黃昊,何涓源,賴思婷,嚴兆蘭,馮艷麗,余翔*
(1.浙江恒通生物科技股份有限公司,浙江 湖州 313014;2.湖北師范大學生命科學學院,食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室,湖北 黃石 435002)
青蝦(Macrobrachium nipponense)學名日本沼蝦,其味道鮮美、營養(yǎng)豐富,深受消費者青睞,市場需求量逐年上升[1],但值得關(guān)注的是,包括青蝦在內(nèi)的蝦類水產(chǎn)品在被捕獲離水后容易死亡,且在后續(xù)加工和冷藏過程中由于微生物增殖、內(nèi)源酶作用和脂質(zhì)氧化等因素的影響,往往會導(dǎo)致新鮮蝦產(chǎn)品發(fā)生腐敗變質(zhì)現(xiàn)象[2]。雖然已有的冷凍技術(shù)能夠有效地延長蝦類水產(chǎn)品的保藏期,但冷凍和解凍工序會對青蝦色澤、質(zhì)地、風味以及持水力等感官品質(zhì)造成不可逆的負面影響,極大地影響青蝦的質(zhì)量和經(jīng)濟性[3-4]。隨著消費者對低溫肉制品接受度的與日俱增和我國冷鏈技術(shù)的完善,如何提升新鮮青蝦的冷藏貨架期成為行業(yè)關(guān)注的熱點,眾多學者對之開展了大量研究,其中天然保鮮劑技術(shù)以其高效、安全、低成本和易實施的特點而備受關(guān)注。
近年來,隨著天然保鮮劑研究的深入,各種具有抑菌保鮮作用的天然物質(zhì)正在被逐步開發(fā)應(yīng)用于水產(chǎn)品保鮮中,取得了較好的冷藏保鮮效果。但研究同時也表明,使用單一天然保鮮劑進行食品保鮮時,往往會出現(xiàn)保鮮劑用量過大且保鮮效果有限的現(xiàn)象,根據(jù)柵欄技術(shù)的原理,將不同的天然保鮮劑進行復(fù)配,可發(fā)揮其協(xié)同效應(yīng)使保鮮效果大幅提升[5]。于淑池等[6]將殼聚糖、ε-聚賴氨酸鹽酸鹽和茶多酚進行復(fù)配,對金鯧魚進行冷藏保鮮,結(jié)果表明使用復(fù)配保鮮劑處理的金鯧魚樣品的一級鮮度和貨架期均延長4 d,保鮮效果優(yōu)于單獨使用殼聚糖的對照組。Na等[7]研究表明,相比單一組分涂膜,殼聚糖和賴氨酸復(fù)配涂膜對南美青蝦肌肉內(nèi)以假單胞菌為代表的嗜溫菌和以硫化氫產(chǎn)生菌為代表的嗜冷菌生長有顯著抑制作用(P<0.05)。趙海鵬[8]對殼聚糖、茶多酚和乳酸鏈球菌素的復(fù)配抑菌試驗結(jié)果表明,該復(fù)配保鮮劑能使菌體變形,在菌體表面形成泡狀結(jié)構(gòu),破壞細胞壁和細胞膜的結(jié)構(gòu),抑菌效果顯著。因此,本研究擬將殼聚糖、卡拉膠、迷迭香提取物和乳酸鏈球菌素4種天然保鮮劑通過正交試驗進行配方優(yōu)化,開發(fā)出復(fù)配天然保鮮劑應(yīng)用于青蝦冷藏保鮮。
青蝦:浙江恒通生物科技股份有限公司養(yǎng)殖基地,捕撈后以鮮活狀態(tài)運輸至實驗室進行后續(xù)樣品保鮮處理;胡蘿卜:市售。
殼聚糖(脫乙酰度≥90%)、迷迭香提取物、卡拉膠、乳酸鏈球菌素(均為食品級):河南圣斯得實業(yè)有限公司;硼酸、氧化鎂、硫酸、氫氧化鈉(均為分析純):國藥集團化學試劑有限公司。
全自動凱氏定氮儀(K9860):山東海能科學儀器有限公司;生物潔凈工作臺(BCM-1300A):蘇凈集團安泰公司;電子天平(CP114):美國奧豪斯儀器(上海)有限公司;pH計(PHS-3C):上海精密科學儀器有限公司。
1.3.1 復(fù)配保鮮劑的配制及樣品處理方法
分別稱取一定質(zhì)量的殼聚糖粉末,用1%醋酸溶液溶解制成殼聚糖溶液,再將迷迭香提取物、卡拉膠和乳酸鏈球菌素分別按比例稱取并溶解至殼聚糖溶液中,攪拌均勻制成復(fù)配保鮮劑,置于4℃貯藏備用。將新鮮青蝦洗凈、瀝干,按料液比1∶2(g/mL)浸沒至復(fù)配保鮮劑中10 min,撈出置于4℃環(huán)境瀝干30 min后,分組裝入保鮮袋中置于4℃進行冷藏。
1.3.2 殼聚糖成膜濃度考察
在復(fù)配天然保鮮劑中,殼聚糖是重要的成膜材料,其成膜性好壞直接決定青蝦的保鮮效果,因此,確定殼聚糖的成膜濃度至關(guān)重要。分別配制濃度為0.75%、1.00%、1.25%、1.50%、1.75%的殼聚糖溶液,分別將其涂在胡蘿卜塊表面,制備成裝片置于低倍鏡下(100倍)進行成膜性觀察。然后分別取10 mL殼聚糖溶液均勻涂布在載玻片表面,50℃烘干30 min后觀察殼聚糖在載玻片表面的成膜連續(xù)性。以蒸餾水為空白對照(CK)。
