隋志方，劉延奇，秦令祥

（1.鶴壁市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，河南 鶴壁 458030；2.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；3.漯河市食品研究院有限公司，河南 漯河 462300）

黑木耳（Auricularia auricular）又名云耳，因其性平、味甘，是藥食兩用食用菌之一[1]。黑木耳多糖（Auricularia auricular polysaccharides，AAP） 是黑木耳中含有的活性成分之一，具有腫瘤抑制[2]、免疫力調(diào)節(jié)[3-4]、降脂[5]、抗氧化[6]、調(diào)節(jié)血糖、抗衰老、抗突變、抗炎、抗細(xì)菌等作用。

近年來，在黑木耳多糖提取方法及工藝優(yōu)化方面有大量研究[7]報(bào)道。主要有熱水提取法、酶提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法等[8-13]，他們或多或少都有缺點(diǎn)，如熱水提取法存在得率低、提取時(shí)間長、能耗高等缺點(diǎn)[13]；酶提取法存在得率偏低、提取時(shí)間長等缺點(diǎn)；微波輔助提取法存在有限的穿透深度和不顯著的傳質(zhì)功能等缺點(diǎn)；超聲波輔助提取法存在熱效應(yīng)不顯著和空化泡范圍存在局限等缺點(diǎn)[14]。酶解技術(shù)是利用酶反應(yīng)具有的專一性特點(diǎn)，破壞植物細(xì)胞壁，加速活性成分的溶出。超高壓技術(shù)是在高壓條件下使其物理、化學(xué)性質(zhì)迅速發(fā)生改變的非熱加工技術(shù)，在一定程度上破壞其生物組織，促進(jìn)活性物質(zhì)從細(xì)胞內(nèi)溶出，進(jìn)而提高活性成分的得率，具有高效、快速、低能、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)[15]。本試驗(yàn)采用復(fù)合酶協(xié)同超高壓輔助法提取AAP，首先通過復(fù)合酶處理提取，然后再進(jìn)行超高壓輔助提取，此法是一種得率高、提取溫度低、提取時(shí)間短、能耗低、對(duì)活性成分損傷小的新型天然產(chǎn)物提取技術(shù)[16-17]，近年來，利用復(fù)合酶協(xié)同超高壓法提取AAP的研究尚未見報(bào)道。因此，本研究旨在為AAP的提取提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑木耳：市售；纖維素酶（20 000 U/g）：河北利華生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（100 000 U/g）：陜西源優(yōu)生物科技有限公司；檸檬酸、葡萄糖、硫酸、無水乙醇、苯酚、磷酸氫二鈉（均為分析純）：四川佰春科技有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UHP900×2-Z型超高壓處理設(shè)備：包頭文天科技有限責(zé)任公司；RE-3000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海耀特儀器設(shè)備有限公司；760CRT紫外-可見分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；PE-28酸度計(jì)：北京梅特勒-托利多儀器有限公司；D2015W電動(dòng)攪拌器：上海梅穎浦儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 復(fù)合酶協(xié)同超高壓法提取AAP

黑木耳→烘干→粉碎（過80目篩）→黑木耳粉→加入料液比為1∶30（g/mL）的水，混合均勻→調(diào)節(jié)pH值（檸檬酸和磷酸氫二鈉緩沖液）→按照酶解工藝條件進(jìn)行復(fù)合酶法提取→取出裝入真空袋中、密封→置于超高壓設(shè)備中超高壓提取→得到提取液（里面含有大量的膠狀物質(zhì)，主要為蛋白和多糖）→經(jīng)Sevag法[18]脫蛋白→離心（5 000 r/min，10 min）→取上清液減壓濃縮→醇沉（3倍體積95%的乙醇溶液）→靜置（4℃冰箱，24 h）→離心（5 000 r/min，10 min）→取沉淀進(jìn)行真空干燥→黑木耳粗多糖。

1.3.2 AAP含量的測(cè)定

采用池源等[19]苯酚-硫酸法進(jìn)行測(cè)定。每次測(cè)定時(shí)，先制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（以葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算AAP的含量。

