黃昊，何涓源，賴思婷，嚴(yán)兆蘭，馮艷麗，余翔*

（1.浙江恒通生物科技股份有限公司，浙江 湖州 313014；2.湖北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，食用野生植物保育與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃石 435002）

青蝦（Macrobrachium nipponense）學(xué)名日本沼蝦，其味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者青睞，市場(chǎng)需求量逐年上升[1]，但值得關(guān)注的是，包括青蝦在內(nèi)的蝦類水產(chǎn)品在被捕獲離水后容易死亡，且在后續(xù)加工和冷藏過程中由于微生物增殖、內(nèi)源酶作用和脂質(zhì)氧化等因素的影響，往往會(huì)導(dǎo)致新鮮蝦產(chǎn)品發(fā)生腐敗變質(zhì)現(xiàn)象[2]。雖然已有的冷凍技術(shù)能夠有效地延長(zhǎng)蝦類水產(chǎn)品的保藏期，但冷凍和解凍工序會(huì)對(duì)青蝦色澤、質(zhì)地、風(fēng)味以及持水力等感官品質(zhì)造成不可逆的負(fù)面影響，極大地影響青蝦的質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)性[3-4]。隨著消費(fèi)者對(duì)低溫肉制品接受度的與日俱增和我國(guó)冷鏈技術(shù)的完善，如何提升新鮮青蝦的冷藏貨架期成為行業(yè)關(guān)注的熱點(diǎn)，眾多學(xué)者對(duì)之開展了大量研究，其中天然保鮮劑技術(shù)以其高效、安全、低成本和易實(shí)施的特點(diǎn)而備受關(guān)注。

近年來，隨著天然保鮮劑研究的深入，各種具有抑菌保鮮作用的天然物質(zhì)正在被逐步開發(fā)應(yīng)用于水產(chǎn)品保鮮中，取得了較好的冷藏保鮮效果。但研究同時(shí)也表明，使用單一天然保鮮劑進(jìn)行食品保鮮時(shí)，往往會(huì)出現(xiàn)保鮮劑用量過大且保鮮效果有限的現(xiàn)象，根據(jù)柵欄技術(shù)的原理，將不同的天然保鮮劑進(jìn)行復(fù)配，可發(fā)揮其協(xié)同效應(yīng)使保鮮效果大幅提升[5]。于淑池等[6]將殼聚糖、ε-聚賴氨酸鹽酸鹽和茶多酚進(jìn)行復(fù)配，對(duì)金鯧魚進(jìn)行冷藏保鮮，結(jié)果表明使用復(fù)配保鮮劑處理的金鯧魚樣品的一級(jí)鮮度和貨架期均延長(zhǎng)4 d，保鮮效果優(yōu)于單獨(dú)使用殼聚糖的對(duì)照組。Na等[7]研究表明，相比單一組分涂膜，殼聚糖和賴氨酸復(fù)配涂膜對(duì)南美青蝦肌肉內(nèi)以假單胞菌為代表的嗜溫菌和以硫化氫產(chǎn)生菌為代表的嗜冷菌生長(zhǎng)有顯著抑制作用（P＜0.05）。趙海鵬[8]對(duì)殼聚糖、茶多酚和乳酸鏈球菌素的復(fù)配抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，該復(fù)配保鮮劑能使菌體變形，在菌體表面形成泡狀結(jié)構(gòu)，破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，抑菌效果顯著。因此，本研究擬將殼聚糖、卡拉膠、迷迭香提取物和乳酸鏈球菌素4種天然保鮮劑通過正交試驗(yàn)進(jìn)行配方優(yōu)化，開發(fā)出復(fù)配天然保鮮劑應(yīng)用于青蝦冷藏保鮮。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青蝦：浙江恒通生物科技股份有限公司養(yǎng)殖基地，捕撈后以鮮活狀態(tài)運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)樣品保鮮處理；胡蘿卜：市售。

殼聚糖（脫乙酰度≥90%）、迷迭香提取物、卡拉膠、乳酸鏈球菌素（均為食品級(jí)）：河南圣斯得實(shí)業(yè)有限公司；硼酸、氧化鎂、硫酸、氫氧化鈉（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動(dòng)凱氏定氮儀（K9860）：山東海能科學(xué)儀器有限公司；生物潔凈工作臺(tái)（BCM-1300A）：蘇凈集團(tuán)安泰公司；電子天平（CP114）：美國(guó)奧豪斯儀器（上海）有限公司；pH計(jì)（PHS-3C）：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 復(fù)配保鮮劑的配制及樣品處理方法

