■田立立 劉家鼎 孫龍生* 安振華 楊 陽 劉昊宇 寇祥明 張家宏

（1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.江蘇省里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇揚(yáng)州 225007）

微生態(tài)制劑因具有提高機(jī)體免疫機(jī)能、調(diào)控機(jī)體代謝、有效改善微生態(tài)系統(tǒng)平衡等特性，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用越來越廣泛[1]。鄭玉等[2]研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加乳酸菌可顯著促進(jìn)凡納濱對蝦生長，提高成活率以及對低鹽度的耐受性；在對南美白對蝦的研究中發(fā)現(xiàn)，三丁酸甘油酯可以顯著提高生長性能，減少腸道致病性弧菌數(shù)量[3]。目前關(guān)于乳酸菌和三丁酸甘油酯在小龍蝦（學(xué)名：克氏原螯蝦，Procambarus clarkii）養(yǎng)殖上的應(yīng)用鮮有報(bào)道，尤其是兩者聯(lián)合添加的效果尚不清楚，作用機(jī)制有待探討。本試驗(yàn)通過在飼料中單獨(dú)或同時(shí)添加乳酸菌和三丁酸甘油酯，研究其對克氏原螯蝦生長性能、氨基酸吸收利用及消化生理的影響，為克氏原螯蝦綠色飼料的研制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)蝦購自江蘇省江都區(qū)湯橋家庭農(nóng)場，挑選初始體重（4.39±0.01）g 克氏原螯蝦，用5%鹽水浸泡5 min，放入溫室水泥池暫養(yǎng)7 d后，開始進(jìn)行生長試驗(yàn)。

參照前期試驗(yàn)及相關(guān)文獻(xiàn)[4-5]采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將試驗(yàn)幼蝦320尾隨機(jī)分成4組，在基礎(chǔ)飼料中添加0.2%乳酸菌粉（Ⅱ組，2×109CFU/g）、0.1%三丁酸甘油酯（Ⅲ組，10%）、0.2%乳酸菌粉和0.1%三丁酸甘油酯（Ⅳ組），對照組投喂基礎(chǔ)飼料（Ⅰ組），每組4 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20 尾蝦，分別放養(yǎng)在16 個(gè)250 L 養(yǎng)殖桶中，內(nèi)置孵化草若干作為蝦的隱蔽物。每天于7：30、17：30 投喂2 次，分別投喂當(dāng)天飼料量的40%和60%，表觀飽食投喂，日投飼率為蝦體重的3%左右，每天記錄投喂量與養(yǎng)殖情況。試驗(yàn)用水采用曝氣24 h 以上的自來水，微流水，全程增氧，溶氧濃度維持在5 mg/L 以上。試驗(yàn)期間水溫24～30 ℃，氨氮濃度小于0.01 mg/L，pH 7.2～8.5，試驗(yàn)期42 d。

1.2 試驗(yàn)飼料

以進(jìn)口魚粉、豆粕、菜粕、面粉等為原料配制基礎(chǔ)飼料，原料經(jīng)粉碎、稱重后按照配方要求準(zhǔn)確添加油脂、預(yù)混料及各種添加劑，經(jīng)儀器混勻后，用F26顆粒飼料擠條機(jī)制成直徑為1.5 mm 條狀物后自然風(fēng)干，將風(fēng)干飼料破碎、過篩，保存在-20 ℃冰箱。飼料配方及營養(yǎng)水平見表1。

表1 飼料配方及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)，%）

1.3 樣品采集與指標(biāo)測定

1.3.1 生長性能

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，計(jì)數(shù)，稱重，計(jì)算成活率、增重率、飼料系數(shù)、特定生長率、蛋白質(zhì)效率、肥滿度和肝體指數(shù)。

成活率（%）=試驗(yàn)結(jié)束尾數(shù)（尾）/初始尾數(shù)（尾）×100平均增重（g）=結(jié)束均重（g）-初始均重（g）

增重率（%）=平均增重（g）/初始均重（g）×100

飼料系數(shù)=投餌量（g）/平均增重（g）

特定生長率（%/d）=（ln結(jié)束均重-ln初始均重）/天數(shù)×100

蛋白質(zhì)效率=平均增重（g）/[投飼量（g）×飼料蛋白質(zhì)含量（%）]