1.3.3 AAP得率的計(jì)算采用文獻(xiàn)[20-21]中的公式計(jì)算AAP得率。

式中：c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的AAP質(zhì)量濃度，mg/mL；V 為定容體積，mL；N 為稀釋倍數(shù)；m 為黑木耳干粉質(zhì)量，g。

1.3.4 復(fù)合酶協(xié)同超高壓法提取AAP試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.4.1 復(fù)合酶法提取AAP單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

準(zhǔn)確稱取10 g黑木耳粉5份，利用緩沖液（pH值為8.0磷酸氫二鈉、pH值為3.0的檸檬酸）分別調(diào)節(jié)黑木耳料液 pH 值為 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，復(fù)合酶（纖維素酶∶木瓜蛋白酶質(zhì)量比為1∶1，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，復(fù)合后的酶解最適pH值在6左右）添加量為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，酶解溫度為 30、40、50、60、70℃，酶解時(shí)間為 20、30、40、50、60 min 的條件下，按 1.3.1 方法中酶解工藝條件進(jìn)行復(fù)合酶法提取工藝單因素試驗(yàn)，測(cè)定并計(jì)算AAP得率，其余條件不變，分析上述4個(gè)因素對(duì)AAP得率的影響，每組試驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

1.3.4.2 復(fù)合酶法提取AAP正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在預(yù)試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取表1所列的4個(gè)因素，采用L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化。

表1 復(fù)合酶法正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Orthogonal assay factor level by compound enzyme method

1.3.4.3 復(fù)合酶協(xié)同超高壓法提取AAP單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取10 g黑木耳粉5份，經(jīng)復(fù)合酶法提取后，取出再裝入真空袋中密封后，置于超高壓設(shè)備中進(jìn)行超高壓提取，分別設(shè)置壓力為 200、300、400、500、600 MPa，料液比為 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL），提取溫度為 30、40、50、60、70 ℃，保壓時(shí)間為 2、4、6、8、10 min，按1.3.1方法中超高壓工藝條件進(jìn)行超高壓提取，測(cè)定并計(jì)算AAP得率，其余條件不變，分析上述4個(gè)因素對(duì)AAP得率的影響，每組試驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

1.3.4.4 復(fù)合酶協(xié)同超高壓法提取AAP正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在預(yù)試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取表2所列的4個(gè)因素，采用L9（34）正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。

表2 復(fù)合酶協(xié)同超高壓法正交試驗(yàn)因素水平Table 2 The level of orthogonal test factors of compound enzyme-assisted ultra-high pressure method

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel整理，采用正交設(shè)計(jì)助手進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶法提取AAP單因素試驗(yàn)

2.1.1 復(fù)合酶添加量對(duì)AAP得率的影響

復(fù)合酶添加量對(duì)AAP得率的影響見圖1。

圖1 復(fù)合酶添加量對(duì)AAP得率的影響Fig.1 Effect of compound enzyme addition on the AAP extraction rate

由圖1可知，當(dāng)復(fù)合酶添加量≤2.5%時(shí)，AAP得率隨著復(fù)合酶添加量的增加而逐漸升高，當(dāng)復(fù)合酶添加量>2.5%后，得率變化不明顯。這是因?yàn)?，增加?fù)合酶添加量，酶解更充分，多糖溶出增多，AAP得率升高。當(dāng)復(fù)合酶添加量達(dá)到2.5%后，酶解反應(yīng)基本完全，再繼續(xù)增加復(fù)合酶添加量，AAP得率無明顯變化并趨于穩(wěn)定。故取2.5%為最佳復(fù)合酶添加量。

2.1.2 酶解pH值對(duì)AAP得率的影響

酶解pH值對(duì)AAP得率的影響見圖2。

圖2 酶解pH值對(duì)AAP得率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis pH value on the AAP extraction rate

由圖2可知，AAP得率隨著酶解pH值的升高呈先升高再降低的趨勢(shì)，當(dāng)酶解pH值為6.0時(shí)，AAP得率達(dá)到最大，隨酶解pH值繼續(xù)增大，AAP得率反而降低。這是因?yàn)?，纖維素酶和木瓜蛋白酶復(fù)合后的最適pH值在6.0左右，因此pH值為6.0時(shí)，復(fù)合酶活性最高，酶解最充分，AAP得率也最高，pH值降低或升高，AAP得率均降低。故取6.0為最佳酶解pH值。