分別稱取一定質(zhì)量的殼聚糖粉末，用1%醋酸溶液溶解制成殼聚糖溶液，再將迷迭香提取物、卡拉膠和乳酸鏈球菌素分別按比例稱取并溶解至殼聚糖溶液中，攪拌均勻制成復(fù)配保鮮劑，置于4℃貯藏備用。將新鮮青蝦洗凈、瀝干，按料液比1∶2（g/mL）浸沒至復(fù)配保鮮劑中10 min，撈出置于4℃環(huán)境瀝干30 min后，分組裝入保鮮袋中置于4℃進(jìn)行冷藏。

1.3.2 殼聚糖成膜濃度考察

在復(fù)配天然保鮮劑中，殼聚糖是重要的成膜材料，其成膜性好壞直接決定青蝦的保鮮效果，因此，確定殼聚糖的成膜濃度至關(guān)重要。分別配制濃度為0.75%、1.00%、1.25%、1.50%、1.75%的殼聚糖溶液，分別將其涂在胡蘿卜塊表面，制備成裝片置于低倍鏡下（100倍）進(jìn)行成膜性觀察。然后分別取10 mL殼聚糖溶液均勻涂布在載玻片表面，50℃烘干30 min后觀察殼聚糖在載玻片表面的成膜連續(xù)性。以蒸餾水為空白對(duì)照（CK）。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因素試驗(yàn)，考察殼聚糖、卡拉膠、迷迭香提取物和乳酸鏈球菌素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)涂膜處理后的青蝦在4℃冷藏3 d后保鮮效果的影響。設(shè)定復(fù)配天然保鮮劑基礎(chǔ)配方為殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%，卡拉膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.20%，迷迭香提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.06%，乳酸鏈球菌素質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.06%，考察殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、卡拉膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%）、迷迭香提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%）和乳酸鏈球菌素質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%）對(duì)青蝦冷藏保鮮效果的影響。

1.3.4 復(fù)配天然保鮮劑優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以殼聚糖、卡拉膠、迷迭香提取物和乳酸鏈球菌素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，以貯藏3d后青蝦的揮發(fā)性鹽基氮（total volatilebasicnitrogen，TVB-N）值為參考指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)配天然保鮮劑配方。因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3.5 揮發(fā)性鹽基氮值

參照GB 5009.228—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》，采用凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定，平行測(cè)定3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件的one-way ANOVA程序進(jìn)行方差分析，采用Duncan氏多重比較檢驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖成膜濃度的確定

青蝦體內(nèi)富含大量多酚氧化酶類，在保鮮貯藏過程中如不充分隔絕氧氣，青蝦極易發(fā)生由于酚類氧化而導(dǎo)致的褐變現(xiàn)象，造成青蝦貯藏品質(zhì)的下降[9]。因此，在青蝦冷藏保鮮過程中不僅要考慮殼聚糖對(duì)青蝦體內(nèi)腐敗微生物的抑菌效果，而且更要關(guān)注殼聚糖在青蝦表面成膜的效果。

不同濃度（0.75%、1.00%、1.25%、1.50%、1.75%）殼聚糖溶液涂膜胡蘿卜的顯微觀察結(jié)果見圖1，成膜效果見圖2。

圖1 不同濃度殼聚糖成膜顯微觀察圖（100×）Fig.1 The microscope photo of chitosan film with different concentration（100×）

圖2 不同濃度殼聚糖成膜效果Fig.2 Theperformanceofchitosanfilmwithdifferentconcentration

圖1中，殼聚糖濃度低于1.00%時(shí)，其在胡蘿卜表面形成的膜不連續(xù)且各部位薄厚不一，成膜性較差，而殼聚糖濃度≥1.00%以上時(shí)，開始在胡蘿卜表面形成連續(xù)且薄厚均一的膜，隨著殼聚糖濃度的逐步增大，膜的厚度隨之增加。同樣，當(dāng)殼聚糖濃度≥1.00%時(shí)，在玻璃載玻片上涂膜形成的殼聚糖膜連續(xù)且厚薄均一（圖2），無(wú)空缺現(xiàn)象。因此，可確定殼聚糖成膜濃度為1.00%。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的殼聚糖對(duì)青蝦TVB-N值的影響見圖3。