1.3.3 單因素試驗設(shè)計
采用單因素試驗,考察殼聚糖、卡拉膠、迷迭香提取物和乳酸鏈球菌素的質(zhì)量分數(shù)對涂膜處理后的青蝦在4℃冷藏3 d后保鮮效果的影響。設(shè)定復(fù)配天然保鮮劑基礎(chǔ)配方為殼聚糖質(zhì)量分數(shù)1.5%,卡拉膠質(zhì)量分數(shù)0.20%,迷迭香提取物質(zhì)量分數(shù)0.06%,乳酸鏈球菌素質(zhì)量分數(shù)0.06%,考察殼聚糖質(zhì)量分數(shù)(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)、卡拉膠質(zhì)量分數(shù)(0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%)、迷迭香提取物質(zhì)量分數(shù)(0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%)和乳酸鏈球菌素質(zhì)量分數(shù)(0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%)對青蝦冷藏保鮮效果的影響。
1.3.4 復(fù)配天然保鮮劑優(yōu)化
根據(jù)單因素試驗結(jié)果,以殼聚糖、卡拉膠、迷迭香提取物和乳酸鏈球菌素的質(zhì)量分數(shù)為因素,每個因素設(shè)3個水平,以貯藏3d后青蝦的揮發(fā)性鹽基氮(total volatilebasicnitrogen,TVB-N)值為參考指標,采用L9(34)正交試驗優(yōu)化復(fù)配天然保鮮劑配方。因素水平見表1。
表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment
1.3.5 揮發(fā)性鹽基氮值
參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標準食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》,采用凱氏定氮法進行測定,平行測定3次。
試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件的one-way ANOVA程序進行方差分析,采用Duncan氏多重比較檢驗,結(jié)果以平均值±標準差表示,P<0.05為差異顯著性標準。
青蝦體內(nèi)富含大量多酚氧化酶類,在保鮮貯藏過程中如不充分隔絕氧氣,青蝦極易發(fā)生由于酚類氧化而導(dǎo)致的褐變現(xiàn)象,造成青蝦貯藏品質(zhì)的下降[9]。因此,在青蝦冷藏保鮮過程中不僅要考慮殼聚糖對青蝦體內(nèi)腐敗微生物的抑菌效果,而且更要關(guān)注殼聚糖在青蝦表面成膜的效果。
不同濃度(0.75%、1.00%、1.25%、1.50%、1.75%)殼聚糖溶液涂膜胡蘿卜的顯微觀察結(jié)果見圖1,成膜效果見圖2。
圖1 不同濃度殼聚糖成膜顯微觀察圖(100×)Fig.1 The microscope photo of chitosan film with different concentration(100×)
圖2 不同濃度殼聚糖成膜效果Fig.2 Theperformanceofchitosanfilmwithdifferentconcentration
圖1中,殼聚糖濃度低于1.00%時,其在胡蘿卜表面形成的膜不連續(xù)且各部位薄厚不一,成膜性較差,而殼聚糖濃度≥1.00%以上時,開始在胡蘿卜表面形成連續(xù)且薄厚均一的膜,隨著殼聚糖濃度的逐步增大,膜的厚度隨之增加。同樣,當殼聚糖濃度≥1.00%時,在玻璃載玻片上涂膜形成的殼聚糖膜連續(xù)且厚薄均一(圖2),無空缺現(xiàn)象。因此,可確定殼聚糖成膜濃度為1.00%。
2.2.1 殼聚糖質(zhì)量分數(shù)的確定
不同質(zhì)量分數(shù)的殼聚糖對青蝦TVB-N值的影響見圖3。