肥滿度（g/cm3）=體重（g）/[體長（cm）]3×100

肝體指數(shù)（%）=肝重（g）/體重（g）×100

1.3.2 氨基酸沉積率

每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取3尾蝦肌肉樣，用以氨基酸含量的測定。氨基酸含量的測定采用酸水解結(jié)合高效液相色譜法（Agilent 1220 Infinity LC，德國），氨基酸沉積率的計(jì)算參照伍代勇等[6]的方法：氨基酸沉積率（%）=[（蝦體增重（g）×蝦體肌肉中干物質(zhì)含量（%）×蝦體肌肉中該氨基酸含量（%）]/[飼料消耗量（g）×飼料中干物質(zhì)含量（%）×飼料中該氨基酸含量（%）]×100。

1.3.3 消化酶活性

每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取3尾蝦，分離腸道，液氮速凍。準(zhǔn)確稱取待測組織重量，按重量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例加入9倍組織重量的生理鹽水，并在冰水浴條件下機(jī)械勻漿，離心10 min后取上清液制成10%濃度的組織勻漿，-20 ℃保存?zhèn)溆?。酶活性測定指標(biāo)包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、α-淀粉酶、脂肪酶等，具體測定方法參照南京建成生物工程研究所相關(guān)試劑盒說明書。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel 軟件記錄數(shù)據(jù)，SPSS 16.0進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA）。多重比較采用Duncan’s法，顯著水平設(shè)定為P＜0.05，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中添加乳酸菌和三丁酸甘油酯對克氏原螯蝦生長性能的影響（見表2）

表2 飼料中添加乳酸菌和三丁酸甘油酯對克氏原螯蝦生長性能的影響

各組間克氏原螯蝦初重、飼料系數(shù)、肥滿度、成活率均沒有顯著差異（P＞0.05）；第Ⅱ組蝦末重、增重、增重率、特定生長率顯著高于其他組（P＜0.05），蛋白質(zhì)效率第Ⅱ組最高，其次是第Ⅰ組，且顯著高于其他兩組（P＜0.05）；肝體指數(shù)以第Ⅱ組最高，Ⅲ組和Ⅳ組肝體指數(shù)顯著低于對照組（P＜0.05）。

2.2 飼料中添加乳酸菌和三丁酸甘油酯對克氏原螯蝦肌肉氨基酸沉積率的影響（見表3）

由表3可知，克氏原螯蝦對氨基酸的沉積率總體不高，不同氨基酸間存在較大差異。Ⅰ、Ⅳ組天冬氨酸沉積率均為最高，谷氨酸次之，精氨酸居第三；Ⅱ組天冬氨酸沉積率最高，其次為甲硫氨酸；Ⅲ組則是天冬氨酸沉積率最高，甲硫氨酸居第二，谷氨酸為第三。Ⅱ、Ⅲ兩組天冬氨酸沉積率顯著高于其他兩組（P＜0.05）；Ⅱ組組氨酸沉積率顯著高于其他三組（P＜0.05），Ⅲ、Ⅳ組間無顯著差異（P＞0.05）；除這二種氨基酸外，其余所有氨基酸、總氨基酸、必需氨基酸、非必需氨基酸的沉積率Ⅱ組最高，且顯著高于其他各組(P＜0.05)，而其他三組均無顯著差異（P＞0.05）。

表3 飼料中添加乳酸菌和三丁酸甘油酯對克氏原螯蝦肌肉氨基酸沉積率的影響（%）

2.3 飼料中添加乳酸菌和三丁酸甘油酯對克氏原螯蝦腸道消化酶活性的影響（見表4）

由表4 可知，Ⅱ組各消化酶活性均為最高，且顯著高于其他三組（P＜0.05）；與對照組相比，Ⅲ、Ⅳ組胃蛋白酶、α-淀粉酶活性沒有顯著差異（P＞0.05）；Ⅰ組胰蛋白酶活性顯著低于其他三組（P＜0.05）；Ⅰ、Ⅲ組脂肪酶活性均顯著低于Ⅳ組（P＜0.05）。

