呂萍

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林 吉林 132101）

紫蘇（Perilla frutescens L.Britt.）又名桂荏、赤蘇、香蘇等，屬唇形科一年生草本植物，原產(chǎn)于東亞地區(qū)[1-4]，因其顯著的經(jīng)濟(jì)效益，現(xiàn)歐美一些國(guó)家也有大面積商業(yè)種植，中國(guó)是紫蘇栽種面積和年出口量較大的國(guó)家[5]。北方以油用為主，兼以藥用；南方以藥用為主，兼作香料和食用[6]。紫蘇葉、莖和果實(shí)均能入藥，在醫(yī)藥領(lǐng)域有重要價(jià)值，紫蘇是衛(wèi)生部第一批規(guī)定的既是藥品又是食品的60種作物之一[7]，其中紫蘇葉（Folium Perillae）常用入藥，始記于《名醫(yī)別錄》，稱其“主下氣，除寒中。”《本草匯言》提到紫蘇“散寒氣，清肺氣，寬中氣，安胎氣，下結(jié)氣，化痰[8-12]?！弊咸K葉有多種生物活性成分，主要有黃酮類、揮發(fā)油類、酚酸類、花色苷類、多糖類、三萜類、甾體類化合物等，其中黃酮類化合物具有增強(qiáng)免疫力、抗癌、抗氧化、抗炎、降血糖等生理功能[13-16]。

隨著人們保健意識(shí)的增強(qiáng)，紫蘇葉因其既能作為食材又有生理功效逐漸成為研究熱點(diǎn)。目前對(duì)長(zhǎng)白山紫蘇的研究較少，且較多集中在揮發(fā)油方面，對(duì)其黃酮及免疫活性研究較少。機(jī)體免疫功能分為特異性免疫和非特異性免疫，淋巴細(xì)胞可反映機(jī)體特異性免疫功能的狀態(tài)，而巨噬細(xì)胞的吞噬作用可反映機(jī)體非特異免疫功能的強(qiáng)弱。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛使用小鼠碳粒廓清實(shí)驗(yàn)作為藥物及生理活性物質(zhì)對(duì)非特異性免疫功能影響的檢測(cè)指標(biāo)。因此，本文通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助提取長(zhǎng)白山道地紫蘇黃酮，并采用小鼠碳粒廓清法研究長(zhǎng)白山紫蘇黃酮的非特異性免疫活性，以期為長(zhǎng)白山紫蘇的深加工及綜合利用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

長(zhǎng)白山地區(qū)紫蘇葉：市售，經(jīng)烘干粉碎后備用；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞96.6%）、乙醇、甲醇、正丁醇、濃鹽酸、鋅粉、三氯化鋁、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、印度墨汁、環(huán)磷酰胺（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（KM 小鼠 SPF 級(jí)，18 g～20 g）：遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（遼）2015-0001，動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)前在動(dòng)物房環(huán)境適應(yīng)1周。

毛細(xì)管（100 mm，1.8 mm～2.2 mm）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；電子天平（BEM220.4）：上海卓精電子科技有限公司；多功能粉碎機(jī)（XS-10）：上海兆申科技有限公司；超聲波清洗機(jī)（JL-60DT）：上海杰理科技有限公司；離心機(jī)（H2050R-1）：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；紫外可見分光光度計(jì)（752N）：上海儀器分析有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9223A型）：成都瑞派斯科技有限公司；恒溫水浴鍋（HH-5）：蘇州威爾實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA）：上海亞榮生化儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

長(zhǎng)白山紫蘇鮮葉→除雜→干燥→粉碎→稱重→浸泡→定性分析→超聲波輔助提取→冷卻→離心→定容→定量分析→紫蘇黃酮→非特異性免疫活性分析

1.2.2 原料預(yù)處理

長(zhǎng)白山紫蘇經(jīng)人工除雜、80℃干燥1 h、粉碎等預(yù)處理后，加入一定量乙醇溶液，采用超聲波輔助法浸提紫蘇黃酮。

1.3 長(zhǎng)白山紫蘇黃酮的定性分析

1.3.1 HCl-Zn粉反應(yīng)

取5 mL長(zhǎng)白山紫蘇黃酮提取液，加少許鋅粉振搖，再滴加幾滴濃鹽酸，必要時(shí)加熱顯色，HCl-Zn粉反應(yīng)中顯示淡紅色，說(shuō)明有黃酮的存在[17-18]。

