-1(ATF-1)依賴的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共誘導(dǎo)LXR-β和HO-1，共同協(xié)調(diào)細(xì)胞鐵的運(yùn)載和脂質(zhì)外排[19，22]。同年，F(xiàn)inn等[10]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了M(Hb)可以通過調(diào)節(jié)鐵代謝以及活性氧(ROS)的生成來減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量，從而抑制泡沫細(xì)胞的形成。其分子機(jī)制是巨噬細(xì)胞在Hb的刺激下，通過上調(diào)膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，減少細(xì)胞內(nèi)鐵含量，進(jìn)而產(chǎn)生的ROS減少，這一過程同時(shí)激活肝LXR-α介導(dǎo)的膽固醇外流蛋白三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1表達(dá)增加以及下調(diào)參與脂蛋白攝取的清道夫受體，減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量。除了直接研究Mhem/M(Hb)在體內(nèi)外的分子機(jī)制與作用外，Gutiérrez-Muoz等[23]探究了缺乏CD163+巨噬細(xì)胞對(duì)小鼠動(dòng)脈粥樣斑塊的影響。通過運(yùn)用ApoE/CD163雙缺陷小鼠模型，與正常對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)出更不穩(wěn)定的斑塊表型，脂質(zhì)含量、斑塊大小和促炎細(xì)胞因子表達(dá)增加，從反面驗(yàn)證了Mhem/M(Hb)的保護(hù)作用。

另一方面，CD163作為Mhem/M(Hb)特征性的分子表達(dá)，除了作為膜受體介導(dǎo)內(nèi)吞血紅蛋白復(fù)合物，研究發(fā)現(xiàn)它在人外周血單核細(xì)胞的表達(dá)較低，而在炎癥消退的巨噬細(xì)胞中表達(dá)明顯增高[24]，并且在抗AS中也發(fā)揮了相應(yīng)的作用。CD163是腫瘤壞死因子家族分泌的促炎細(xì)胞因子TWEAK的清除受體，抑制TWEAK誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)以及炎性細(xì)胞的增殖和遷移[25]，并與TWEAK相互作用調(diào)節(jié)缺血損傷后的組織再生[26]。除此以外，CD163已被證明可從細(xì)胞表面分裂并脫落，形成一種在血漿中循環(huán)的可溶性CD163(sCD163)。Aristoteli等[27]首次證明嚴(yán)重冠狀動(dòng)脈粥樣硬化患者血漿中sCD163水平升高，血漿中sCD163水平與冠狀動(dòng)脈疾病的程度相關(guān)，可能成為第一類與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化檢測(cè)相關(guān)的巨噬細(xì)胞特異性生物標(biāo)志物。不僅如此，sCD163也反映了涉及CD163+巨噬細(xì)胞的系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)AS炎癥[28]。除了在動(dòng)脈粥樣斑塊中，CD163+巨噬細(xì)胞已被鑒定為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，與多種惡性腫瘤的不良預(yù)后以及轉(zhuǎn)移有關(guān)[29]。在巨噬細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)的炎癥性疾病中，可見sCD163血漿濃度升高，是巨噬細(xì)胞活化的標(biāo)志之一，有望成為一個(gè)潛在的炎癥生物標(biāo)志物[30]。因此，具有多功能作用的CD163是靶向巨噬細(xì)胞的一個(gè)良好的藥物傳送載體[31]，比如，CD163作為抗體藥物偶聯(lián)物提高糖皮質(zhì)激素類藥物的抗炎作用[32]，用于多種炎癥性疾病的治療。

3.2 Mhem/M(Hb)的促AS作用

隨著對(duì)Mhem/M(Hb)的深入研究，近來也有研究發(fā)現(xiàn)CD163+巨噬細(xì)胞可以促進(jìn)斑塊內(nèi)血管生成、滲漏以及炎癥反應(yīng)，并且與斑塊的不穩(wěn)定有關(guān)，表現(xiàn)為促AS的作用，與之前的研究存在爭(zhēng)議。Guo等[33]首次研究發(fā)現(xiàn)，Mhem/M(Hb)可通過細(xì)胞內(nèi)鐵代謝的變化抑制脯氨酰羥化酶2的活性，導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF1α)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A(VEGF-A)/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR2)信號(hào)通路代謝障礙，因此，在斑塊內(nèi)CD163高表達(dá)區(qū)域，斑塊內(nèi)微血管數(shù)量及內(nèi)皮通透性明顯增加；同時(shí)周圍內(nèi)皮細(xì)胞血管細(xì)胞黏附分子(VCAM)表達(dá)增加，招募更多的炎性細(xì)胞，形成惡性循環(huán)促進(jìn)斑塊的進(jìn)展。并且有研究發(fā)現(xiàn)，具有毒性作用的多氯聯(lián)苯可能是通過Nrf2/HO-1通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞向Mhem/M(Hb)的極化進(jìn)而發(fā)揮促AS的作用，間接說明了Mhem/M(Hb)促AS的作用[11]。