表4 飼料中添加乳酸菌和三丁酸甘油酯對克氏原螯蝦腸道消化酶活性的影響

3 討論

3.1 飼料中添加乳酸菌和三丁酸甘油酯對克氏原螯蝦生長性能及氨基酸沉積率的影響

三丁酸甘油酯分解釋放丁酸，可維持腸道完整性，促進(jìn)消化酶的分泌，抑制腸道有害菌，促進(jìn)腸道消化吸收，進(jìn)而提高動(dòng)物生產(chǎn)性能[7]。唐啟峰等[3]研究發(fā)現(xiàn)，三丁酸甘油酯可顯著提高南美白對蝦的蛋白質(zhì)效率，降低餌料系數(shù)，具有明顯的促生長作用。蛋白質(zhì)效率表示機(jī)體轉(zhuǎn)化攝入蛋白的程度，肝體指數(shù)一定程度上反映蝦蟹營養(yǎng)物質(zhì)的儲存情況[8]。本試驗(yàn)中，在飼料中添加0.1%三丁酸甘油酯，試驗(yàn)蝦蛋白質(zhì)效率和肝體指數(shù)與對照組相比顯著降低。三丁酸甘油酯過量可能會導(dǎo)致腸道pH過低，損傷腸道微生態(tài)系統(tǒng)，減少營養(yǎng)物質(zhì)的吸收儲存，從而抑制其生長[9]。同一種酸化劑根據(jù)養(yǎng)殖對象的不同，發(fā)生效應(yīng)的添加水平也有所差異，例如0.20%水平的三丁酸甘油酯可提高斷奶仔豬生長性能和飼糧養(yǎng)分消化率[10]，而東方鲀添加0.1%三丁酸甘油酯時(shí)生長性能達(dá)到最高[11]。有關(guān)克氏原螯蝦對三丁酸甘油酯的適宜添加量還有待進(jìn)一步研究。

乳酸菌可將部分蛋白質(zhì)大分子降解為小分子肽和游離氨基酸[12]，并能產(chǎn)生乙酸、乳酸和促生長因子，同時(shí)通過產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)抑制有害菌的增殖[13]，促進(jìn)機(jī)體腸道消化吸化。Dash等[14]以初始質(zhì)量為0.53 g的羅氏沼蝦為研究對象，結(jié)果表明植物乳桿菌試驗(yàn)組生長性能顯著優(yōu)于對照組。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼料中單獨(dú)添加乳酸菌能提高克氏原螯蝦的生長性能和飼料利用率，這與鄭曉婷等[5]的研究結(jié)果相似，乳酸菌及代謝產(chǎn)物進(jìn)入蝦的消化道輔助消化，進(jìn)而促進(jìn)蝦的生長[15]。

水產(chǎn)動(dòng)物的生長主要是機(jī)體蛋白質(zhì)積累的過程，蛋白質(zhì)的積累又是通過氨基酸的合成來實(shí)現(xiàn)的[16]。氨基酸還具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)、促進(jìn)小腸和骨骼肌的生長以及減少脂肪沉積等功能[17]。石澤[18]發(fā)現(xiàn)在建鯉飼料中添加丁酸鈉對營養(yǎng)物質(zhì)沉積率沒有顯著影響，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果相符。在一定程度上，氨基酸沉積率可以反映飼料質(zhì)量，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的功能性氨基酸可以形成氨基酸代謝指數(shù)的相對穩(wěn)定[19]。乳酸菌添加組十七種肌肉氨基酸沉積率均顯著高于對照組，這表明乳酸菌可以優(yōu)化飼料氨基酸組成，提高飼料氨基酸的轉(zhuǎn)化效率和沉積率。谷氨酸可轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺，反向調(diào)控蛋白質(zhì)代謝，提高攝食率和生長速度[20]，亮氨酸、賴氨酸、纈氨酸等必需氨基酸參與合成機(jī)體蛋白，可促進(jìn)蝦類蛻殼[21]，從而促進(jìn)生長。