1.3.2 三氯化鋁反應(yīng)

取5 mL樣品的乙醇溶液，加l%三氯化鋁甲醇溶液，呈色。三氯化鋁反應(yīng)中顯示亮黃色，說(shuō)明有黃酮的存在[19-22]。

1.4 長(zhǎng)白山紫蘇黃酮的定量分析

1.4.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液（0.3 mg/mL）1、2、5、8 mL 置于 25 mL容量瓶中，用30%乙醇溶液補(bǔ)充至12.5 mL，加入0.7 mL NaNO2溶液搖勻，放置5 min后加入0.7 mL A（lNO3）3溶液，6 min后再加入5 mL NaOH溶液，用30%乙醇溶液定容。10 min后于波長(zhǎng)510 nm處進(jìn)行比色測(cè)定，以試劑空白做參比。取長(zhǎng)白山紫蘇提取液和對(duì)照品溶液各5 mL按上述方法顯色后在510 nm處測(cè)其吸光度，代入回歸方程計(jì)算得率。

1.4.2 長(zhǎng)白山紫蘇黃酮得率的計(jì)算

長(zhǎng)白山紫蘇黃酮得率的計(jì)算公式如下。

式中：C為提取液中的黃酮濃度，mg/mL；V為提取液的體積，mL；N為上清液稀釋倍數(shù)；M為原料的質(zhì)量，g。

1.5 長(zhǎng)白山紫蘇總黃酮提取的單因素試驗(yàn)

1.5.1 乙醇濃度對(duì)紫蘇黃酮得率的影響

分別準(zhǔn)確稱取紫蘇的烘干樣5 g各5份于錐形瓶中，在超聲功率為 400 W，料液比為 1∶20（g/mL），提取溫度為50℃，乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%下提取30 min。之后在4 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液按1.4.1的方法測(cè)定吸光度，計(jì)算出黃酮的得率，試驗(yàn)做3次重復(fù)，計(jì)算平均值，研究不同乙醇濃度對(duì)紫蘇中黃酮得率的影響[23]。

1.5.2 料液比對(duì)紫蘇黃酮得率的影響

取紫蘇葉的烘干樣5 g各5份于錐形瓶中，在超聲功率為400 W，選取乙醇濃度為70%，提取溫度為50 ℃，料液比 1∶10、1∶20、1∶30，1∶40、1∶50（g/mL）下提取30 min。之后在4 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取其上清液按1.4.1的方法測(cè)定吸光度，計(jì)算出黃酮的得率，試驗(yàn)做3次重復(fù)，計(jì)算平均值，研究不同料液比對(duì)紫蘇中黃酮得率的影響。

1.5.3 提取溫度對(duì)紫蘇黃酮得率的影響

分別準(zhǔn)確稱取紫蘇葉的烘干樣5 g各5份于錐形瓶中，在超聲功率為400 W，選取乙醇濃度為70%，料液比 1∶20（g/mL），提取溫度分別為 30、40、50、60、70 ℃下提取30 min。提取后冷卻至室溫（20℃），在4 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取其上清液按1.4.1的方法測(cè)定吸光度，計(jì)算出黃酮的得率，試驗(yàn)做3次重復(fù)，計(jì)算平均值，研究不同提取溫度對(duì)紫蘇中黃酮得率的影響。

1.5.4 超聲時(shí)間對(duì)紫蘇黃酮得率的影響

分別準(zhǔn)確稱取紫蘇的烘干樣5 g各5份于平底燒瓶中，在超聲功率為400 W，選取乙醇濃度為70%，料液比 1∶20（g/mL），分別于 50 ℃水浴超聲提取 15、20、25、30、35 min，之后在4 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取其上清液按1.4.1的方法測(cè)定吸光度，計(jì)算出黃酮的得率，試驗(yàn)做3次重復(fù)，計(jì)算平均值，研究不同料液比對(duì)紫蘇中黃酮得率的影響。

1.6 長(zhǎng)白山紫蘇黃酮提取的正交試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，針對(duì)影響長(zhǎng)白山紫蘇黃酮提取的4個(gè)因素，即乙醇濃度、料液比、提取溫度和超聲時(shí)間作為考察因子，以長(zhǎng)白山紫蘇黃酮得率為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors level of orthogonal test

