陳偉釗，王懷龍（通訊作者），胡秀媚，黎春光，陳敏琪

（東莞市寮步醫(yī)院心血管內(nèi)科 廣東 東莞 523400）

心力衰竭是多種心臟疾病的終末階段，具有較高的病死率。近年來隨著我國人口老齡化，我國慢性心力衰竭（chronic heart failure,CHF）的發(fā)病率呈升高趨勢，嚴(yán)重威脅人們健康。目前，臨床上對于CHF 主張?jiān)缙谠\斷，早期治療[1-2]。既往N 末端B 型利納肽原或B 型利納肽等標(biāo)記物是評(píng)價(jià)CHF 病情進(jìn)展與預(yù)后的主要指標(biāo)，但臨床應(yīng)用效果欠佳。因此，探索一個(gè)或多個(gè)指導(dǎo)CHF 早期準(zhǔn)確診斷和治療的指標(biāo)成為臨床學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)，而了解心力衰竭形成機(jī)制對于指導(dǎo)臨床治療、改善心力衰竭患者生活質(zhì)量具有重要意義。先前大量研究[3-5]表明丁基苯酞在缺血的腦組織中具有提高能量代謝，抗氧化作用，促進(jìn)微循環(huán)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡以及抑制炎癥反應(yīng)的作用。然而丁基苯酞在心力衰竭患者房顫發(fā)生過程中是否具有保護(hù)效應(yīng)尚不得知。microRNAs（miRNAs）在神經(jīng)發(fā)育和多種神經(jīng)疾病中有著重要作用，而miR-548a-5p 作為一個(gè)靈長類特有的miRNA 家族，其在多種疾病中異常表達(dá)，NF-κB 廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，是細(xì)胞中一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-548a-5p可與NF-κB的3’-URT結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控炎癥因子NF-κB，提示miR-548a-5p 可能是NF-κB 的調(diào)控分子。故本研究建立大鼠心力衰竭模型，并通過給予藥物丁基苯酞觀察大鼠心力衰竭的發(fā)生，探討丁基苯酞通過miR-548a-5p 調(diào)控NF-κB 在大鼠心力衰竭中的影響及作用機(jī)制，為臨床心力衰竭治療提供參考。

1.資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性Sprague-Dawley 大鼠54 只（SPF 級(jí)），體重237～286 g，平均體重（262±13）g，飼養(yǎng)于溫度22 ℃、濕度60%的無菌環(huán)境中。光周期為12 h 光/暗周期。所有大鼠在5 d 適應(yīng)期后進(jìn)行測試。將將左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fractions,LVEF）＜45%的心力衰竭模型大鼠隨機(jī)分為丁基苯酞組（NBP）、模型組（Model）和假手術(shù)組（Sham），每組18 只。將丁苯酞溶解于大豆油中制備10 mg/mL 丁苯酞溶液。丁基苯酞組大鼠灌胃80 mg/kg 體重，模型組和假手術(shù)組大鼠灌胃等量大豆油。假手術(shù)組大鼠不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支行同樣的手術(shù)。本研究已獲我院動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

心力衰竭模型的制作：結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支建立心肌梗死模型。大鼠腹腔注射7%水合氯醛（250 mg/kg體重）麻醉后，用自制的可連接呼吸機(jī)的插管。呼吸機(jī)的呼吸頻率設(shè)定為70 次/min，潮氣量為1 mL/100 g 體重。胸部在第三和第四肋間打開，心臟完全暴露。用尼龍線結(jié)扎左心房邊緣下2.5 mm 的ladca。當(dāng)ladca 區(qū)由鮮紅色變?yōu)榈t色，心肌收縮力下降，心電圖ST 段抬高改變時(shí)，說明ladca 結(jié)扎成功。然后關(guān)閉胸骨和皮膚，將大鼠轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中。當(dāng)大鼠開始吞咽時(shí)，氣管插管被移除。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）評(píng)估三組心功能：術(shù)后3 d 收集血清評(píng)估左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF），B 型腦鈉肽（BNP），N 末端B 型腦鈉肽原（NT-proBNP）水平；（2）甲醛固定好HE 染色，Masson 染色和免疫組化以及NF-κB/MAPK 信號(hào)通絡(luò)相關(guān)蛋白的表達(dá)；運(yùn)用western Blot 檢測NF-κB 及NFκB/MAPK 信號(hào)通絡(luò)相關(guān)蛋白表達(dá)水平以及實(shí)時(shí)定量RTPCR miR-548a-5p 的mRNA 的表達(dá)水平；（3）運(yùn)用熒光素酶報(bào)告基因，RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀、凝膠電泳遷移率試驗(yàn)等方法檢測NF-κB 和miR-548a-5p 之間的相互關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)、率（%）表示，行χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