圖3 不同質(zhì)量分數(shù)的殼聚糖對青蝦TVB-N值的影響Fig.3 Effect of different concentration of chitosan on TVB-N value of shrimp
揮發(fā)性鹽基氮是動物源食品原料貯藏和加工過程中,由于體內(nèi)內(nèi)源酶和外界微生物的共同作用導(dǎo)致肌肉蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生氨及低級別胺類化合物,其含量高低是評判動物源食品保鮮效果的重要參數(shù)[10]。GB 2733—2015《食品安全國家標準鮮、凍動物性水產(chǎn)品》[11]規(guī)定淡水魚蝦TVB-N≤20 mg/100 g。經(jīng)過涂膜處理的青蝦4℃冷藏3 d后,無添加組(0%)和0.5%殼聚糖涂膜組青蝦樣品的TVB-N值分別為22.19、20.99 mg/100 g,超過20 mg/100 g的限量標準。當殼聚糖的質(zhì)量分數(shù)大于0.5%后,4組試驗組(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)樣品的TVB-N值之間無明顯差異(P>0.05),但均顯著低于空白組和0.5%殼聚糖涂膜組(P<0.05),且均低于水產(chǎn)品衛(wèi)生限量標準。因此,確定殼聚糖的質(zhì)量分數(shù)為1.0%進行后續(xù)正交優(yōu)化試驗。
2.2.2 卡拉膠質(zhì)量分數(shù)的確定
不同質(zhì)量分數(shù)的卡拉膠對青蝦TVB-N值的影響見圖4。
圖4 不同質(zhì)量分數(shù)的卡拉膠對青蝦TVB-N值的影響Fig.4 Effect of different concentration of carrageenin on TVB-N value of shrimp
由圖4可知,無添加組(0%)、0.10%卡拉膠組和0.15%卡拉膠組的TVB-N值之間無顯著差異(P>0.05),且均低于20 mg/100 g。當卡拉膠質(zhì)量分數(shù)大于0.15%時,0.20%、0.25%、0.30%卡拉膠涂膜試驗組樣品的TVB-N值無顯著差異(P>0.05),但均顯著低于0%、0.10%和0.15%卡拉膠試驗組(P<0.05)。以往的研究[12-13]表明,卡拉膠能夠與其它食品膠進行復(fù)配,形成協(xié)同增效的作用來提高膜的成膜性能、凝膠強度和對被涂膜材料的黏附性等,進而提高復(fù)配保鮮劑的涂膜保鮮效果,本研究結(jié)果與之相符。因此,單因素試驗確定卡拉膠的質(zhì)量分數(shù)為0.20%進行后續(xù)正交優(yōu)化試驗。
2.2.3 迷迭香提取物質(zhì)量分數(shù)的確定
不同質(zhì)量分數(shù)的迷迭香提取物對青蝦TVB-N值的影響見圖5。
圖5 不同質(zhì)量分數(shù)的迷迭香提取物對青蝦TVB-N值的影響Fig.5 Effect of different concentration of rosemary extract on TVB-N value of shrimp
由圖5可知,當迷迭香提取物質(zhì)量分數(shù)≤0.06%時,4組(0%、0.02%、0.04%、0.06%)樣品間的 TVB-N值沒有顯著差異(P>0.05),當迷迭香提取物質(zhì)量分數(shù)≥0.08%時,0.08%和0.10%迷迭香提取物涂膜試驗組樣品的TVB-N值沒有顯著差異(P>0.05),且均顯著低于其它4組的TVB-N值(P<0.05)。迷迭香提取物富含迷迭香酸、精油和眾多酚類物質(zhì)[14],具有較好的抑菌和抗氧化特性,Ozogul等[15]用4%迷迭香精油納米乳浸泡處理虹鱒魚,虹鱒魚表面嗜冷菌生長被抑制,在2℃下貯藏期達到24 d。Shi等[16]用0.2%迷迭香提取物浸泡伍氏螻蛄蝦10 s~15 s,處理后的伍氏螻蛄蝦在-20℃冷凍條件下可以貯藏24周。本研究結(jié)果也表明復(fù)配天然保鮮劑中迷迭香提取物的添加有助于保鮮劑抗菌性能的提升。因此,單因素試驗確定迷迭香提取物的質(zhì)量分數(shù)為0.08%,進行后續(xù)正交優(yōu)化試驗。
2.2.4 乳酸鏈球菌素質(zhì)量分數(shù)的確定