1.7 長(zhǎng)白山紫蘇黃酮非特異性免疫活性研究

通過(guò)碳粒廓清實(shí)驗(yàn)測(cè)定長(zhǎng)白山紫蘇黃酮的免疫活性，將75只KM小鼠，6周齡～8周齡，體重18 g～22 g，隨機(jī)分為5組，每組15只。分別為空白組、環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，Cy）模型對(duì)照組、低劑量黃酮組（100 mg/kg）、中劑量黃酮組（200 mg/kg）、高劑量黃酮組（300 mg/kg）。除空白組外，其他各組小鼠根據(jù)體重每天腹腔注射環(huán)磷酰胺（50 mg/kg）連續(xù)4 d，建立小鼠免疫抑制模型。建模后，使用相應(yīng)劑量紫蘇黃酮對(duì)各組小鼠進(jìn)行灌胃，空白組和模型組給予等體積的生理鹽水（0.2 mL/10 g），每天稱重、灌胃1次，于第14天給藥1 h后，對(duì)每只小鼠尾靜脈注射經(jīng)稀釋的印度墨汁（0.1 mL/10 g），待墨汁注入，立即計(jì)時(shí)。2 min（t1）和10 min（t2）后，分別從每只小鼠眼眶靜脈叢取血 40 μL于4mL0.1%的NaHCO3溶液中，用752N紫外分光光度計(jì)在600 nm處測(cè)其吸光度OD值，以0.1%的NaHCO3溶液空白調(diào)零，以計(jì)算碳粒廓清指數(shù)K。然后將小鼠處死，取肝臟、脾臟，用濾紙吸干表面的血液，稱其重量，同時(shí)稱體重、胸腺重和肝脾重，按下列公式計(jì)算胸腺指數(shù)、脾指數(shù)、碳粒廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α[24-25]。

胸腺指數(shù)=胸腺重（mg）/體重（g）；脾指數(shù)=脾臟重（mg）/體重（g）。

式中：K 為碳粒廓清指數(shù)；OD1、OD2分別為 2、10min時(shí)采血的吸光度；t2-t1為兩次采血的時(shí)間差，min。

α=體重（g）/[肝重（g）+脾重（g）]×K1/3

1.8 數(shù)據(jù)分析

文中采用Excel作圖，利用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述和分析，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間均值比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)白山紫蘇黃酮的定性分析

長(zhǎng)白山紫蘇黃酮的定性結(jié)果見圖1。

圖1 長(zhǎng)白山紫蘇黃酮的定性結(jié)果Fig.1 Qualitative results of flavonoids from Changbai Mountain Perilla

如圖1所示，1號(hào)試管為空白對(duì)照，2號(hào)試管為鹽酸-鋅粉法的比色結(jié)果，HCl-Zn粉反應(yīng)顯示淡紅色，說(shuō)明有黃酮的存在，3號(hào)試管為三氯化鋁法的顯色結(jié)果，三氯化鋁反應(yīng)顯示亮黃色，均證明有黃酮存在。

2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Rutin standard curve

由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到回歸方程：y=0.009 0x+0.013 7，R2=0.999 1。

2.3 長(zhǎng)白山紫蘇黃酮提取的單因素試驗(yàn)

2.3.1 乙醇濃度對(duì)紫蘇黃酮得率的影響

乙醇濃度對(duì)紫蘇黃酮得率的影響見圖3。

圖3 乙醇濃度對(duì)長(zhǎng)白山紫蘇黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ethanol solution concentration on flavonoids yield of Changbai Mountain Perilla

由圖3可知，長(zhǎng)白山紫蘇黃酮的得率在乙醇濃度為70%～90%時(shí)較高。當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)，黃酮得率最高，為4.7%，可能是增加乙醇濃度可以提高溶液對(duì)紫蘇物料的滲透性，進(jìn)而提高紫蘇中黃酮得率。乙醇濃度增到90%，黃酮得率略微下降，可能是高濃度乙醇會(huì)使紫蘇細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)發(fā)生變性凝固，進(jìn)而影響黃酮溶出。故選用濃度為70%～90%的乙醇進(jìn)行后續(xù)的優(yōu)化試驗(yàn)。