miR-548a-5p 的表達(dá)水平在模型組大鼠心肌組織樣本中上調(diào)，丁基苯酞顯著下調(diào)miR-548a-5p 的表達(dá)水平（P＜0.05），見圖2。

羅爹爹急喊無用，轉(zhuǎn)眼便不見他的人影。羅爹爹腿力不行，忙打電話給兒子羅四強(qiáng)。羅爹爹說：“四強(qiáng)，你趕緊過來。阿里跑不見了，我追不到他。”

2.結(jié)果

2.1 心功能及BNPNT-proBNP 指標(biāo)

從圖4可以看出,隨著通信半徑的增加,網(wǎng)絡(luò)連通性提高,所以各算法的平均定位誤差均降低,本文定位算法平均定位誤差始終保持最小,優(yōu)于其他算法?？梢钥闯鲈谙嗤亩ㄎ徽`差下,本文算法所需要的通信半徑最小,通信半徑越小,能耗越小,在同等條件下,本文算法可以節(jié)約能耗,延長網(wǎng)絡(luò)壽命,降低網(wǎng)絡(luò)維護(hù)成本。

表1 三組大鼠心功能及BNPNT-proBNP 指標(biāo)對比（）

表1 三組大鼠心功能及BNPNT-proBNP 指標(biāo)對比（）

2.2 大鼠心肌組織中NF-κB 的蛋白表達(dá)及NF-κB/MAPK 信號(hào)通絡(luò)相關(guān)蛋白的表達(dá)

雖然心力衰竭的機(jī)制研究尚不明了[6]，但炎性細(xì)胞因子在心衰的發(fā)展和進(jìn)展中有致病作用[7-8]，但這些細(xì)胞因子同時(shí)具有有益的心臟保護(hù)作用。免疫激活和炎性細(xì)胞因子的釋放可能是心肌損傷適應(yīng)性反應(yīng)的一部分，某些情況下，對于保持心肌功能可能是必要的[9-10]。在針對心衰制定免疫調(diào)節(jié)治療措施時(shí)必須要考慮到過度的治療，即使是針對特異細(xì)胞因子的靶向治療，也可能會(huì)抑制心臟保護(hù)進(jìn)程并造成損害。因此在心衰治療中，應(yīng)支持和采取一種廣泛的免疫治療方法，其目的是調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失調(diào)狀態(tài)，而不是阻滯某種特定細(xì)胞因子的功能[11-12]。

圖1 丁基苯酞對炎癥介質(zhì)NF-κB（A）和NF-κB/MAPK 信號(hào)通路（B）的蛋白表達(dá)的影響

2.3 大鼠心肌組織中miR-548a-5p 的mRNA 的表達(dá)水平

其中：X仍為系統(tǒng)的狀態(tài)向量，Xd=xd為針對小球在導(dǎo)軌上的位置x而輸入的參考軌跡。則根據(jù)上文研究的球桿系統(tǒng)可知：A11=A，B1=B。且系統(tǒng)的參考軌跡輸入并不會(huì)影響系統(tǒng)內(nèi)部的運(yùn)動(dòng)規(guī)律，則有：

圖2 RT-PCR 檢測大鼠心肌組織中miR-548a-5p 的含量

2.4 丁基苯酞對心房纖維化的影響

心力衰竭是多種心臟疾病的最后階段，是心臟疾病進(jìn)展到終末期的共同通路，采用各種措施來阻止心力衰竭的發(fā)生發(fā)展是臨床防治心肌病變，延緩心功能衰減的重要手段[13]。本研究從體內(nèi)研究丁基苯酞可通過抑制miR-548a-5p 調(diào)控NF-κB 減輕心力衰竭導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷的作用和機(jī)制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)用丁基苯酞治療4 周后，與模型組相比，丁基苯酞治療導(dǎo)致該組大鼠的LVEF 值顯著增加，BNP、NT-proBNP 表達(dá)水平顯著降低，表明丁基苯酞可減輕心力衰竭的發(fā)生，從而保護(hù)心臟功能。