2.1.3 酶解溫度對(duì)AAP得率的影響

酶解溫度對(duì)AAP得率的影響見圖3。

圖3 酶解溫度對(duì)AAP得率的影響Fig.3 EffectofenzymolysistemperatureontheAAPextractionrate

由圖3可知，AAP得率隨著酶解溫度的升高先升高再降低。這是因?yàn)?，隨著酶解溫度的升高，酶活性逐步增強(qiáng)，酶解反應(yīng)加快，多糖溶出增多，AAP得率升高；當(dāng)酶解溫度>50℃后，酶活性降低，再繼續(xù)增加酶解溫度，會(huì)導(dǎo)致部分酶會(huì)失去活性，AAP得率降低。故取50℃為最佳酶解溫度。

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)AAP得率的影響

酶解時(shí)間對(duì)AAP得率的影響見圖4。

由圖4可知，AAP得率隨著酶解時(shí)間的增加而逐步升高并趨于穩(wěn)定，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到50 min時(shí)，AAP得率達(dá)到最大，再延長酶解時(shí)間，AAP得率也不會(huì)明顯升高而趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)?，酶解時(shí)間過短，酶解程度較低，酶解不充分，多糖溶出不多；而酶解時(shí)間達(dá)到最佳時(shí)間后，酶解已經(jīng)完全，再延長酶解時(shí)間，AAP得率也不會(huì)明顯升高。故取50 min為最佳酶解時(shí)間。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)AAP得率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on the AAP extraction rate

2.1.5 復(fù)合酶法提取AAP正交試驗(yàn)結(jié)果

復(fù)合酶法提取AAP正交試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表3 復(fù)合酶法正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of the orthogonal assay by compound enzyme method

表4 復(fù)合酶法方差分析結(jié)果Table 4 The variance analysis results by the complex enzyme method

由表3，表4的結(jié)果分析可知，4個(gè)因素的影響順序?yàn)椋篋＞A＞C＞B。酶解時(shí)間和復(fù)合酶添加量對(duì)AAP得率影響較大，達(dá)到了顯著水平，其他因素不顯著。最佳工藝參數(shù)為：A3B3C2D2，即酶解時(shí)間50 min，復(fù)合酶添加量3%，酶解溫度50℃，酶解pH值6.5。在上述最優(yōu)條件下做驗(yàn)證試驗(yàn)，平行3次，得到AAP得率為9.26%（3次平均值），高于試驗(yàn)組A3B1C3D2的AAP得率（9.25%）。因此，選取工藝參數(shù)A3B3C2D2為復(fù)合酶法提取AAP最佳工藝。

2.2 復(fù)合酶協(xié)同超高壓法提取AAP的工藝優(yōu)化

在復(fù)合酶法提取AAP的最佳工藝條件下，再進(jìn)一步協(xié)同超高壓法提取AAP。

2.2.1 料液比對(duì)AAP得率的影響

料液比對(duì)AAP得率的影響見圖5。

圖5 料液比對(duì)AAP得率的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ration on the AAP extraction rate

由圖 5 可知，當(dāng)料液比為 1∶10（g/mL）～1∶30（g/mL）時(shí)，AAP得率隨著溶劑的量增加而不斷升高，當(dāng)料液比達(dá)到 1∶30（g/mL）后，再繼續(xù)增大溶劑的量，AAP 得率也不再顯著變化而趨于平緩。這是因?yàn)椋軇┑牧吭龆?，黑木耳?xì)胞內(nèi)外的濃度差增大，傳質(zhì)速率加快，多糖溶出增多，得率升高；但溶劑量達(dá)到一定程度時(shí)，多糖溶出基本完全，再增加溶劑，AAP得率也不再明顯變化。故取1∶30（g/mL）為最佳料液比。

2.2.2 壓力對(duì)AAP得率的影響

壓力對(duì)AAP得率的影響見圖6。

圖6 壓力對(duì)AAP得率的影響Fig.6 Effect of pressure on the AAP extraction rate

由圖6可知，當(dāng)壓力≤400 MPa時(shí)，AAP得率隨著壓力的增加而升高，當(dāng)壓力>400 MPa后，再繼續(xù)增加壓力，AAP得率也不會(huì)明顯變化。這是因?yàn)椋S著壓力的增加，細(xì)胞破裂程度和數(shù)量增多，多糖從細(xì)胞中的傳質(zhì)速率和溶出率提高，AAP得率升高；但當(dāng)壓力達(dá)到400 MPa后，細(xì)胞已破裂基本完全，再增加壓力，AAP得率也不再明顯變化。故取400 MPa為最佳壓力。