2.3.2 料液比對(duì)紫蘇黃酮得率的影響

料液比對(duì)長(zhǎng)白山紫蘇黃酮得率的影響見圖4。

圖4 料液比對(duì)長(zhǎng)白山紫蘇黃酮得率的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on the flavonoids yield of Changbai Mountain Perilla

由圖4可知，長(zhǎng)白山紫蘇黃酮得率隨著溶劑用量的增加呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后緩慢降低的趨勢(shì)。料液比1∶20（g/mL）時(shí)黃酮得率最高，為4.9%，料液比達(dá)到1∶50（g/mL）時(shí)，黃酮得率變化較小，可能是隨著溶劑用量的持續(xù)增加，黃酮物質(zhì)的浸出也趨于穩(wěn)定狀態(tài)，考慮到溶劑的增加會(huì)造成資源浪費(fèi)，因此選取料液比1∶20（g/mL）進(jìn)行后續(xù)的優(yōu)化試驗(yàn)。

2.3.3 提取溫度對(duì)紫蘇黃酮得率的影響

提取溫度對(duì)長(zhǎng)白山紫蘇黃酮得率的影響見圖5。

圖5 提取溫度對(duì)長(zhǎng)白山紫蘇黃酮得率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on flavonoids yield of Changbai Mountain Perilla

由圖5可知，長(zhǎng)白山紫蘇葉中黃酮得率隨著提取溫度的升高呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后緩慢上升的趨勢(shì)。隨著溫度的增加，黃酮的得率會(huì)增加，這說(shuō)明溫度越高，黃酮的溶解率越高，但在50℃～70℃范圍內(nèi)變化并不大?？紤]到節(jié)省成本，故選提取溫度50℃左右為宜。

2.3.4 超聲時(shí)間對(duì)紫蘇黃酮得率的影響

超聲時(shí)間對(duì)紫蘇黃酮得率的影響見圖6。

圖6 超聲時(shí)間對(duì)長(zhǎng)白山紫蘇黃酮得率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic time on flavonoids yield in Changbai Mountain Perilla

由圖6可知，長(zhǎng)白山紫蘇葉黃酮在提取時(shí)間為15 min～30 min時(shí)，黃酮的得率隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸上升。可能是隨著超聲時(shí)間的增加，黃酮類物質(zhì)不斷地從物料中溶出，在30 min時(shí)溶出較多，此時(shí)黃酮得率最大。超聲時(shí)間在30 min之后，黃酮得率趨于穩(wěn)定，這可能是紫蘇黃酮已基本被溶出，所以繼續(xù)延長(zhǎng)超聲時(shí)間也不能使得率產(chǎn)生明顯的提高。此外由于長(zhǎng)時(shí)間的超聲波輻射，也會(huì)使一些熱不穩(wěn)定的黃酮變性損失，或者導(dǎo)致溶劑揮發(fā)，從而影響黃酮提取效果，使黃酮得率下降。因此選用30 min左右的超聲時(shí)間進(jìn)行后續(xù)的優(yōu)化試驗(yàn)。

2.4 正交優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，針對(duì)影響長(zhǎng)白山紫蘇黃酮提取的4個(gè)因素，即乙醇濃度、料液比、提取溫度和超聲時(shí)間作為考察因子，以長(zhǎng)白山紫蘇黃酮得率為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3，Duncan檢驗(yàn)分析結(jié)果見表4。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析Table 2 Analysis of orthogonal test results

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

表4 Duncan檢驗(yàn)分析結(jié)果Table 4 The results of Duncan tests

由表3和表4可知，乙醇濃度、料液比、提取溫度、超聲時(shí)間4個(gè)因素均對(duì)長(zhǎng)白山紫蘇黃酮得率有顯著影響，4個(gè)因素對(duì)長(zhǎng)白山紫蘇黃酮得率的影響主次順序：提取溫度＞乙醇濃度＞超聲時(shí)間＞料液比。最優(yōu)的浸提工藝條件是A1B2C2D3，即提取的最佳條件：乙醇濃度70%、料液比 1∶20（g/mL）、提取溫度 50 ℃、超聲時(shí)間35 min，在此條件下長(zhǎng)白山紫蘇黃酮的得率為5.01%。