除此以外，CD163+巨噬細(xì)胞也與易損斑塊表型相關(guān)，促進(jìn)斑塊的不穩(wěn)定性。在一個(gè)包含200個(gè)頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)切除斑塊的大型隊(duì)列中進(jìn)行評(píng)估和分析發(fā)現(xiàn)[20]，CD163蛋白和mRNA在有癥狀患者斑塊和易損指數(shù)高的斑塊中的表達(dá)均較高，并且一些其他的促炎因子和斑塊不穩(wěn)定因子的表達(dá)也在Mhem/M(Hb)中發(fā)現(xiàn)。比如，斑塊不穩(wěn)定性獨(dú)立預(yù)測(cè)因子脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2 (Lp-PLA2)，通過特異性水解低密度脂蛋白中的氧化磷脂產(chǎn)生兩種促炎介質(zhì)，在容易破裂的晚期斑塊中，CD163+巨噬細(xì)胞通常共表達(dá)Lp-PLA2[34]；軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(COMP)是一種細(xì)胞外的基質(zhì)蛋白，與膠原蛋白、彈性蛋白等形成厚的纖維帽呈負(fù)相關(guān)，而CD163與COMP共定位并呈正相關(guān)，間接促進(jìn)斑塊的不穩(wěn)定性[35]。并且有學(xué)者通過基因表達(dá)綜合基因芯片分析，鑒定了不穩(wěn)定斑塊與穩(wěn)定斑塊之間的差異表達(dá)基因。其中，中心基因之一CD163出現(xiàn)明顯上調(diào)，可能參與促進(jìn)斑塊的不穩(wěn)定性[36]。

3.3 小結(jié)

Mhem/M(Hb)作為一種出血相關(guān)的替代性活化巨噬細(xì)胞，一方面，Mhem/M(Hb)能促進(jìn)膽固醇外流阻止泡沫細(xì)胞的分化，形成IL-10/CD163正反饋回路機(jī)制[10]；另一方面，通過非脂質(zhì)驅(qū)動(dòng)因素，Mhem/M(Hb)促進(jìn)血管生成、內(nèi)皮通透性[33]，并共表達(dá)一些促炎因子和斑塊不穩(wěn)定因子，增加斑塊的進(jìn)展和易碎性[20]。因此，Mhem/M(Hb)在AS斑塊中表現(xiàn)為雙向調(diào)節(jié)作用(圖1)。

注：neovascular：新生血管；lysed erythrocyte：破裂紅細(xì)胞；Mac：巨噬細(xì)胞；Lym：淋巴細(xì)胞；EC：內(nèi)皮細(xì)胞；HDL：高密度脂蛋白。圖中抗AS調(diào)節(jié)作用包括ATF1/HO-1/LXR，增加鐵外排和膽固醇外流，減少ROS的產(chǎn)生；分泌IL-10，與CD163形成正反饋通路。促AS調(diào)節(jié)作用有HIF1α/VAGF/VCAM，增加內(nèi)皮脆性和通透性，同時(shí)招募更多的炎性細(xì)胞；CD163與斑塊不穩(wěn)定因子Lp-PLA2、COMP共定位。

4 結(jié)語

巨噬細(xì)胞極化與AS斑塊形成、進(jìn)展以及不穩(wěn)定性密切相關(guān)，其中Mhem/M(Hb)在AS斑塊中表現(xiàn)為雙向調(diào)節(jié)的作用，因此無法定義Mhem/M(Hb)是一種抗AS/促AS的細(xì)胞。無可厚非的是，充分利用已發(fā)現(xiàn)的內(nèi)在聯(lián)系和信號(hào)通路，并相應(yīng)地調(diào)節(jié)這些分子的表達(dá)，從而達(dá)到所期望的效果，是目前研究的熱點(diǎn)以及有效的治療方向。一方面，利用Mhem/M(Hb)在斑塊中的具有保護(hù)作用的機(jī)制通路，比如，從葡萄糖苷橄欖苦苷中提取的活性分子Oleacein，通過增加巨噬細(xì)胞CD163和IL-10的表達(dá)促進(jìn)Mhem/M(Hb)極化，從而發(fā)揮抗炎和抗AS 的作用[37]。另一方面，抑制Mhem/M(Hb)在斑塊中發(fā)揮促AS斑塊進(jìn)展的關(guān)鍵分子的表達(dá)，比如，HIF1α/VEGF-A通路等?？偠灾?，探究AS斑塊中Mhem/M(Hb)的極化開啟了研究AS機(jī)制和治療的一扇窗，需繼續(xù)深入研究與發(fā)現(xiàn)。