不同質(zhì)量分數(shù)的乳酸鏈球菌素對青蝦TVB-N值的影響見圖6。
圖6 不同質(zhì)量分數(shù)的乳酸鏈球菌素對青蝦TVB-N值的影響Fig.6 Effect of different concentration of nisin on TVB-N value of shrimp
由圖6可知,0.04%試驗組青蝦樣品的TVB-N值顯著低于無添加組和0.02%試驗組(P<0.05),但乳酸鏈球菌素質(zhì)量分數(shù)≥0.06%時,3組試驗組(0.06%、0.08%、0.10%)青蝦樣品的TVB-N值基本沒有差別(P>0.05),但均顯著低于0.04%處理組的TVB-N值(P<0.05)。乳酸鏈球菌素以其高效抑菌和安全特性被廣泛應(yīng)用于各類食品加工和貯藏中[17-18],本研究中乳酸鏈球菌素質(zhì)量分數(shù)為0.06%時青蝦的TVB-N值低至13.83 mg/100 g,大幅低于其它單因素試驗結(jié)果,也反映出乳酸鏈球菌素對青蝦的高效抑菌保鮮效果。因此,單因素試驗確定乳酸鏈球菌素的質(zhì)量分數(shù)為0.06%,進行后續(xù)正交優(yōu)化試驗。
正交試驗結(jié)果見表2。方差分析結(jié)果見表3。
表2 正交試驗結(jié)果Table 2 The results of orthogonal experiment
表3 正交試驗方差分析Table 3 Variance analysis on the results of orthogonal experiment
分析表2和表3可知,4種天然保鮮劑中,殼聚糖質(zhì)量分數(shù)、卡拉膠質(zhì)量分數(shù)和乳酸鏈球菌素質(zhì)量分數(shù)對青蝦TVB-N值的影響顯著,其中殼聚糖質(zhì)量分數(shù)和乳酸鏈球菌素質(zhì)量分數(shù)影響極顯著(P<0.01)。迷迭香提取物質(zhì)量分數(shù)對青蝦TVB-N值影響不顯著(P>0.05)。各組分對青蝦TVB-N值的影響主次順序為乳酸鏈球菌素質(zhì)量分數(shù)(D)>殼聚糖質(zhì)量分數(shù)(A)>卡拉膠質(zhì)量分數(shù)(B)>迷迭香提取物質(zhì)量分數(shù)(C)。確定各因素較優(yōu)水平分別為k3(A)、k1(B)、k3(C)、k3(D),以TVB-N值為指標得到青蝦復(fù)配天然保鮮劑的最佳配方組合為A3B1C3D3,即殼聚糖質(zhì)量分數(shù)1.25%、卡拉膠質(zhì)量分數(shù)0.175%、迷迭香提取物質(zhì)量分數(shù)0.09%、乳酸鏈球菌素質(zhì)量分數(shù)0.07%。
采用正交試驗優(yōu)化后的最優(yōu)復(fù)配天然保鮮劑配方(殼聚糖質(zhì)量分數(shù)1.25%、卡拉膠質(zhì)量分數(shù)0.175%、迷迭香提取物質(zhì)量分數(shù)0.09%、乳酸鏈球菌素質(zhì)量分數(shù)0.07%)對新鮮青蝦進行涂膜保鮮驗證試驗,4℃冷藏3 d后,涂膜試驗組青蝦的TVB-N值為(11.22±0.81)mg/100 g,均低于所有正交試驗組的TVB-N值,符合一級鮮度(≤15 mg/100 g)標準。因此,可以確定采用該復(fù)配天然保鮮劑能提升青蝦冷藏保鮮效果,所得方案切實可行。
本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上,采用正交試驗對殼聚糖、卡拉膠、迷迭香提取物和乳酸鏈球菌素4種天然保鮮劑的質(zhì)量分數(shù)進行優(yōu)化,確定青蝦復(fù)配天然保鮮劑的最優(yōu)配方為殼聚糖質(zhì)量分數(shù)1.25%、卡拉膠質(zhì)量分數(shù)0.175%、迷迭香提取物質(zhì)量分數(shù)0.09%、乳酸鏈球菌素質(zhì)量分數(shù)0.07%,采用最優(yōu)復(fù)配天然保鮮劑涂膜處理的青蝦在4℃條件下貯藏3 d后,青蝦的 TVB-N 值為(11.22±0.81)mg/100 g,符合一級鮮度(≤15 mg/100 g)標準,青蝦保鮮效果良好,說明采用殼聚糖、卡拉膠、迷迭香提取物和乳酸鏈球菌素4種天然保鮮劑進行復(fù)配對青蝦進行涂膜保鮮處理,能抑制青蝦體內(nèi)腐敗微生物生長,達到延緩青蝦腐敗變質(zhì)的效果。