2.5 長(zhǎng)白山紫蘇黃酮非特異性免疫活性的研究

碳粒廓清實(shí)驗(yàn)是通過(guò)測(cè)定血液中碳粒的消失速度來(lái)反映單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬異物的能力，碳粒廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α越大，表明其體內(nèi)免疫作用越強(qiáng)[25]。長(zhǎng)白山紫蘇黃酮對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響結(jié)果見表5，對(duì)Cy誘導(dǎo)免疫低下模型小鼠胸腺及脾指數(shù)的影響見表6。

表5 長(zhǎng)白山紫蘇黃酮對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響Table 5 Effect of flavonoids from Changbai Mountain Perilla phagocytic function of macrophages in mice

表6 長(zhǎng)白山紫蘇總黃酮對(duì)Cy誘導(dǎo)免疫低下模型小鼠胸腺及脾指數(shù)的影響Table 6 Effect of total flavonoids from Changbai Mountain Perilla on thymus and spleen index of Cy induced immunosuppression mice

由表5可知，模型組動(dòng)物碳粒廓清指數(shù)K及吞噬指數(shù)α明顯低于空白組，表明用此劑量的環(huán)磷酰胺能造成小鼠免疫低下模型，相對(duì)于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組的K值和α值都有提高，并且中、高劑量組呈現(xiàn)了顯著（p＜0.05）或極顯著性差異（p＜0.01），表明中、高劑量的長(zhǎng)白山紫蘇黃酮均能不同程度地提高Cy模型小鼠碳粒廓清指數(shù)K及吞噬指數(shù)α；提示提高長(zhǎng)白山紫蘇黃酮?jiǎng)┝靠稍鰪?qiáng)免疫低下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能，具有促進(jìn)小鼠免疫功能的作用。由表6可知，長(zhǎng)白山紫蘇黃酮對(duì)Cy誘導(dǎo)免疫低下小鼠胸腺指數(shù)及脾指數(shù)的影響，與空白組相比，模型組及各劑量組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均極顯著降低（p＜0.01）。與模型組相比，長(zhǎng)白山紫蘇黃酮高劑量組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均顯著增加（p＜0.05）。模型組小鼠的免疫器官指數(shù)顯著低于空白對(duì)照組，可初步推斷免疫抑制組小鼠在灌服Cy后，胸腺、脾臟生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制，因此免疫器官指數(shù)下降，而導(dǎo)致小鼠免疫能力降低。而長(zhǎng)白山紫蘇黃酮高劑量組胸腺及脾臟指數(shù)與模型組相比顯著增加，表明高劑量組可促進(jìn)小鼠胸腺及脾臟生長(zhǎng)發(fā)育，使免疫器官指數(shù)升高，小鼠免疫能力增強(qiáng)。

3 結(jié)論

通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化得到超聲波輔助乙醇溶液提取長(zhǎng)白山紫蘇黃酮的最佳工藝條件：乙醇濃度70%、料液比 1∶20（g/mL）、提取溫度 50 ℃、超聲時(shí)間 35 min，在此條件下，長(zhǎng)白山紫蘇黃酮的得率為5.01%。且提取溫度對(duì)得率的影響最大，其次為乙醇濃度、超聲時(shí)間，料液比對(duì)其影響較小。此外，通過(guò)小鼠碳粒廓清實(shí)驗(yàn)表明長(zhǎng)白山紫蘇黃酮在適當(dāng)劑量下能不同程度地提高Cy誘導(dǎo)免疫低下小鼠的巨噬細(xì)胞碳粒廓清指數(shù)K及吞噬指數(shù)α，且高劑量組可促進(jìn)小鼠胸腺及脾臟生長(zhǎng)發(fā)育，使免疫器官指數(shù)升高，小鼠免疫能力增強(qiáng)，可增強(qiáng)小鼠的非特異性免疫，對(duì)小鼠體質(zhì)有一定的改善作用，為長(zhǎng)白山紫蘇的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供了理論依據(jù)，綜上，長(zhǎng)白山紫蘇黃酮可以作為一種免疫促進(jìn)劑，增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫，有效地發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，具有一定的研究?jī)r(jià)值和開發(fā)前景。今后有必要對(duì)長(zhǎng)白山紫蘇黃酮的具體成分，以及與免疫活性相關(guān)的成分及其免疫活性機(jī)制進(jìn)行深入研究。