圖3 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的殼聚糖對(duì)青蝦TVB-N值的影響Fig.3 Effect of different concentration of chitosan on TVB-N value of shrimp

揮發(fā)性鹽基氮是動(dòng)物源食品原料貯藏和加工過程中，由于體內(nèi)內(nèi)源酶和外界微生物的共同作用導(dǎo)致肌肉蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生氨及低級(jí)別胺類化合物，其含量高低是評(píng)判動(dòng)物源食品保鮮效果的重要參數(shù)[10]。GB 2733—2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品》[11]規(guī)定淡水魚蝦TVB-N≤20 mg/100 g。經(jīng)過涂膜處理的青蝦4℃冷藏3 d后，無(wú)添加組（0%）和0.5%殼聚糖涂膜組青蝦樣品的TVB-N值分別為22.19、20.99 mg/100 g，超過20 mg/100 g的限量標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)殼聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.5%后，4組試驗(yàn)組（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）樣品的TVB-N值之間無(wú)明顯差異（P＞0.05），但均顯著低于空白組和0.5%殼聚糖涂膜組（P＜0.05），且均低于水產(chǎn)品衛(wèi)生限量標(biāo)準(zhǔn)。因此，確定殼聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%進(jìn)行后續(xù)正交優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.2 卡拉膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的卡拉膠對(duì)青蝦TVB-N值的影響見圖4。

圖4 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的卡拉膠對(duì)青蝦TVB-N值的影響Fig.4 Effect of different concentration of carrageenin on TVB-N value of shrimp

由圖4可知，無(wú)添加組（0%）、0.10%卡拉膠組和0.15%卡拉膠組的TVB-N值之間無(wú)顯著差異（P＞0.05），且均低于20 mg/100 g。當(dāng)卡拉膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.15%時(shí)，0.20%、0.25%、0.30%卡拉膠涂膜試驗(yàn)組樣品的TVB-N值無(wú)顯著差異（P＞0.05），但均顯著低于0%、0.10%和0.15%卡拉膠試驗(yàn)組（P＜0.05）。以往的研究[12-13]表明，卡拉膠能夠與其它食品膠進(jìn)行復(fù)配，形成協(xié)同增效的作用來提高膜的成膜性能、凝膠強(qiáng)度和對(duì)被涂膜材料的黏附性等，進(jìn)而提高復(fù)配保鮮劑的涂膜保鮮效果，本研究結(jié)果與之相符。因此，單因素試驗(yàn)確定卡拉膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.20%進(jìn)行后續(xù)正交優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.3 迷迭香提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的迷迭香提取物對(duì)青蝦TVB-N值的影響見圖5。

圖5 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的迷迭香提取物對(duì)青蝦TVB-N值的影響Fig.5 Effect of different concentration of rosemary extract on TVB-N value of shrimp

由圖5可知，當(dāng)迷迭香提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)≤0.06%時(shí)，4組（0%、0.02%、0.04%、0.06%）樣品間的 TVB-N值沒有顯著差異（P＞0.05），當(dāng)迷迭香提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥0.08%時(shí)，0.08%和0.10%迷迭香提取物涂膜試驗(yàn)組樣品的TVB-N值沒有顯著差異（P＞0.05），且均顯著低于其它4組的TVB-N值（P＜0.05）。迷迭香提取物富含迷迭香酸、精油和眾多酚類物質(zhì)[14]，具有較好的抑菌和抗氧化特性，Ozogul等[15]用4%迷迭香精油納米乳浸泡處理虹鱒魚，虹鱒魚表面嗜冷菌生長(zhǎng)被抑制，在2℃下貯藏期達(dá)到24 d。Shi等[16]用0.2%迷迭香提取物浸泡伍氏螻蛄蝦10 s～15 s，處理后的伍氏螻蛄蝦在-20℃冷凍條件下可以貯藏24周。本研究結(jié)果也表明復(fù)配天然保鮮劑中迷迭香提取物的添加有助于保鮮劑抗菌性能的提升。因此，單因素試驗(yàn)確定迷迭香提取物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.08%，進(jìn)行后續(xù)正交優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.4 乳酸鏈球菌素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乳酸鏈球菌素對(duì)青蝦TVB-N值的影響見圖6。