圖3 丁基苯酞對心房纖維化的影響

3.討論

炎癥介質(zhì)NF 在模型組-κB 蛋白表達(dá)顯著增加，丁基苯酞顯著抑制該指數(shù)（P＜0.05），見圖1A；此外，與假手術(shù)組相比，模型組NF-κB 表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，丁基苯酞組NF-κB 和MAPK 表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05），見圖1B。

與模型組相比，丁基苯酞治療導(dǎo)致該組大鼠的LVEF 值顯著增加，BNP、NT-proBNP 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見表1。

Masson 三色染色顯示假手術(shù)組左心房輕度纖維化，而模型組顯示嚴(yán)重纖維化、廣泛的肌原纖維斷裂和顯著的心肌細(xì)胞肥大，見圖3A；丁基苯酞顯著減少纖維化和心肌細(xì)胞肥大（P＜0.05），見圖3B。

研究小組應(yīng)用生物信息學(xué)分析miR-548a-5p 啟動(dòng)子序列時(shí)發(fā)現(xiàn)，NF-κB 3’-UTR 區(qū)域含有miR-548a-5p 結(jié)合位點(diǎn)，在細(xì)胞和動(dòng)物心臟纖維化模型中可發(fā)現(xiàn)NF-κB的表達(dá)上調(diào)。本研究將進(jìn)一步克隆miR-548a-5p 3’-UTR，通過染色質(zhì)免疫共沉淀（CHIP）、凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA）以及熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測miR-548a-5p與NF-κB 之間的相互作用，結(jié)果顯示，模型組的炎癥介質(zhì)NF-κB 蛋白表達(dá)量顯著增加，而該指標(biāo)均被丁基苯酞顯著抑制（P＜0.05），表明NF-κB 在心臟HCM 細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，且在給予藥物丁基苯酞后小鼠心臟中其表達(dá)量明顯上調(diào)，NF-κB 具有炎癥損傷的作用。

無論此刻的你是在大雪紛飛的冬夜里，還是星光閃耀的星空下，愿你身邊有愛人，手旁有酒，微微醺然，心暖而安。圣誕節(jié)快樂。

本文結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組中NF-κB和MAPK 均上調(diào)，而與模型組相比，丁基苯酞顯著下調(diào)NF-κB 及其下游抗氧化劑反應(yīng)元件MAPK（P＜0.05），提示miR-548a-5p 的表達(dá)水平在模型組大鼠心肌組織樣本中上調(diào)，丁基苯酞顯著下調(diào)miR-548a-5p 的表達(dá)水平，提示給予NF-κB/MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑能夠干預(yù)丁基苯酞抑制miR-548a-5p 的表達(dá)，推測丁基苯酞抑制miR-548a-5p 的表達(dá)而調(diào)控NF-κB 參與心力衰竭患者房顫發(fā)生發(fā)展。

嚴(yán)重的心房纖維化可產(chǎn)生異常的電生理特征，包括心肌傳導(dǎo)速度減慢和傳導(dǎo)阻滯，最終導(dǎo)致心房顫動(dòng)，尤其是在心力衰竭的過程中。因此，抗纖維化治療在心房顫動(dòng)的上游治療中起著重要作用。結(jié)果顯示，假手術(shù)組左心房Masson 三色染色顯示輕度纖維化，模型組左心房纖維化嚴(yán)重，肌原纖維廣泛斷裂，心肌細(xì)胞明顯肥大，提示丁基苯酞可減輕心肌梗死心力衰竭大鼠心房重構(gòu)和纖維化。因此，丁基苯酞有望成為上游治療心房顫動(dòng)的有效藥物。

綜上所述，丁基苯酞可通過抑制miR-548a-5p 的表達(dá)，直接調(diào)控NF-κB，進(jìn)而減少了心力衰竭發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。