3.2 飼料中添加乳酸菌和三丁酸甘油酯對克氏原螯蝦消化酶活性的影響

動(dòng)物生長與飼料利用率密切相關(guān)，而飼料利用率受到消化吸收能力的影響，消化能力又與腸道消化酶活性密切相關(guān)[22]。消化酶可加快胃腸對相應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)的分解利用速度，提高飼料利用率[23]，進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體的生長。李雅敏等[24]研究認(rèn)為，三丁酸甘油酯作為酸化劑，可有效提高草魚腸道淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加0.1%三丁酸甘油酯對克氏原螯蝦胃蛋白酶、α-淀粉酶及脂肪酶活性影響不大，而胰蛋白酶活性顯著提高。三丁酸甘油酯水解產(chǎn)物丁酸可以刺激結(jié)腸內(nèi)水和鈉離子的吸收，促進(jìn)黏膜修復(fù)酶的活性[25]。

飼料營養(yǎng)水平可通過影響腸道形態(tài)發(fā)育和消化酶活性進(jìn)而影響生長性能[26]?；旌先樗峋苿┑奶砑涌捎行p少氨態(tài)氮的產(chǎn)生，抑制飼料中霉菌等有害細(xì)菌的繁殖，促進(jìn)飼料中有機(jī)酸的生成，更好地保留飼料營養(yǎng)物質(zhì)[27-28]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加乳酸菌能顯著提高克氏原螯蝦腸道消化酶活性，這與沙玉杰等[29]乳酸菌可以顯著提高凡納濱對蝦腸道消化酶活性的研究結(jié)果一致。乳酸菌對消化道中物理、化學(xué)因素有較強(qiáng)的耐受性，同時(shí)代謝產(chǎn)生短鏈脂肪酸，降低腸道內(nèi)容物pH，刺激增強(qiáng)消化器官分泌消化酶，抑或激活胃蛋白酶原，直接或間接刺激消化酶的分泌[30]。乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物乳酸在有氧的情況下可進(jìn)入三羧酸循環(huán)氧化供能，進(jìn)而增加腸道內(nèi)消化酶活性[31]。

3.3 乳酸菌和三丁酸甘油酯的相互作用

本試驗(yàn)中各組成活率普遍較低，這可能與試驗(yàn)空間狹小導(dǎo)致密度過大有關(guān)。與單獨(dú)添加三丁酸甘油酯組相比，混合添加乳酸菌后，增重率、腸道胃蛋白酶、胰蛋白酶及脂肪酶活性有所提高，但依然遠(yuǎn)小于乳酸菌單獨(dú)添加組。同樣地，同時(shí)添加乳酸菌和三丁酸甘油酯組生長性能與肌肉氨基酸沉積率沒有顯著提升。三丁酸甘油酯水解通過氫離子沉積降低消化道的pH[32]，乳酸菌分解產(chǎn)生乳酸，故乳酸菌與三丁酸甘油酯可能對腸道pH的降低起協(xié)同作用。乳酸菌最適生長的pH 為5.4 以上，腸道環(huán)境過酸，由此導(dǎo)致包括乳酸菌在內(nèi)的有益菌生長生存受阻。此外，乳酸菌添加組的成活率略低于三丁酸甘油酯組與混合添加組，這可能是增重率略高的原因之一。

4 結(jié)論

飼料中添加乳酸菌可顯著提高克氏原螯蝦生長性能，促進(jìn)飼料氨基酸在蝦體內(nèi)的沉積，單獨(dú)添加三丁酸甘油酯或混合添加乳酸菌及三丁酸甘油酯未見有明顯的促生長效應(yīng)。乳酸菌或三丁酸甘油酯影響克氏原螯蝦腸道消化酶活性，單獨(dú)添加乳酸菌時(shí)效果最佳。有關(guān)克氏原螯蝦乳酸菌及三丁酸甘油酯的適宜添加量還有待進(jìn)一步研究。