圖6 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乳酸鏈球菌素對(duì)青蝦TVB-N值的影響Fig.6 Effect of different concentration of nisin on TVB-N value of shrimp

由圖6可知，0.04%試驗(yàn)組青蝦樣品的TVB-N值顯著低于無(wú)添加組和0.02%試驗(yàn)組（P＜0.05），但乳酸鏈球菌素質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥0.06%時(shí)，3組試驗(yàn)組（0.06%、0.08%、0.10%）青蝦樣品的TVB-N值基本沒有差別（P＞0.05），但均顯著低于0.04%處理組的TVB-N值（P＜0.05）。乳酸鏈球菌素以其高效抑菌和安全特性被廣泛應(yīng)用于各類食品加工和貯藏中[17-18]，本研究中乳酸鏈球菌素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.06%時(shí)青蝦的TVB-N值低至13.83 mg/100 g，大幅低于其它單因素試驗(yàn)結(jié)果，也反映出乳酸鏈球菌素對(duì)青蝦的高效抑菌保鮮效果。因此，單因素試驗(yàn)確定乳酸鏈球菌素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.06%，進(jìn)行后續(xù)正交優(yōu)化試驗(yàn)。

2.3 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。方差分析結(jié)果見表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal experiment

表3 正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis on the results of orthogonal experiment

分析表2和表3可知，4種天然保鮮劑中，殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、卡拉膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)和乳酸鏈球菌素質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)青蝦TVB-N值的影響顯著，其中殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和乳酸鏈球菌素質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響極顯著（P＜0.01）。迷迭香提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)青蝦TVB-N值影響不顯著（P＞0.05）。各組分對(duì)青蝦TVB-N值的影響主次順序?yàn)槿樗徭溓蚓刭|(zhì)量分?jǐn)?shù)（D）＞殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）＞卡拉膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）＞迷迭香提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C）。確定各因素較優(yōu)水平分別為k3（A）、k1（B）、k3（C）、k3（D），以TVB-N值為指標(biāo)得到青蝦復(fù)配天然保鮮劑的最佳配方組合為A3B1C3D3，即殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.25%、卡拉膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.175%、迷迭香提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.09%、乳酸鏈球菌素質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.07%。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

采用正交試驗(yàn)優(yōu)化后的最優(yōu)復(fù)配天然保鮮劑配方（殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.25%、卡拉膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.175%、迷迭香提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.09%、乳酸鏈球菌素質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.07%）對(duì)新鮮青蝦進(jìn)行涂膜保鮮驗(yàn)證試驗(yàn)，4℃冷藏3 d后，涂膜試驗(yàn)組青蝦的TVB-N值為（11.22±0.81）mg/100 g，均低于所有正交試驗(yàn)組的TVB-N值，符合一級(jí)鮮度（≤15 mg/100 g）標(biāo)準(zhǔn)。因此，可以確定采用該復(fù)配天然保鮮劑能提升青蝦冷藏保鮮效果，所得方案切實(shí)可行。

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對(duì)殼聚糖、卡拉膠、迷迭香提取物和乳酸鏈球菌素4種天然保鮮劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定青蝦復(fù)配天然保鮮劑的最優(yōu)配方為殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.25%、卡拉膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.175%、迷迭香提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.09%、乳酸鏈球菌素質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.07%，采用最優(yōu)復(fù)配天然保鮮劑涂膜處理的青蝦在4℃條件下貯藏3 d后，青蝦的 TVB-N 值為（11.22±0.81）mg/100 g，符合一級(jí)鮮度（≤15 mg/100 g）標(biāo)準(zhǔn)，青蝦保鮮效果良好，說明采用殼聚糖、卡拉膠、迷迭香提取物和乳酸鏈球菌素4種天然保鮮劑進(jìn)行復(fù)配對(duì)青蝦進(jìn)行涂膜保鮮處理，能抑制青蝦體內(nèi)腐敗微生物生長(zhǎng)，達(dá)到延緩青蝦腐敗變質(zhì)的效果。