2.2.3 提取溫度對(duì)AAP得率的影響

提取溫度對(duì)AAP得率的影響見圖7。

圖7 提取溫度對(duì)AAP得率的影響Fig.7 Effect of extraction temperatrue on the AAP polysaccharide yield

由圖7可知，當(dāng)提取溫度≤50℃時(shí)，AAP得率隨著提取溫度的升高而升高，當(dāng)提取溫度>50℃后，AAP得率變化趨于平緩。這是因?yàn)?，溶解度隨溫度升高而升高，促使多糖成分在提取溶劑中的滲透和溶出加快，得率升高，當(dāng)溫度>50℃后，多糖溶出基本完全，再繼續(xù)增加提取溫度，AAP得率不再明顯變化而趨于平緩。故取50℃為最佳提取溫度。

2.2.4 保壓時(shí)間對(duì)AAP得率的影響

保壓時(shí)間對(duì)AAP得率的影響見圖18。

圖8 保壓時(shí)間對(duì)AAP得率的影響Fig.8 Effect of ultra-high pressure extraction holding time on the AAP extraction rate

由圖8可知，當(dāng)保壓時(shí)間≤6 min時(shí)，AAP得率隨著保壓時(shí)間的增加而升高，當(dāng)保壓時(shí)間>6 min后，再繼續(xù)增加保壓時(shí)間，AAP得率也基本不再變化。這是因?yàn)?，?xì)胞需要一定時(shí)間才能破碎，時(shí)間增加，細(xì)胞破碎增多，多糖溶出增多，AAP得率升高，當(dāng)保壓時(shí)間超過6 min后，細(xì)胞破裂和多糖溶出基本完全，繼續(xù)增加保壓時(shí)間，AAP得率也不會(huì)明顯升高。故取6 min為最佳保壓時(shí)間。

2.2.5 復(fù)合酶協(xié)同超高壓法提取AAP正交試驗(yàn)結(jié)果

復(fù)合酶協(xié)同超高壓法提取AAP正交試驗(yàn)結(jié)果見表5，方差分析結(jié)果見表6。

表5 復(fù)合酶協(xié)同超高壓法正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 The result of orthogonal experimental design by compound enzyme-assisted ultra-high pressure method

表6 復(fù)合酶協(xié)同超高壓法方差分析結(jié)果Table 6 The variance analysis results by compound enzymeassisted ultra-high pressure method

由表5、表6的結(jié)果分析可知，4個(gè)因素的影響順序?yàn)椋篋＞C＞B＞A。保壓時(shí)間對(duì)AAP得率影響較大，達(dá)到了顯著水平，其他因素不顯著，最佳工藝參數(shù)為：A2B2C2D3，即保壓時(shí)間8 min，提取溫度50℃，壓力400 MPa，料液比 1∶30（g/mL）。在上述最優(yōu)條件下做驗(yàn)證試驗(yàn)，平行3次，得到AAP得率為12.23%（3次平均值），高于試驗(yàn)組A2B1C2D3的AAP得率（12.21%）。因此，選取工藝參數(shù)A2B2C2D3為復(fù)合酶協(xié)同超高壓法提取AAP最佳工藝。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用復(fù)合酶協(xié)同超高壓法提取AAP，并對(duì)其工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳工藝條件：酶解時(shí)間50min，復(fù)合酶添加量3%，酶解溫度50℃，酶解pH值6.5。然后再協(xié)同超高壓法提取AAP，得到最佳工藝條件：保壓時(shí)間8 min，提取溫度50℃，壓力400 MPa，料液比1∶30（g/mL），該協(xié)同條件下，AAP 得率為 12.23%，比單獨(dú)使用復(fù)合酶法提取AAP，得率提高了32.07%。本試驗(yàn)方法為AAP的提取及應(yīng)用提供一種參考。